急、慢性病毒性心肌炎小鼠辅助T淋巴细胞亚群动态观察及药物干预的影响
作者：陈曙霞 徐欣晖 张冬青
单位：陈曙霞(上海第二医科大学附属仁济医院心内科 上海，200001)；徐欣晖(上海第二医科大学附属仁济医院心内科 上海，200001)；张冬青(上海第二医科大学免疫学教研室)
关键词：柯萨奇病毒B组；T淋巴细胞，辅助诱导；抗柯注射液；病毒性心肌炎
临床心血管病杂志000311 摘要 目的：观察BALB/c小鼠在感染柯萨奇病毒后辅助T淋巴(Th)细胞——Th1、Th2细胞的动态变化以及抗柯注射液(RSF)的干预治疗对其影响。方法：将156只BALB/c小鼠分别制备成急性心肌炎、慢性心肌炎模型，各模型随机分为正常组、病毒对照组和RSF治疗组，用ELISA法检测各组小鼠Th1、Th2类细胞因子。结果：在急性心肌炎模型中，病毒对照组在感染后第3天Th1达到高峰，后逐渐下降，到第12天仍高于正常，而Th2基本于正常范围；RSF治疗组除第3天外，Th1均下降，Th2则表现为有明显的触发效应。慢性心肌炎模型中，各组Th1与Th2类细胞因子均增高。结论：在急、慢性心肌炎中，Th1类细胞在病程中起着主导地位，Th2类细胞则有利于疾病的改善。RSFA对coxB3m心肌炎有显著的治疗作用，其作用机制可能是通过对Th亚群的调节来实现——即抑制Th1细胞，增高Th2细胞的表达来进行免疫调节。
, 百拇医药
Analysis of Th1/Th2 cells and the immunoregulatory effects
of RSF on mice infected by coxB3m virus
CHEN Shu-xia1 XU Xin-hui1 ZHANG Dong-qing2
(1 Department of Cardiology,Renji Hospital Shanghai
Second Medical University,Shanghai 200001;
2 Department of Immunology,Shanghai Second Medical University)
, 百拇医药
Abstract Objective:Study about the regulatory mechanism of the characteristic cytokine products of Th1 and Th2 cells and the expressions of Th1,Th2 cell intervened by Radix sophora flavescens (RSF).Method:To prepare the acute and chronic myocarditis of the murine model (156 cases).They were divided into 3 groups at random,such as CVB3m infectious group,RSF therapeutic group and control group.The characteristic cytokines (IL-2 and IL-10) of the subsets were detected by ELISA kits (pharmingen co).Result:Th1-like cytokine IL-2 was mostly expressed in the acute myocarditis,it was elevated maximal on day 3,and subsequently decreased,still higher than normal on day 12.The Th2-like cytokine IL-10 was in normal range all along.In the chronic myocarditis model,the expression of cytokines was enhanced in both Th1 and Th2-like cells.Conclusion:The immunophysiologic responses in acute and chronic myocarditis be mainly induced by Th1 cells,and Th2 cells help inhibit inflammation,RSF has therapeutic roles in CoxB3m myocarditis by regulating T help cells subsets level it facilated in inhibiting Th1 cells and enhancing the expressions of Th2 cells.
, 百拇医药
Key words Coxsackie B viruses T-Lymphocytes,helper-inducer Radix sophora flavescens Viral myocarditis
1986年，Mosmann等〔1〕首先观察到小鼠CD+4T辅助(Th)细胞具有两种功能不同的亚群，即Th1和Th2；后来大量研究证实在人类也存在着这两类细胞。目前认为，免疫系统针对不同类型的感染能引起不同的免疫效应，而特定的免疫应答及其效应主要由Th亚群来调节。病毒性心肌炎(VM)是临床常见疾病，至今缺乏有效治疗措施。为揭示其发病机制，更好的控制该病及逆转疾病转归提供理论依据，本文对BALB/c小鼠VM模型的Th亚群调节情况进行研究。
1 材料与方法
1.1 材料
, 百拇医药
病毒：嗜心肌柯萨奇病毒(coxB3m)由上海第二医科大学微生物教研室提供。病毒原液-80℃保存。动物：BALB/c纯种雄性小鼠，8周龄，体重18～20g。构自中英合资上海西普尔-必凯实验动物有限公司。抗柯注射液(RSF)：由上海第二医科大学附属仁济医院提供。
1.2 动物模型的制备
急性心肌炎BALB/c小鼠100只随机分为3组：正常组：10只，腹腔注射生理盐水0.1 ml，2次/d；病毒对照组：45只，腹腔注射10-6TCID50/ml CVB3稀释液0.1 ml；RSF治疗组：45只，腹腔注射病毒液后(量同病毒对照组)，再以RSF稀释液(20 mg.kg-1.d-1)腹腔注射，0.1 ml/次，2次/d，共用药12 d。上述小鼠分别于第3、5、8、12天，随机取6只处死。
, 百拇医药
慢性心肌炎BALB/c小鼠56只，随机分为两组：病毒组：50只，一次腹腔注射0.1 ml10-8TCID50的coxB3m病毒；正常组6只，腹腔注射0.1 ml生理盐水。病毒组在接种后每2周分别于腹腔注射0.05 ml 10-8TCID50的coxB3m病毒，共4次；以后每4周腹腔注射0.1 ml10-8TCID50的coxB3m病毒，亦为4次。分别于感染后第30天、第60天、第90天、第180天随机取部分小鼠处死。其中取感染后180 d小鼠12只，随机分为2组，即病毒对照组及RSF治疗组。RSF治疗组用RSF稀释液0.1 ml(以20 mg.kg-1.d-1剂量)，分2次/d腹腔注射，共治疗2周；病毒对照组每天以生理盐水0.1 ml腹腔注射，2次/d，亦为2周。
, http://www.100md.com 组织病理检查：取心脏用10%甲醛固定，石蜡切片，H-E及V-G染色。倒置显微镜(Olympus产品)下观察结果。炎症浸润灶1～5个/切面为+，6～10个/切面为++，>10个/切面为+++。坏死灶单个细胞坏死为主为+，条索、小片状坏死为++，大片状坏死为+++。
1.3 小鼠脾细胞诱导上清液的制备
无菌取脾，置适量无菌Hanks液的小平皿中。
将脾脏在不锈钢筛网上轻轻摩擦，制成单个细胞悬液，移入带盖的无菌试管中，用Hanks液洗3次，每次离心(1 000r/min)10 min。
每试管加入2～3 ml淋巴细胞分离液(1.088比重)，将脾单个核细胞悬液3 ml轻轻铺于分离液上面，离心(2 000r/min)20 min。吸出淋巴细胞层，用Hanks洗3次，每次离心(1 000r/min)10 min。在显微镜下计数细胞，用10%FCS1640(Gibco公司产品)培养液调整细胞数为2×106/ml。
, 百拇医药
将2×106/ml细胞浓度的单个核细胞加入96孔培养板(Costar产品)上，每孔100 μl；同时加入conA(Doko公司产品)为10 μg/孔。
将培养板置于37℃，5%二氧化碳培养箱(Heraeus产品)中孵育72 h，收集细胞悬液，离心(1 000 r/min)5 min，分别收集上清液与细胞待测。
1.4 细胞因子测定(ELISA法)
标准品及标本孵育：加50 μl标准品及标本至试剂盒中所提供的96孔板(IL-2及IL-10试剂盒由Pharmingen公司提供)，用封条封闭，于20～25℃下孵育3 h后洗3次。生物素标记抗体试剂孵育：加50 μl试剂至每孔，封闭后在20～25℃下孵育1 h后洗3次。Sterptaridin-HRP溶液孵育：加100 μl溶液至每孔，封闭后20～25℃下孵育30 min后洗3次。底物孵育及终止阶段：加100 μl底物至每孔，在暗室室温下酶色反应30 min后，每孔加100 μl终止液以终止反应。读取吸光度：在终止反应后30 min内于酶标免疫检测仪(Bio-Tek产品)450～550 nm下读数。拟合标准曲线，根据标准曲线方程计算标本含量。
, 百拇医药
1.5 统计学处理
测定值以
±s表示，采用t检验，率的比较采用χ2检验。以P<0.05为有显著性差异。
2 结果
2.1 发病情况
急性组小鼠感染后第3天出现症状，表现为松毛、食欲减退、活动减少、精神萎靡、体重减轻；第5天开始死亡，死亡高峰期为第5天及第9天。慢性组小鼠感染后15 d左右出现症状，第20天开始死亡，以30～40 d为死亡高峰期。
2.2 病理检查
急性心肌炎小鼠在感染后第3天时心肌尚未见病变，第5天心肌内有炎症浸润，第8天及第12天病变极为严重，心肌层大量炎症浸润且呈片状坏死。RSF治疗组能明显减轻病变程度。慢性心肌炎小鼠的心肌层有成片的坏死后纤维化，间质内及室壁近心内膜处广泛胶原纤维形成，未见明显炎症细胞浸润。
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2.3 Th1/Th2类细胞因子测定
在急性心肌炎模型中，病毒对照组中以Th1类细胞因子——IL-2的表达为主，在感染后第3天即达到高峰，后逐下降，到第12天仍高于正常，而Th2类细胞因子——IL-10基本于正常范围(表1)。RSF治疗组，除感染早期(第3天)外，均能显著调低IL-2的表达，对IL-10则表现为有明显的触发效应(表1)；慢性心肌炎模型中，虽均有Th1与Th2类细胞因子的增高，但Th1反应的幅度较Th2明显为甚(表2)；对感染后180 d的小鼠，经RSF治疗后检测，发现能增加Th2的表达(表3)。
表1 急性心肌炎病毒对照组、RSF治疗组小鼠感染后不同天数Th细胞比较 pg/ml,±s 感染后天数
, 百拇医药
Th1(IL-2)
Th2(IL-10)
Th1/Th2(IL-2/IL-10)
病毒对照组
RSF治疗组
病毒对照组
RSF治疗组
病毒对照组
RSF治疗组
第0天
493.71±48.61
, http://www.100md.com
106.48±15.36
4.66±0.28
第3天
1 112.4±113.492)
1 167.08±103.212)
128.1±55.734)
343.56±63.762)
10.2±4.383)
3.51±0.86
第5天
, 百拇医药
459.58±49.603)
183.60±85.752)
132.03±57.13
161.75±17.852)
3.97±1.553)
1.14±0.512)
第8天
701.65±260.313)
144.73±32.712)
, http://www.100md.com
73.63±16.581)4)
172.33±25.241)
9.63±3.051)4)
0.83±0.072)
第12天
705.30±215.904)
136.13±47.662)
81.77±7.85
59.48±8.822)
, 百拇医药
8.51±1.941)4)
2.24±0.412)
与第0天比较，1) P<0.05；2) P<0.01；与RSF治疗组比较3) P<0.05，4) P<0.01
表2 慢性VM病毒组小鼠Th细胞比较 pg/ml,±s
感染后天数
第0天
第30天
第60天
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第90天
第180天
Th1(IL-2)
493.71±48.61
1 061.80±131.752)
732.90±109.151)
1 354.51±99.372)
1 296.08±152.342)
Th2(IL-10)
106.48±15.36
, 百拇医药
1 024.35±160.772)
364.61±125.51)
319.4±86.132)
82.63±5.951)
Th1/Th2
(IL-2/IL-10)
4.66±0.28
1.06±0.242)
2.26±1.021)
, http://www.100md.com
4.55±1.42
15.71±1.532)
与第0天比较，1) P<0.05，2) P<0.01
表3 RSF对180 d慢性VM小鼠实验第180天细胞比较 pg/ml,±s 组别
Th1(IL-2)
Th2(IL-10)
Th1/Th2(IL-2/IL-10)
, 百拇医药 正常组
493.71±48.61
106.48±15.36
4.66±0.28
病毒对照组
1 296.08±152.342)
82.63±5.951)
15.71±1.532)
RSF治疗组
1 235.24±134.132)
, 百拇医药 117.64±2.523)
10.50±1.162)3)
与正常组比较，1) P<0.05，2) P<0.01；与病毒对照组比较，3) P<0.05
3 讨论
由于Th细胞亚群在免疫应答及效应中的独特地位，其免疫调节作用近年来引起人们的极大兴趣。Th亚群存在着的功能极化反应是依赖于其所产生的细胞因子。Th1细胞主要分泌IFNγ、IL-2，负责细胞免疫；Th2细胞则产生IL-10、IL-4，作用于体液免疫。且Th1/Th2细胞存在着网络调节，故机体在正常状态时Th1和Th2细胞功能趋于动态平衡。一般认为，Th1反应介导杀死侵入细胞内的致病源；而Th2反应则倾向于清除胞外寄生物。Th1/Th2细胞功能的动态平衡状态是由多种因素协调的〔2～4〕。当机体受到异己抗原攻击时，Th1和Th2细胞中某一亚群功能升高，而另一亚群功能降低。Liblau称该现象为“克隆转换”(clonal diversion)〔5〕。
, 百拇医药
肠道病毒(EV)，尤其是柯萨奇B3病毒是引起VM最常见的病因。入侵病毒在心肌细胞中的复制可直接导致心肌组织的病理损伤；除此之外，目前较一致地认为，机体的免疫反应是造成急性心肌炎转变为亚急性及慢性病变的主要原因。在小鼠实验性自身免疫心肌炎(EAM)模型中发现〔6，7〕：Th1和Th2细胞在EAM的不同阶段产生且调节着炎症及EAM的病程。另在小鼠急性CVB3心肌炎模型中，Th细胞浸润心肌且介导的早期免疫反应为Th1类〔8〕；但近年来的研究也表明不同的CVB3病毒株及实验动物性别对Th细胞的反应是截然不同的〔9〕。由此可见，Th亚群的调节作用是取决于多种复杂的因素。
在本实验中，急性VMC造型小鼠亦存在着Th亚群的动态变化：在感染后第3天，Th1类细胞因子即开始大量表达，以后逐渐下降；而Th2类细胞因子在整个急性感染阶段均未见明显表达，提示在急性心肌炎中Th1细胞起着主导地位。有实验证实，在急性病毒血症期，IL-2通过提高自然杀伤细胞活性使心脏病变减轻，相反在亚急性非病毒血症期，IL-2增加浸润心脏的T细胞数目而加剧疾病的进程和严重程度。通过RSF治疗后，小鼠Th1类细胞因子在感染5 d后即显著降低，同时Th2类细胞因子基本上有明显的调高现象。结合病理检查发现，我们认为，RSF对急性心肌炎小鼠心肌病变的改善，可能是通过改变其Th亚群来实现，Th1细胞在急性感染期心肌的病理损害中起着重要作用，Th2细胞则可能有利于疾病的控制。
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在慢性心肌炎模型中亦发现Th1细胞在第180天的发病阶段中均有着过度表达现象；虽可见Th2细胞也呈增高势，尤其在感染后第30天时达到高峰，但以后迅速降低，至第180天时已低于正常范围。表明在该病变过程中，Th亚群——Th1及Th2细胞均参与了其中的免疫调节，Th1细胞的作用在病理过程中似乎更为明显。在感染后第180天对其给予RSF，经过2周治疗后发现，RSF虽对Th1类反应无调节作用，但可提高Th2类细胞因子的浓度。
有充分证据表明，Th亚群参与了急慢性心肌炎的发病，Th1细胞被证明在BALB/c小鼠心肌炎发病中起着关键作用，而Th2类细胞则利于病变的改善。RSF对急慢性心肌炎有显著的治疗作用，其作用途径可能在于调节Th亚群反应：即抑制Th1类细胞，提高Th2类细胞来实现。RSF在控制病毒感染及心肌炎的发生、反复发作方面可能有帮助，这也为防治该病提供了一新途径。
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国家“九五”攻关基金资助部分内容(96-906-02-137)
参考文献
[1]Mosmann T R，Cherwinski H M，Bond M W，et al.Two types of murine helper T cells clone Ⅰ.Definition according to profiles of lymphokine activities and secreted proteins.J Immunol, 1986，136：2348～2357
[2]Serio Romagnani.The Th1/Th2 paradigm.Immunol Today,1997，18:263～266
[3]Annunziato F，Manetti R，Tomaseric L，et al. Expression and release of LAG-3-encoded protein by human CD+4 T cells are associated with IFN-γ production.FASEB J,1996，10:767～776
, 百拇医药
[4]Patel D D，Wee S F，Whichard L P，et al. Identification and characterization of a 100-KD ligand for CD6 on human thymic epithelial cells.J Exp Med，1995，181:1563～1568
[5]Liblau R S，Singer S M，McDeritt H D，et al.Th1 and Th2 CD+4 T cells in the pathogenesis of organ-specific autoimmune diseases.Immunol Today，1995，16：34～38
[6]Seko Y，Takahashi N，Yagita H，et al.Expression of cytokine mRNAs in murine hearts with acute myocardits caused by coxsackievirus B3.J Pathol，1997，183：105～108
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[7]Huber S A，Mortensen A，Moulton G.Modulation of cytokine expression by CD+4 T cells during coxsackievirus B3 infections of BALB/c mice initiated by cells expressing the game delta + T cell receptor.J Virol，1996，70：3039～3044
[8]Huber S A，Pfaeffle B.Differential Th1 and Th2 cell responses in male and female BALB/c mice infected with coxsackievirus group B type 3.J Virol，1994，68：5126～5132
[9]Huber S A，Polgar J，Schultheiss P，et al.Augmentation of pathogenesis of coxsackievirus B3 infections in mice by exogenous administration of interleukin-1 and interleukin-2.J Virol，1994，68：195～206
收稿 1999-07-08, 百拇医药
单位：陈曙霞(上海第二医科大学附属仁济医院心内科 上海，200001)；徐欣晖(上海第二医科大学附属仁济医院心内科 上海，200001)；张冬青(上海第二医科大学免疫学教研室)
关键词：柯萨奇病毒B组；T淋巴细胞，辅助诱导；抗柯注射液；病毒性心肌炎
临床心血管病杂志000311 摘要 目的：观察BALB/c小鼠在感染柯萨奇病毒后辅助T淋巴(Th)细胞——Th1、Th2细胞的动态变化以及抗柯注射液(RSF)的干预治疗对其影响。方法：将156只BALB/c小鼠分别制备成急性心肌炎、慢性心肌炎模型，各模型随机分为正常组、病毒对照组和RSF治疗组，用ELISA法检测各组小鼠Th1、Th2类细胞因子。结果：在急性心肌炎模型中，病毒对照组在感染后第3天Th1达到高峰，后逐渐下降，到第12天仍高于正常，而Th2基本于正常范围；RSF治疗组除第3天外，Th1均下降，Th2则表现为有明显的触发效应。慢性心肌炎模型中，各组Th1与Th2类细胞因子均增高。结论：在急、慢性心肌炎中，Th1类细胞在病程中起着主导地位，Th2类细胞则有利于疾病的改善。RSFA对coxB3m心肌炎有显著的治疗作用，其作用机制可能是通过对Th亚群的调节来实现——即抑制Th1细胞，增高Th2细胞的表达来进行免疫调节。
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Analysis of Th1/Th2 cells and the immunoregulatory effects
of RSF on mice infected by coxB3m virus
CHEN Shu-xia1 XU Xin-hui1 ZHANG Dong-qing2
(1 Department of Cardiology,Renji Hospital Shanghai
Second Medical University,Shanghai 200001;
2 Department of Immunology,Shanghai Second Medical University)
, 百拇医药
Abstract Objective:Study about the regulatory mechanism of the characteristic cytokine products of Th1 and Th2 cells and the expressions of Th1,Th2 cell intervened by Radix sophora flavescens (RSF).Method:To prepare the acute and chronic myocarditis of the murine model (156 cases).They were divided into 3 groups at random,such as CVB3m infectious group,RSF therapeutic group and control group.The characteristic cytokines (IL-2 and IL-10) of the subsets were detected by ELISA kits (pharmingen co).Result:Th1-like cytokine IL-2 was mostly expressed in the acute myocarditis,it was elevated maximal on day 3,and subsequently decreased,still higher than normal on day 12.The Th2-like cytokine IL-10 was in normal range all along.In the chronic myocarditis model,the expression of cytokines was enhanced in both Th1 and Th2-like cells.Conclusion:The immunophysiologic responses in acute and chronic myocarditis be mainly induced by Th1 cells,and Th2 cells help inhibit inflammation,RSF has therapeutic roles in CoxB3m myocarditis by regulating T help cells subsets level it facilated in inhibiting Th1 cells and enhancing the expressions of Th2 cells.
, 百拇医药
Key words Coxsackie B viruses T-Lymphocytes,helper-inducer Radix sophora flavescens Viral myocarditis
1986年，Mosmann等〔1〕首先观察到小鼠CD+4T辅助(Th)细胞具有两种功能不同的亚群，即Th1和Th2；后来大量研究证实在人类也存在着这两类细胞。目前认为，免疫系统针对不同类型的感染能引起不同的免疫效应，而特定的免疫应答及其效应主要由Th亚群来调节。病毒性心肌炎(VM)是临床常见疾病，至今缺乏有效治疗措施。为揭示其发病机制，更好的控制该病及逆转疾病转归提供理论依据，本文对BALB/c小鼠VM模型的Th亚群调节情况进行研究。
1 材料与方法
1.1 材料
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病毒：嗜心肌柯萨奇病毒(coxB3m)由上海第二医科大学微生物教研室提供。病毒原液-80℃保存。动物：BALB/c纯种雄性小鼠，8周龄，体重18～20g。构自中英合资上海西普尔-必凯实验动物有限公司。抗柯注射液(RSF)：由上海第二医科大学附属仁济医院提供。
1.2 动物模型的制备
急性心肌炎BALB/c小鼠100只随机分为3组：正常组：10只，腹腔注射生理盐水0.1 ml，2次/d；病毒对照组：45只，腹腔注射10-6TCID50/ml CVB3稀释液0.1 ml；RSF治疗组：45只，腹腔注射病毒液后(量同病毒对照组)，再以RSF稀释液(20 mg.kg-1.d-1)腹腔注射，0.1 ml/次，2次/d，共用药12 d。上述小鼠分别于第3、5、8、12天，随机取6只处死。
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慢性心肌炎BALB/c小鼠56只，随机分为两组：病毒组：50只，一次腹腔注射0.1 ml10-8TCID50的coxB3m病毒；正常组6只，腹腔注射0.1 ml生理盐水。病毒组在接种后每2周分别于腹腔注射0.05 ml 10-8TCID50的coxB3m病毒，共4次；以后每4周腹腔注射0.1 ml10-8TCID50的coxB3m病毒，亦为4次。分别于感染后第30天、第60天、第90天、第180天随机取部分小鼠处死。其中取感染后180 d小鼠12只，随机分为2组，即病毒对照组及RSF治疗组。RSF治疗组用RSF稀释液0.1 ml(以20 mg.kg-1.d-1剂量)，分2次/d腹腔注射，共治疗2周；病毒对照组每天以生理盐水0.1 ml腹腔注射，2次/d，亦为2周。
, http://www.100md.com 组织病理检查：取心脏用10%甲醛固定，石蜡切片，H-E及V-G染色。倒置显微镜(Olympus产品)下观察结果。炎症浸润灶1～5个/切面为+，6～10个/切面为++，>10个/切面为+++。坏死灶单个细胞坏死为主为+，条索、小片状坏死为++，大片状坏死为+++。
1.3 小鼠脾细胞诱导上清液的制备
无菌取脾，置适量无菌Hanks液的小平皿中。
将脾脏在不锈钢筛网上轻轻摩擦，制成单个细胞悬液，移入带盖的无菌试管中，用Hanks液洗3次，每次离心(1 000r/min)10 min。
每试管加入2～3 ml淋巴细胞分离液(1.088比重)，将脾单个核细胞悬液3 ml轻轻铺于分离液上面，离心(2 000r/min)20 min。吸出淋巴细胞层，用Hanks洗3次，每次离心(1 000r/min)10 min。在显微镜下计数细胞，用10%FCS1640(Gibco公司产品)培养液调整细胞数为2×106/ml。
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将2×106/ml细胞浓度的单个核细胞加入96孔培养板(Costar产品)上，每孔100 μl；同时加入conA(Doko公司产品)为10 μg/孔。
将培养板置于37℃，5%二氧化碳培养箱(Heraeus产品)中孵育72 h，收集细胞悬液，离心(1 000 r/min)5 min，分别收集上清液与细胞待测。
1.4 细胞因子测定(ELISA法)
标准品及标本孵育：加50 μl标准品及标本至试剂盒中所提供的96孔板(IL-2及IL-10试剂盒由Pharmingen公司提供)，用封条封闭，于20～25℃下孵育3 h后洗3次。生物素标记抗体试剂孵育：加50 μl试剂至每孔，封闭后在20～25℃下孵育1 h后洗3次。Sterptaridin-HRP溶液孵育：加100 μl溶液至每孔，封闭后20～25℃下孵育30 min后洗3次。底物孵育及终止阶段：加100 μl底物至每孔，在暗室室温下酶色反应30 min后，每孔加100 μl终止液以终止反应。读取吸光度：在终止反应后30 min内于酶标免疫检测仪(Bio-Tek产品)450～550 nm下读数。拟合标准曲线，根据标准曲线方程计算标本含量。
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1.5 统计学处理
测定值以
±s表示，采用t检验，率的比较采用χ2检验。以P<0.05为有显著性差异。2 结果
2.1 发病情况
急性组小鼠感染后第3天出现症状，表现为松毛、食欲减退、活动减少、精神萎靡、体重减轻；第5天开始死亡，死亡高峰期为第5天及第9天。慢性组小鼠感染后15 d左右出现症状，第20天开始死亡，以30～40 d为死亡高峰期。
2.2 病理检查
急性心肌炎小鼠在感染后第3天时心肌尚未见病变，第5天心肌内有炎症浸润，第8天及第12天病变极为严重，心肌层大量炎症浸润且呈片状坏死。RSF治疗组能明显减轻病变程度。慢性心肌炎小鼠的心肌层有成片的坏死后纤维化，间质内及室壁近心内膜处广泛胶原纤维形成，未见明显炎症细胞浸润。
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2.3 Th1/Th2类细胞因子测定
在急性心肌炎模型中，病毒对照组中以Th1类细胞因子——IL-2的表达为主，在感染后第3天即达到高峰，后逐下降，到第12天仍高于正常，而Th2类细胞因子——IL-10基本于正常范围(表1)。RSF治疗组，除感染早期(第3天)外，均能显著调低IL-2的表达，对IL-10则表现为有明显的触发效应(表1)；慢性心肌炎模型中，虽均有Th1与Th2类细胞因子的增高，但Th1反应的幅度较Th2明显为甚(表2)；对感染后180 d的小鼠，经RSF治疗后检测，发现能增加Th2的表达(表3)。
表1 急性心肌炎病毒对照组、RSF治疗组小鼠感染后不同天数Th细胞比较 pg/ml,
±s 感染后天数, 百拇医药
Th1(IL-2)
Th2(IL-10)
Th1/Th2(IL-2/IL-10)
病毒对照组
RSF治疗组
病毒对照组
RSF治疗组
病毒对照组
RSF治疗组
第0天
493.71±48.61
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106.48±15.36
4.66±0.28
第3天
1 112.4±113.492)
1 167.08±103.212)
128.1±55.734)
343.56±63.762)
10.2±4.383)
3.51±0.86
第5天
, 百拇医药
459.58±49.603)
183.60±85.752)
132.03±57.13
161.75±17.852)
3.97±1.553)
1.14±0.512)
第8天
701.65±260.313)
144.73±32.712)
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73.63±16.581)4)
172.33±25.241)
9.63±3.051)4)
0.83±0.072)
第12天
705.30±215.904)
136.13±47.662)
81.77±7.85
59.48±8.822)
, 百拇医药
8.51±1.941)4)
2.24±0.412)
与第0天比较，1) P<0.05；2) P<0.01；与RSF治疗组比较3) P<0.05，4) P<0.01
表2 慢性VM病毒组小鼠Th细胞比较 pg/ml,
±s感染后天数
第0天
第30天
第60天
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第90天
第180天
Th1(IL-2)
493.71±48.61
1 061.80±131.752)
732.90±109.151)
1 354.51±99.372)
1 296.08±152.342)
Th2(IL-10)
106.48±15.36
, 百拇医药
1 024.35±160.772)
364.61±125.51)
319.4±86.132)
82.63±5.951)
Th1/Th2
(IL-2/IL-10)
4.66±0.28
1.06±0.242)
2.26±1.021)
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4.55±1.42
15.71±1.532)
与第0天比较，1) P<0.05，2) P<0.01
表3 RSF对180 d慢性VM小鼠实验第180天细胞比较 pg/ml,
±s 组别Th1(IL-2)
Th2(IL-10)
Th1/Th2(IL-2/IL-10)
, 百拇医药 正常组
493.71±48.61
106.48±15.36
4.66±0.28
病毒对照组
1 296.08±152.342)
82.63±5.951)
15.71±1.532)
RSF治疗组
1 235.24±134.132)
, 百拇医药 117.64±2.523)
10.50±1.162)3)
与正常组比较，1) P<0.05，2) P<0.01；与病毒对照组比较，3) P<0.05
3 讨论
由于Th细胞亚群在免疫应答及效应中的独特地位，其免疫调节作用近年来引起人们的极大兴趣。Th亚群存在着的功能极化反应是依赖于其所产生的细胞因子。Th1细胞主要分泌IFNγ、IL-2，负责细胞免疫；Th2细胞则产生IL-10、IL-4，作用于体液免疫。且Th1/Th2细胞存在着网络调节，故机体在正常状态时Th1和Th2细胞功能趋于动态平衡。一般认为，Th1反应介导杀死侵入细胞内的致病源；而Th2反应则倾向于清除胞外寄生物。Th1/Th2细胞功能的动态平衡状态是由多种因素协调的〔2～4〕。当机体受到异己抗原攻击时，Th1和Th2细胞中某一亚群功能升高，而另一亚群功能降低。Liblau称该现象为“克隆转换”(clonal diversion)〔5〕。
, 百拇医药
肠道病毒(EV)，尤其是柯萨奇B3病毒是引起VM最常见的病因。入侵病毒在心肌细胞中的复制可直接导致心肌组织的病理损伤；除此之外，目前较一致地认为，机体的免疫反应是造成急性心肌炎转变为亚急性及慢性病变的主要原因。在小鼠实验性自身免疫心肌炎(EAM)模型中发现〔6，7〕：Th1和Th2细胞在EAM的不同阶段产生且调节着炎症及EAM的病程。另在小鼠急性CVB3心肌炎模型中，Th细胞浸润心肌且介导的早期免疫反应为Th1类〔8〕；但近年来的研究也表明不同的CVB3病毒株及实验动物性别对Th细胞的反应是截然不同的〔9〕。由此可见，Th亚群的调节作用是取决于多种复杂的因素。
在本实验中，急性VMC造型小鼠亦存在着Th亚群的动态变化：在感染后第3天，Th1类细胞因子即开始大量表达，以后逐渐下降；而Th2类细胞因子在整个急性感染阶段均未见明显表达，提示在急性心肌炎中Th1细胞起着主导地位。有实验证实，在急性病毒血症期，IL-2通过提高自然杀伤细胞活性使心脏病变减轻，相反在亚急性非病毒血症期，IL-2增加浸润心脏的T细胞数目而加剧疾病的进程和严重程度。通过RSF治疗后，小鼠Th1类细胞因子在感染5 d后即显著降低，同时Th2类细胞因子基本上有明显的调高现象。结合病理检查发现，我们认为，RSF对急性心肌炎小鼠心肌病变的改善，可能是通过改变其Th亚群来实现，Th1细胞在急性感染期心肌的病理损害中起着重要作用，Th2细胞则可能有利于疾病的控制。
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在慢性心肌炎模型中亦发现Th1细胞在第180天的发病阶段中均有着过度表达现象；虽可见Th2细胞也呈增高势，尤其在感染后第30天时达到高峰，但以后迅速降低，至第180天时已低于正常范围。表明在该病变过程中，Th亚群——Th1及Th2细胞均参与了其中的免疫调节，Th1细胞的作用在病理过程中似乎更为明显。在感染后第180天对其给予RSF，经过2周治疗后发现，RSF虽对Th1类反应无调节作用，但可提高Th2类细胞因子的浓度。
有充分证据表明，Th亚群参与了急慢性心肌炎的发病，Th1细胞被证明在BALB/c小鼠心肌炎发病中起着关键作用，而Th2类细胞则利于病变的改善。RSF对急慢性心肌炎有显著的治疗作用，其作用途径可能在于调节Th亚群反应：即抑制Th1类细胞，提高Th2类细胞来实现。RSF在控制病毒感染及心肌炎的发生、反复发作方面可能有帮助，这也为防治该病提供了一新途径。
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国家“九五”攻关基金资助部分内容(96-906-02-137)
参考文献
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收稿 1999-07-08, 百拇医药