牛膝提取物对成骨样细胞增殖的作用
作者：高晓燕 王大为 李发美 姜志明
单位：王大为 高晓燕(沈阳药科大学基础部，沈阳 110015)
关键词：牛膝；促细胞增殖作用；成骨样细胞UMR106；MTT法
沈阳药科大学学报000318
摘 要 考察了牛膝(Achyranthes bidentata Bl.)的不同提取部位对成骨样细胞UMR106的作用.通过牛膝的醇提液及醇提液的不同提取部位和UMR106成骨样细胞共同体外培养，用MTT方法检测了各部位对细胞增殖的作用；同时考察了MTT法的实验条件.结果表明：牛膝的醇提液及其石油醚和乙酸乙酯萃取的混和物对细胞具有较强的促进增殖作用，而正丁醇层和水层对细胞增殖无影响；在MTT法中，铺板细胞浓度、检测波长和加入MTT后的孵育时间均影响吸光度值的测定.牛膝中低极性部位可能含有直接作用于成骨细胞的活性成分.
, 百拇医药
分类号 R97.2
The Effect of the Extracts of Achyranthes bidentata
Bl. onProliferation of Osteoblast-like UMR 106 Cells
Gao Xiaoyan，Wang Dawei，Li Famei,Jiang Zhiming
Department of Basic Courses,Shenyang Pharmaceutical University,Shenyang 110015
Abstract The effects of the extracts of Achyranthes bidentata Bl.(AB)on osteoblast-like(OB-like) UMR 106cells were studied.The extracts were incubated with cells in vitro.The proliferation of OB-like cells wasdetermined by using the MTT assay,and the assay conditions were investigated.It was found that theconcentration of cells,determination of the wavelength as well as cultured time with the MTT solution affected themeasurement of absorbance.The ethanol(75%)extract and the mixture extracted with petroleum ether and ethylacetate showed the stimulation activity to OB-like cells.The results indicated that the lower-polar substance ofAB may contain constituents active in stimulating osteoblast.
, 百拇医药
Key words Achyranthes bidentata Bl.；proliferation;osteoblast-like UMR 106 cells;MTT assay
牛膝为苋科牛膝属植物Achyranthes bidentata Bl.之干燥根，具有散淤血、消肿痛、补肝肾、强筋骨之功效〔1〕，近年来牛膝的抗衰老作用及免疫增强作用又逐渐被人们所认识〔2,3〕.补肾中药已广泛用于骨质疏松症的治疗.据报道历代文献明确为治疗“骨痹”、“骨痿”(即现代骨质疏松症)的方剂共21首，涉及药物77味，其中牛膝出现11次，是出现频率第3高的药味〔4〕.有人用含有牛膝的补肾中药对去势大鼠进行骨形态的研究，发现该复方能使大鼠骨小梁的宽度、面积、总体积以及密质骨面积增大，而骨髓腔面积减小〔5〕.但就牛膝单味药对骨代谢影响的研究还很少，牛膝对成骨细胞和破骨细胞的作用的研究还未见报道.本文从75%乙醇提取液中萃取不同极性部位，通过体外细胞实验考察了其对成骨样细胞UMR106增殖的促进作用.
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1 材料与方法
1.1 实验材料
UMR106(大鼠成骨肉瘤细胞系)细胞株购自北京医科大学生物化学与细胞分子生物学系，源于
美国麻省总医院；3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基-四唑氢溴酸盐(MTT)购自Sigma公司；
MEM(Minimum Essential Medium)培养基购自Gibico公司；其它试剂均为国产分析纯；牛膝药材购自辽宁省药材公司，经本校药用植物教研室孙启时教授鉴定为Achyranthes bidentata Bl.之干燥根.
1.2 实验方法
1.2.1 药物制备
取牛膝80 g以8倍量75%乙醇回流提取3次，每次2 h，回收乙醇得浸膏，溶于水，依次用石油
, 百拇医药
醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，合并石油醚和乙酸乙酯萃取部位得浸膏0.5 g，正丁醇萃取部位得浸
膏4.5 g，水层浸膏10 g.分别取乙醇提取液、石油醚与乙酸乙酯萃取部位、正丁醇萃取部位以75%
乙醇配成按原生药计一定浓度的储备液，再用无血清MEM培养液依次稀释成不同浓度.
1.2.2 UMR106细胞的培养和增殖检测
选择对数生长期的成骨样细胞UMR106,用含血清的MEM细胞培养液将细胞浓度调为(4～4.5)
×104/mL，辅入96孔细胞培养板中，0.2 mL/孔，培养24 h后，换无血清MEM培养液，饥饿细胞24
h，甩掉无血清MEM培养液，然后把不同浓度的含药无血清MEM培养液分别加入细胞培养体系(每
, 百拇医药
个浓度4个复孔)，继续培养48 h.弃去含药培养液，加入1 mg/mL的MTT溶液50 μL，培养3 h后，弃
去上清液，加入150 μL二甲基亚砜(DMSO)，待沉淀完全溶解后以595 nm为测定波长，655 nm为
参比波长测定吸光度值.以不加中药的细胞孔测得的吸光度值为空白，用t检验进行不同浓度的加
药组与空白组之间均值的比较.
2 实验结果
2.1 实验条件选择
2.1.1 检测波长
图1为与MTT共孵育的细胞加入DMSO后的吸收光谱，由图可见，溶液的最大吸收波长在504
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nm处，但所使用的酶标仪可选择的波长不具备504 nm，而溶液在595 nm处仍有很强的吸收，在655
nm处则吸收相当弱，因此选择了595 nm为测定波长，655 nm为参比波长，这样仍有很高的灵敏度.
Fig.1 The spectrum of DMSO solution of formazan
2.1.2 细胞浓度
铺板细胞浓度在(0.16～3.4)×105/mL之间时，细胞浓度和吸光度值直线相关(r=0.971 2，n=4)，表明吸光度值与细胞增殖具有一致性.实验数据见表1.
Tab.1 The relationship between concentration of cells and absorbance(
±s) Concentration of cells/mL
, http://www.100md.com
A
0.16×105
0.135±0.01
0.21×105
0.154±0.02
0.42×105
0.193±0.01
0.85×105
0.285±0.01
1.7×105
0.362±0.02
3.4×105
, http://www.100md.com
0.496±0.01
2.1.3 加入MTT后的孵育时间
选择对数生长期的成骨样细胞UMR106，用含血清的MEM细胞培养液将细胞浓度调为(4～4.5)
×104/mL，铺入96孔细胞培养板中，0.2 mL/孔，培养24 h后，弃去培养液，加入1 mg/mL的MTT溶
液50 μL，分别在1、2、3、4、5 h后吸去MTT溶液，加入150 μL DMSO，待沉淀完全溶解后测
定吸光度值(每个时间点4个复孔).结果如图2所示，加入MTT后2 h的吸光度值最大，在2～3 h内变
化不明显，其后随着时间的延长吸光度值变小，因此加入MTT 2～3 h后进行测定为宜.
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Fig.2 The effect of time cultured with the MTT solution on absorbance
2.2 牛膝对成骨样细胞UMR106增殖的促进作用
牛膝的乙醇提取液可促进成骨样细胞UMR106的增殖，3次实验的结果见表2.由表中数据可以
看出，牛膝的醇提液对细胞增殖的促进作用存在着明显的剂量-活性关系，当培养液中含有相当于
生药浓度10-2数量级时，其促进细胞增殖的作用最强，3次实验的平均增殖率为27.8%；浓度为10-3数量级时平均增殖率为14%.
石油醚与乙酸乙酯萃取部位的混合物比乙醇提取液具有更强的促进成骨样细胞UMR106增殖
, 百拇医药 的作用，3次实验的结果见表3.由表中数据看出，当培养液中含有药物相当于生药浓度10-4～10-6
数量级时，表现出显著的促进细胞增殖作用，其中10-6数量级时的增殖率最高，其平均增殖率为
55%，10-5数量级时的平均增殖率为47%，10-4数量级时的平均增殖率为39%.正丁醇部位和水层与
空白之间无显著性差异.
3 讨论
本实验所用成骨样细胞UMR106取自大鼠成骨肉瘤细胞，它不但具有成骨细胞的特点且容易
培养，可以用来替代成骨细胞研究，它的增殖就代表了成骨细胞的增殖，而成骨细胞是骨代谢过
程中的重要细胞，它的增殖有利于骨的形成.从本实验看出，牛膝的提取物对成骨样细胞UMR106
, 百拇医药
的增殖具有促进作用.由于本实验采用的是中药提取物和细胞共同体外培养的方法，推测牛膝中含
有直接刺激成骨样细胞增殖的成分，牛膝治疗骨质疏松症可能是其中某些化学成分直接作用于成
骨细胞.对这些活性成分的分离、鉴定和测定将有重要意义.
Tab.2 The effect ethanol extract on proliferation of UMR 106(±s，n=4) Experiment
Concentration of drug/mg.mL-1
A
Blank
, 百拇医药
1
4.0×10-1
0.338±0.02
4.0×10-2
0.365±0.02**
0.290±0.01
4.0×10-3
0.360±0.01**
4.0×10-4
0.361±0.02*
2
, 百拇医药
2.0×10-1
0.163±0.03*
2.0×10-2
0.200±0.02*
0.154±0.01
2.0×10-3
0.179±0.01**
2.0×10-4
0.180±0.01**
3
3.0×10-1
, 百拇医药
0.127±0.02
3.0×10-2
0.147±0.01*
0.124±0.04
3.0×10-3
0.128±0.04
3.0×10-4
0.132±0.05
Compared with bland *P<0.05；* *P<0.01Tab.3 The effect of the mixture extracted by petroleum ether and ethyl acetate on proliferation of
, http://www.100md.com
UMR106(±s，n=4) Experiment
Concentration of drug/mg.mL-1
A
Blank
1
3.2×10-2
0.230±0.02*
3.2×10-3
0.207±0.01**
3.2×10-4
, 百拇医药 0.217±0.02**
0.130±0.02
3.2×10-5
0.234±0.02*
3.2×10-6
0.226±0.01***
2
3.2×10-2
0.289±0.02
3.2×10-3
0.337±0.02*
, 百拇医药
3.2×10-4
0.336±0.01***
0.293±0.03
3.2×10-5
0.374±0.01***
3.2×10-6
0.367±0.02***
3
8.0×10-3
0.145±0.02***
8.0×10-4
, 百拇医药
0.209±0.04***
0.127±0.02
8.0×10-5
0.167±0.05*
8.0×10-6
0.210±0.05***
Compared with bland *P<0.05；**P<0.01；***P<0.001
骨形成是由成骨细胞的增殖和分化共同完成的，成骨细胞必须经过分化才能形成骨.本文只研究了牛膝的提取物对成骨样细胞增殖的作用，对分化的影响尚在进行中.在骨代谢的过程中成骨细胞和破骨细胞存在着偶联关系，共同维持骨再建的平衡.骨质疏松症最好的治疗药物应该是既能促进成骨细胞的活性，又对破骨细胞有抑制作用.牛膝在促进成骨细胞增殖的同时对破骨细胞有何作用即对骨再建全过程的影响还有待于深入研究.
, 百拇医药
参考文献
1 中华人民共和国药典委员会.中华人民共和国药典：一部.广州：广东科技出版社，1995.87
2 唐黎明，吕志均，章小萍，等.牛膝多糖药效学研究.中成药，1996，18(5)：31～32
3 李宗锴，李电东.牛膝多糖的免疫调节作用.药学学报，1997，32(12)：881～887
4 张纾难，韩春生.中医对骨质疏松的认识沿革与嬗变.中国骨质疏松杂志，1999，5(1)：83～84
5 崔红英，张柏丽，安秀玲.补肾中药对大鼠骨形态的影响.天津中医,1997，14(5)：226～227
收稿日期:1999-09-28, 百拇医药
单位：王大为 高晓燕(沈阳药科大学基础部，沈阳 110015)
关键词：牛膝；促细胞增殖作用；成骨样细胞UMR106；MTT法
沈阳药科大学学报000318
摘 要 考察了牛膝(Achyranthes bidentata Bl.)的不同提取部位对成骨样细胞UMR106的作用.通过牛膝的醇提液及醇提液的不同提取部位和UMR106成骨样细胞共同体外培养，用MTT方法检测了各部位对细胞增殖的作用；同时考察了MTT法的实验条件.结果表明：牛膝的醇提液及其石油醚和乙酸乙酯萃取的混和物对细胞具有较强的促进增殖作用，而正丁醇层和水层对细胞增殖无影响；在MTT法中，铺板细胞浓度、检测波长和加入MTT后的孵育时间均影响吸光度值的测定.牛膝中低极性部位可能含有直接作用于成骨细胞的活性成分.
, 百拇医药
分类号 R97.2
The Effect of the Extracts of Achyranthes bidentata
Bl. onProliferation of Osteoblast-like UMR 106 Cells
Gao Xiaoyan，Wang Dawei，Li Famei,Jiang Zhiming
Department of Basic Courses,Shenyang Pharmaceutical University,Shenyang 110015
Abstract The effects of the extracts of Achyranthes bidentata Bl.(AB)on osteoblast-like(OB-like) UMR 106cells were studied.The extracts were incubated with cells in vitro.The proliferation of OB-like cells wasdetermined by using the MTT assay,and the assay conditions were investigated.It was found that theconcentration of cells,determination of the wavelength as well as cultured time with the MTT solution affected themeasurement of absorbance.The ethanol(75%)extract and the mixture extracted with petroleum ether and ethylacetate showed the stimulation activity to OB-like cells.The results indicated that the lower-polar substance ofAB may contain constituents active in stimulating osteoblast.
, 百拇医药
Key words Achyranthes bidentata Bl.；proliferation;osteoblast-like UMR 106 cells;MTT assay
牛膝为苋科牛膝属植物Achyranthes bidentata Bl.之干燥根，具有散淤血、消肿痛、补肝肾、强筋骨之功效〔1〕，近年来牛膝的抗衰老作用及免疫增强作用又逐渐被人们所认识〔2,3〕.补肾中药已广泛用于骨质疏松症的治疗.据报道历代文献明确为治疗“骨痹”、“骨痿”(即现代骨质疏松症)的方剂共21首，涉及药物77味，其中牛膝出现11次，是出现频率第3高的药味〔4〕.有人用含有牛膝的补肾中药对去势大鼠进行骨形态的研究，发现该复方能使大鼠骨小梁的宽度、面积、总体积以及密质骨面积增大，而骨髓腔面积减小〔5〕.但就牛膝单味药对骨代谢影响的研究还很少，牛膝对成骨细胞和破骨细胞的作用的研究还未见报道.本文从75%乙醇提取液中萃取不同极性部位，通过体外细胞实验考察了其对成骨样细胞UMR106增殖的促进作用.
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1 材料与方法
1.1 实验材料
UMR106(大鼠成骨肉瘤细胞系)细胞株购自北京医科大学生物化学与细胞分子生物学系，源于
美国麻省总医院；3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基-四唑氢溴酸盐(MTT)购自Sigma公司；
MEM(Minimum Essential Medium)培养基购自Gibico公司；其它试剂均为国产分析纯；牛膝药材购自辽宁省药材公司，经本校药用植物教研室孙启时教授鉴定为Achyranthes bidentata Bl.之干燥根.
1.2 实验方法
1.2.1 药物制备
取牛膝80 g以8倍量75%乙醇回流提取3次，每次2 h，回收乙醇得浸膏，溶于水，依次用石油
, 百拇医药
醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，合并石油醚和乙酸乙酯萃取部位得浸膏0.5 g，正丁醇萃取部位得浸
膏4.5 g，水层浸膏10 g.分别取乙醇提取液、石油醚与乙酸乙酯萃取部位、正丁醇萃取部位以75%
乙醇配成按原生药计一定浓度的储备液，再用无血清MEM培养液依次稀释成不同浓度.
1.2.2 UMR106细胞的培养和增殖检测
选择对数生长期的成骨样细胞UMR106,用含血清的MEM细胞培养液将细胞浓度调为(4～4.5)
×104/mL，辅入96孔细胞培养板中，0.2 mL/孔，培养24 h后，换无血清MEM培养液，饥饿细胞24
h，甩掉无血清MEM培养液，然后把不同浓度的含药无血清MEM培养液分别加入细胞培养体系(每
, 百拇医药
个浓度4个复孔)，继续培养48 h.弃去含药培养液，加入1 mg/mL的MTT溶液50 μL，培养3 h后，弃
去上清液，加入150 μL二甲基亚砜(DMSO)，待沉淀完全溶解后以595 nm为测定波长，655 nm为
参比波长测定吸光度值.以不加中药的细胞孔测得的吸光度值为空白，用t检验进行不同浓度的加
药组与空白组之间均值的比较.
2 实验结果
2.1 实验条件选择
2.1.1 检测波长
图1为与MTT共孵育的细胞加入DMSO后的吸收光谱，由图可见，溶液的最大吸收波长在504
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nm处，但所使用的酶标仪可选择的波长不具备504 nm，而溶液在595 nm处仍有很强的吸收，在655
nm处则吸收相当弱，因此选择了595 nm为测定波长，655 nm为参比波长，这样仍有很高的灵敏度.
Fig.1 The spectrum of DMSO solution of formazan
2.1.2 细胞浓度
铺板细胞浓度在(0.16～3.4)×105/mL之间时，细胞浓度和吸光度值直线相关(r=0.971 2，n=4)，表明吸光度值与细胞增殖具有一致性.实验数据见表1.
Tab.1 The relationship between concentration of cells and absorbance(
±s) Concentration of cells/mL, http://www.100md.com
A
0.16×105
0.135±0.01
0.21×105
0.154±0.02
0.42×105
0.193±0.01
0.85×105
0.285±0.01
1.7×105
0.362±0.02
3.4×105
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0.496±0.01
2.1.3 加入MTT后的孵育时间
选择对数生长期的成骨样细胞UMR106，用含血清的MEM细胞培养液将细胞浓度调为(4～4.5)
×104/mL，铺入96孔细胞培养板中，0.2 mL/孔，培养24 h后，弃去培养液，加入1 mg/mL的MTT溶
液50 μL，分别在1、2、3、4、5 h后吸去MTT溶液，加入150 μL DMSO，待沉淀完全溶解后测
定吸光度值(每个时间点4个复孔).结果如图2所示，加入MTT后2 h的吸光度值最大，在2～3 h内变
化不明显，其后随着时间的延长吸光度值变小，因此加入MTT 2～3 h后进行测定为宜.
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Fig.2 The effect of time cultured with the MTT solution on absorbance
2.2 牛膝对成骨样细胞UMR106增殖的促进作用
牛膝的乙醇提取液可促进成骨样细胞UMR106的增殖，3次实验的结果见表2.由表中数据可以
看出，牛膝的醇提液对细胞增殖的促进作用存在着明显的剂量-活性关系，当培养液中含有相当于
生药浓度10-2数量级时，其促进细胞增殖的作用最强，3次实验的平均增殖率为27.8%；浓度为10-3数量级时平均增殖率为14%.
石油醚与乙酸乙酯萃取部位的混合物比乙醇提取液具有更强的促进成骨样细胞UMR106增殖
, 百拇医药 的作用，3次实验的结果见表3.由表中数据看出，当培养液中含有药物相当于生药浓度10-4～10-6
数量级时，表现出显著的促进细胞增殖作用，其中10-6数量级时的增殖率最高，其平均增殖率为
55%，10-5数量级时的平均增殖率为47%，10-4数量级时的平均增殖率为39%.正丁醇部位和水层与
空白之间无显著性差异.
3 讨论
本实验所用成骨样细胞UMR106取自大鼠成骨肉瘤细胞，它不但具有成骨细胞的特点且容易
培养，可以用来替代成骨细胞研究，它的增殖就代表了成骨细胞的增殖，而成骨细胞是骨代谢过
程中的重要细胞，它的增殖有利于骨的形成.从本实验看出，牛膝的提取物对成骨样细胞UMR106
, 百拇医药
的增殖具有促进作用.由于本实验采用的是中药提取物和细胞共同体外培养的方法，推测牛膝中含
有直接刺激成骨样细胞增殖的成分，牛膝治疗骨质疏松症可能是其中某些化学成分直接作用于成
骨细胞.对这些活性成分的分离、鉴定和测定将有重要意义.
Tab.2 The effect ethanol extract on proliferation of UMR 106(
±s，n=4) ExperimentConcentration of drug/mg.mL-1
A
Blank
, 百拇医药
1
4.0×10-1
0.338±0.02
4.0×10-2
0.365±0.02**
0.290±0.01
4.0×10-3
0.360±0.01**
4.0×10-4
0.361±0.02*
2
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2.0×10-1
0.163±0.03*
2.0×10-2
0.200±0.02*
0.154±0.01
2.0×10-3
0.179±0.01**
2.0×10-4
0.180±0.01**
3
3.0×10-1
, 百拇医药
0.127±0.02
3.0×10-2
0.147±0.01*
0.124±0.04
3.0×10-3
0.128±0.04
3.0×10-4
0.132±0.05
Compared with bland *P<0.05；* *P<0.01Tab.3 The effect of the mixture extracted by petroleum ether and ethyl acetate on proliferation of
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UMR106(±s，n=4) Experiment
Concentration of drug/mg.mL-1
A
Blank
1
3.2×10-2
0.230±0.02*
3.2×10-3
0.207±0.01**
3.2×10-4
, 百拇医药 0.217±0.02**
0.130±0.02
3.2×10-5
0.234±0.02*
3.2×10-6
0.226±0.01***
2
3.2×10-2
0.289±0.02
3.2×10-3
0.337±0.02*
, 百拇医药
3.2×10-4
0.336±0.01***
0.293±0.03
3.2×10-5
0.374±0.01***
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0.367±0.02***
3
8.0×10-3
0.145±0.02***
8.0×10-4
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0.209±0.04***
0.127±0.02
8.0×10-5
0.167±0.05*
8.0×10-6
0.210±0.05***
Compared with bland *P<0.05；**P<0.01；***P<0.001
骨形成是由成骨细胞的增殖和分化共同完成的，成骨细胞必须经过分化才能形成骨.本文只研究了牛膝的提取物对成骨样细胞增殖的作用，对分化的影响尚在进行中.在骨代谢的过程中成骨细胞和破骨细胞存在着偶联关系，共同维持骨再建的平衡.骨质疏松症最好的治疗药物应该是既能促进成骨细胞的活性，又对破骨细胞有抑制作用.牛膝在促进成骨细胞增殖的同时对破骨细胞有何作用即对骨再建全过程的影响还有待于深入研究.
, 百拇医药
参考文献
1 中华人民共和国药典委员会.中华人民共和国药典：一部.广州：广东科技出版社，1995.87
2 唐黎明，吕志均，章小萍，等.牛膝多糖药效学研究.中成药，1996，18(5)：31～32
3 李宗锴，李电东.牛膝多糖的免疫调节作用.药学学报，1997，32(12)：881～887
4 张纾难，韩春生.中医对骨质疏松的认识沿革与嬗变.中国骨质疏松杂志，1999，5(1)：83～84
5 崔红英，张柏丽，安秀玲.补肾中药对大鼠骨形态的影响.天津中医,1997，14(5)：226～227
收稿日期:1999-09-28, 百拇医药