褪黑素对谷氨酸所致动物脑内MDA生成的抑制作用
作者：杨红英 李经才 刘玉娟 付爱玲 张若明
单位：李经才 杨红英(沈阳药科大学药学系，沈阳 110015)
关键词：褪黑素；谷氨酸；自由基；衰老
沈阳药科大学学报000315 摘 要 用体内及体外两种实验方法，研究了谷氨酸对鼠脑组织中过氧化脂质及还原型谷胱甘肽含量的影响，以及施用褪黑素(MT)后对谷氨酸的对抗作用.结果表明，在体外，不同浓度的谷氨酸(2.9～11.7 mmol/L)均能显著提高大鼠脑匀浆中丙二醛(MDA)的含量；而加入MT(1～10 mmol/L)，可显著的对抗这种升高.体内实验，小鼠侧脑室给予不同浓度的谷氨酸可显著升高全脑组织中丙二醛(MDA)的含量及降低还原型谷胱甘肽的含量；如预先腹腔注射MT(1～10 mg.kg-1)，可显著对抗谷氨酸的影响.MT的这种作用可能是其抗衰老的机制之一.
, 百拇医药
分类号 R96
The Inhibitory Effect of Melatonin on the Level of MDA in the Animal′s Brain Induced by L-Glutamate
Yang Hongying,Li Jinagcai,Liu Yujuan,Fu Ailing,Zhang Ruoming
Department of Pharmacy,Shenyang Pharmaceutical University,Shenyang 110015
Abstract The level of MDA in the brain induced by L-glutamate and the inhibitory effect of melatonin were studied in vitro and in vivo.The results indicated that,in vitro,the L-glutamate of different concentrations(2.9～11.7 mmol*L-1)was capable of remarkedly increasing and MT(1～10 mmol*L-1) added together with L-glutamate was capable of remarkedly reducing the level of MDA in homogenates of the rat′s whole brain; in vivo，the L-glutamate of different doses(50～200 μg*mice-1)were injected(i.c.v.)into the mice,then the level of MDA was increased and the level of GSH was decreased,and MT i.p.1～10 mg*kg-1day-1 for 7 days was capable of reducing the level of MDA and increasing the level of GSH.It is considered that this effect of MT is likely to be one of its anti-aging mechanisms.
, 百拇医药
Key words melatonin；L-glutamate;radical;aging
近期有学者提出，衰老动物脑中兴奋性神经递质——谷氨酸的含量升高，从而激活N-甲基-D-天门冬氨酸受体(NMDA受体)，细胞外Ca2+内流，细胞内Ca2+超载产生大量自由基，导致神经系统损伤，最终引起多方面衰老体征的出现〔1〕.本实验采用体内、外两种实验方法研究谷氨酸对鼠脑组织中过氧化脂质及还原型谷胱甘肽(GSH)含量的影响，以了解动物脑内兴奋性神经递质——谷氨酸的作用性质，进而探索MT对其对抗效果，为阐明MT的抗衰老作用机制提供一定的依据.
1 材料与动物
谷氨酸(批号980801)，硫代巴比妥酸(TBA,批号920620)，均为上海试剂二厂产品；5-磺基水杨酸(批号930617)，北京化学试剂二厂产品；DTNB，Fluka产品；721分光光度计，上海第三分析仪器厂.雄性SD大鼠，5～6周龄；昆明种小白鼠，18～22g，雌雄兼用，均由沈阳药科大学动物室提供(合格证号：辽实合字033号).
, 百拇医药
2 方法与结果
2.1 谷氨酸对脑匀浆中MDA含量的影响及MT的对抗作用
取SD大鼠全脑，用pH7.4的磷酸缓冲溶液制成10%的脑匀浆.取1 mL脑匀浆5份，第一份为对照组，其余4份各加入不同浓度的谷氨酸1 mL，终体积2 mL，37℃温育1 h，取出，冰浴终止反应.以TBA法〔2〕测定其中MDA的含量.结果如图1所示.在脑匀浆中加入1.5、2.9、5.9及11.7 mmol/L浓度的谷氨酸，除最低剂量作用不显著外，其余剂量均可显著增加脑匀浆中MDA的含量(P<0.05和P<0.001)，且加入的谷氨酸浓度越大，MDA的含量越高.
L-glutamate concentration/mmol.l-1
, 百拇医药
Fig.1 The effect of L-glutamate on the level of MDA in homogenates from the rat′s brain
n=10；***P<0.001；*P<0.05
在加入11.7 mmol/L浓度谷氨酸的大鼠脑匀浆中同时加入不同浓度的MT，温育，实验方法同上.由表1的结果可见，1 mmol/L和10 mmol/L的MT均可明显抑制谷氨酸所致大鼠脑匀浆中MDA含量的增加.
Tab.1 The effect of MT on the level of MDA in the rat′s brain homogenates induced by L-glutamate Group
Dose/mmol.L-1
, 百拇医药
MDA/nmol.mg-1tissue
Control
—
654.36±55.85
L-glutamate
—
857.44±47.38###
L-glutamate+MT
0.1
826.41±49.36
L-glutamate+MT
, 百拇医药
1
764.35±52.74***
L-glutamate+MT
10
592.31±22.0***
n=10；＃ ＃ ＃P<0.001 vs control group；***P<0.001 vs L-glutamate group2.2 小鼠侧脑室内注射谷氨酸对MDA和GSH含量的影响及MT的对抗作用
小鼠40只，随机分为4组，空白组、谷氨酸低剂量(50 μg/只)组、谷氨酸中剂量(100 μg/只)组、谷氨酸高剂量(200 μg/只)组；侧脑室内注射谷氨酸给药体积为20 μL/只，1.5 h后处死小鼠，取全脑，用pH7.4的磷酸缓冲溶液制成10%的匀浆.以TBA法〔2〕测定其中MDA的含量(图2)；可以看出，给小鼠脑室注射50 μL、100 μL及200 μg的谷氨酸后可使其脑内MDA的含量非常显著升高(P<0.01)；以DTNB法〔3〕测GSH的含量(图3)，结果表明，不同剂量的谷氨酸也可使脑内具有清除自由基作用的GSH含量下降.
, 百拇医药
Fig.2 The effect of L-glutamate on the level of MDA in the whole brains of mice
n=10；*P<0.05， **P<0.01， ***P<0.001 vs control group
Fig.3 The effect of L-glutamate on content of GSH in the whole brains of mice
n=10；*P<0.05， **P<0.01 vs control group
, 百拇医药 为探索MT对谷氨酸作用的影响，预先给小鼠腹腔注射1 mg/kg和10 mg/kg的MT 7 d，再侧脑室注射谷氨酸(200 μg/只),可见两种剂量的MT均明显抑制谷氨酸引起的脑内MDA含量的升高及GSH含量的降低；表明MT对谷氨酸的毒性有明显的对抗作用.结果见表2.
Tab.2 The effect of MT on the level of MDA and GSH in the whole brains of the mice induced by L-glutamate Group
n
Dose/mg.kg-1.d-1×d
MDA nmol.mg-1 tissue
, http://www.100md.com
GSH μmol.g-1 tissue
Control
10
—
509.94±96.47
6.101±0.464
L-Glu
9
—
942.69±85.45＃ ＃ ＃
5.000±0.290＃＃＃
, 百拇医药
L-Glu+MT
8
1×7
826.92±93.72*
6.234±0.715***
L-Glu+MT
8
10×7
719.42±170.90**
5.828±0.407***
＃ ＃ ＃P<0.001 vs control group；***P<0.05，P<0.01 vs L-glutamate group
, 百拇医药
3 讨论
谷氨酸是中枢神经系统中一种重要的神经递质.研究证明，机体衰老时，脑内谷氨酸含量升高〔4〕，常渐进性的导致神经元衰亡.关于此作用的机制，有学者研究认为，过量的谷氨酸持续激活N-甲基-D-天门冬氨酸受体(NMDA受体)，从而使受体调控的钙通道开放，细胞外Ca2+大量内流，造成细胞内钙[Ca2+]i增高，Ca2+与钙调蛋白(CaM)偶联并结合于胞浆中一氧化氮合成酶(NOS)上相应的结合位点，在还原型尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)等辅助因子协同下进而激活NOS，催化L-精氨酸(L-Arg)氧化生成瓜氨酸和NO〔5〕.近来，大量体内、外实验证明NO参与介导Glu的神经毒性〔〔6〕，一方面，它与O-2反应生成过氧化硝基阴离子(ONOO-)，以及继发链式反应生成毒性更强的NO2、OH，使神经细胞受损直至死亡；另外，NO还可能通过：(1)影响细胞的能量代谢，损害其能量平衡；(2)作为一种活泼的氧化剂，破坏细胞内氧化与抗氧化的平衡状态；(3)造成细胞核内DNA损伤及致突变作用等途径介导细胞凋亡〔7〕.如脑组织中一些特殊神经元被损伤，其功能丧失可加速衰老进程〔1〕.因此，学者们认为谷氨酸的增多与衰老有密切联系，大致可概括为：谷氨酸-自由基-衰老〔1〕.
, 百拇医药
近年来的许多研究显示，松果腺分泌的MT是一种天然的抗衰老物质〔8〕.如果切除松果腺使MT分泌减少，则衰老过程加快，而补充外源性MT可显著延长动物寿命〔9〕.本实验结果表明，谷氨酸在体内、外均可增高鼠脑组织的MDA含量，并使其GSH含量下降，使脑组织受损；而MT能抑制谷氨酸引起的脑组织MDA含量增加，拮抗谷氨酸导致的GSH含量下降，从而降低谷氨酸的毒性.如前所述，过量的谷氨酸可诱发多种自由基的产生；我们的前期工作及有关文献报道表明，MT的分子量比较小，具有较高脂溶性，易通过血脑屏障发挥直接清除自由基的作用，此外，它还能提高脑内GSH含量，间接的对抗自由基的影响.〔10〕因此，MT具有清除自由基及增加脑内GSH含量的功能可能是MT对抗谷氨酸毒性的原因之一.另一方面，MT可能拮抗NMDA受体介导的Ca2+内流，减少NO及自由基的产生，进而减轻Glu对脑组织的损伤〔11〕.但这方面的研究尚少，需进一步深入探讨.
综上所述，MT可有效地对抗谷氨酸所致MDA的生成.根据谷氨酸与衰老学说，这一作用可能是MT抗衰老的一系列机制之一.
, 百拇医药
基金项目:国家自然科学基金资助项目，编号：39570820
参考文献
1 Poeggeler B,Reiter RJ,Tan DX，et al.Melatonin,hydroxyl radical-mediated oxidative damage,and aging：Ahypothesis.J Pineal Res，1993，14(2)：151～168
2 向荣，王鼎年.过氧化脂质硫代巴比妥酸分光光度法的改进.生物化学与生物物理进展，1990，17(3)：241～242
3 陈重阳，唐祖年，梁荣感.青蒿琥酯对正常及脏脏毒物中毒小鼠肝脏谷胱甘肽影响.中国药理学通报，1993，9(1)：52～55
4 Meldrum B,Garthqaite J.Excitotarory amino acid neurotoxicity and neurodegenerative disease.TINS,1990，11(3)：379～384
, http://www.100md.com
5 许生坤.NMDA-Ca2+-NO路径与中枢神经系统.国外医学生理、病理科学与临床，1997；17(2)：136～138
6 林凌，周峰泉，汤国枝.谷氨酸诱导体外培养的鸡胚脊髓神经细胞释放NO.药学学报，1997，32(1)：19～22
7 焦鸿丽，杨和平，杨永宇.一氧化氮介导的细胞凋亡.国外医学生理、病理科学与临床，1997，17(2)：134～136
8 Pierpaoli W,Maestroni GJM.Melatonin:a principal neuroimmunoregulatory and anti-stress hormone:its anti-aging effects.Immunology Letters,1987，16(4)：355～361
9 Armstrong S M,Redman JR.Melatonin:A chronobiotic with anti-aging properties.Medical Hypotheses,1991，(34)：300～309
10 周向华，李经才.褪黑素抗自由基作用及其机制.中国药理学通报，1997，15(1)：24～27
11 张朝晖，徐国钧，徐珞珊.五种海马提取物对L-谷氨酸致大鼠神经元钙内流的拮抗作用.中国海洋药物杂志，1994，52(4)：6～8
收稿日期:1999-10-18
, 百拇医药
单位：李经才 杨红英(沈阳药科大学药学系，沈阳 110015)
关键词：褪黑素；谷氨酸；自由基；衰老
沈阳药科大学学报000315 摘 要 用体内及体外两种实验方法，研究了谷氨酸对鼠脑组织中过氧化脂质及还原型谷胱甘肽含量的影响，以及施用褪黑素(MT)后对谷氨酸的对抗作用.结果表明，在体外，不同浓度的谷氨酸(2.9～11.7 mmol/L)均能显著提高大鼠脑匀浆中丙二醛(MDA)的含量；而加入MT(1～10 mmol/L)，可显著的对抗这种升高.体内实验，小鼠侧脑室给予不同浓度的谷氨酸可显著升高全脑组织中丙二醛(MDA)的含量及降低还原型谷胱甘肽的含量；如预先腹腔注射MT(1～10 mg.kg-1)，可显著对抗谷氨酸的影响.MT的这种作用可能是其抗衰老的机制之一.
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分类号 R96
The Inhibitory Effect of Melatonin on the Level of MDA in the Animal′s Brain Induced by L-Glutamate
Yang Hongying,Li Jinagcai,Liu Yujuan,Fu Ailing,Zhang Ruoming
Department of Pharmacy,Shenyang Pharmaceutical University,Shenyang 110015
Abstract The level of MDA in the brain induced by L-glutamate and the inhibitory effect of melatonin were studied in vitro and in vivo.The results indicated that,in vitro,the L-glutamate of different concentrations(2.9～11.7 mmol*L-1)was capable of remarkedly increasing and MT(1～10 mmol*L-1) added together with L-glutamate was capable of remarkedly reducing the level of MDA in homogenates of the rat′s whole brain; in vivo，the L-glutamate of different doses(50～200 μg*mice-1)were injected(i.c.v.)into the mice,then the level of MDA was increased and the level of GSH was decreased,and MT i.p.1～10 mg*kg-1day-1 for 7 days was capable of reducing the level of MDA and increasing the level of GSH.It is considered that this effect of MT is likely to be one of its anti-aging mechanisms.
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Key words melatonin；L-glutamate;radical;aging
近期有学者提出，衰老动物脑中兴奋性神经递质——谷氨酸的含量升高，从而激活N-甲基-D-天门冬氨酸受体(NMDA受体)，细胞外Ca2+内流，细胞内Ca2+超载产生大量自由基，导致神经系统损伤，最终引起多方面衰老体征的出现〔1〕.本实验采用体内、外两种实验方法研究谷氨酸对鼠脑组织中过氧化脂质及还原型谷胱甘肽(GSH)含量的影响，以了解动物脑内兴奋性神经递质——谷氨酸的作用性质，进而探索MT对其对抗效果，为阐明MT的抗衰老作用机制提供一定的依据.
1 材料与动物
谷氨酸(批号980801)，硫代巴比妥酸(TBA,批号920620)，均为上海试剂二厂产品；5-磺基水杨酸(批号930617)，北京化学试剂二厂产品；DTNB，Fluka产品；721分光光度计，上海第三分析仪器厂.雄性SD大鼠，5～6周龄；昆明种小白鼠，18～22g，雌雄兼用，均由沈阳药科大学动物室提供(合格证号：辽实合字033号).
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2 方法与结果
2.1 谷氨酸对脑匀浆中MDA含量的影响及MT的对抗作用
取SD大鼠全脑，用pH7.4的磷酸缓冲溶液制成10%的脑匀浆.取1 mL脑匀浆5份，第一份为对照组，其余4份各加入不同浓度的谷氨酸1 mL，终体积2 mL，37℃温育1 h，取出，冰浴终止反应.以TBA法〔2〕测定其中MDA的含量.结果如图1所示.在脑匀浆中加入1.5、2.9、5.9及11.7 mmol/L浓度的谷氨酸，除最低剂量作用不显著外，其余剂量均可显著增加脑匀浆中MDA的含量(P<0.05和P<0.001)，且加入的谷氨酸浓度越大，MDA的含量越高.
L-glutamate concentration/mmol.l-1
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Fig.1 The effect of L-glutamate on the level of MDA in homogenates from the rat′s brain
n=10；***P<0.001；*P<0.05
在加入11.7 mmol/L浓度谷氨酸的大鼠脑匀浆中同时加入不同浓度的MT，温育，实验方法同上.由表1的结果可见，1 mmol/L和10 mmol/L的MT均可明显抑制谷氨酸所致大鼠脑匀浆中MDA含量的增加.
Tab.1 The effect of MT on the level of MDA in the rat′s brain homogenates induced by L-glutamate Group
Dose/mmol.L-1
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MDA/nmol.mg-1tissue
Control
—
654.36±55.85
L-glutamate
—
857.44±47.38###
L-glutamate+MT
0.1
826.41±49.36
L-glutamate+MT
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1
764.35±52.74***
L-glutamate+MT
10
592.31±22.0***
n=10；＃ ＃ ＃P<0.001 vs control group；***P<0.001 vs L-glutamate group2.2 小鼠侧脑室内注射谷氨酸对MDA和GSH含量的影响及MT的对抗作用
小鼠40只，随机分为4组，空白组、谷氨酸低剂量(50 μg/只)组、谷氨酸中剂量(100 μg/只)组、谷氨酸高剂量(200 μg/只)组；侧脑室内注射谷氨酸给药体积为20 μL/只，1.5 h后处死小鼠，取全脑，用pH7.4的磷酸缓冲溶液制成10%的匀浆.以TBA法〔2〕测定其中MDA的含量(图2)；可以看出，给小鼠脑室注射50 μL、100 μL及200 μg的谷氨酸后可使其脑内MDA的含量非常显著升高(P<0.01)；以DTNB法〔3〕测GSH的含量(图3)，结果表明，不同剂量的谷氨酸也可使脑内具有清除自由基作用的GSH含量下降.
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Fig.2 The effect of L-glutamate on the level of MDA in the whole brains of mice
n=10；*P<0.05， **P<0.01， ***P<0.001 vs control group
Fig.3 The effect of L-glutamate on content of GSH in the whole brains of mice
n=10；*P<0.05， **P<0.01 vs control group
, 百拇医药 为探索MT对谷氨酸作用的影响，预先给小鼠腹腔注射1 mg/kg和10 mg/kg的MT 7 d，再侧脑室注射谷氨酸(200 μg/只),可见两种剂量的MT均明显抑制谷氨酸引起的脑内MDA含量的升高及GSH含量的降低；表明MT对谷氨酸的毒性有明显的对抗作用.结果见表2.
Tab.2 The effect of MT on the level of MDA and GSH in the whole brains of the mice induced by L-glutamate Group
n
Dose/mg.kg-1.d-1×d
MDA nmol.mg-1 tissue
, http://www.100md.com
GSH μmol.g-1 tissue
Control
10
—
509.94±96.47
6.101±0.464
L-Glu
9
—
942.69±85.45＃ ＃ ＃
5.000±0.290＃＃＃
, 百拇医药
L-Glu+MT
8
1×7
826.92±93.72*
6.234±0.715***
L-Glu+MT
8
10×7
719.42±170.90**
5.828±0.407***
＃ ＃ ＃P<0.001 vs control group；***P<0.05，P<0.01 vs L-glutamate group
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3 讨论
谷氨酸是中枢神经系统中一种重要的神经递质.研究证明，机体衰老时，脑内谷氨酸含量升高〔4〕，常渐进性的导致神经元衰亡.关于此作用的机制，有学者研究认为，过量的谷氨酸持续激活N-甲基-D-天门冬氨酸受体(NMDA受体)，从而使受体调控的钙通道开放，细胞外Ca2+大量内流，造成细胞内钙[Ca2+]i增高，Ca2+与钙调蛋白(CaM)偶联并结合于胞浆中一氧化氮合成酶(NOS)上相应的结合位点，在还原型尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)等辅助因子协同下进而激活NOS，催化L-精氨酸(L-Arg)氧化生成瓜氨酸和NO〔5〕.近来，大量体内、外实验证明NO参与介导Glu的神经毒性〔〔6〕，一方面，它与O-2反应生成过氧化硝基阴离子(ONOO-)，以及继发链式反应生成毒性更强的NO2、OH，使神经细胞受损直至死亡；另外，NO还可能通过：(1)影响细胞的能量代谢，损害其能量平衡；(2)作为一种活泼的氧化剂，破坏细胞内氧化与抗氧化的平衡状态；(3)造成细胞核内DNA损伤及致突变作用等途径介导细胞凋亡〔7〕.如脑组织中一些特殊神经元被损伤，其功能丧失可加速衰老进程〔1〕.因此，学者们认为谷氨酸的增多与衰老有密切联系，大致可概括为：谷氨酸-自由基-衰老〔1〕.
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近年来的许多研究显示，松果腺分泌的MT是一种天然的抗衰老物质〔8〕.如果切除松果腺使MT分泌减少，则衰老过程加快，而补充外源性MT可显著延长动物寿命〔9〕.本实验结果表明，谷氨酸在体内、外均可增高鼠脑组织的MDA含量，并使其GSH含量下降，使脑组织受损；而MT能抑制谷氨酸引起的脑组织MDA含量增加，拮抗谷氨酸导致的GSH含量下降，从而降低谷氨酸的毒性.如前所述，过量的谷氨酸可诱发多种自由基的产生；我们的前期工作及有关文献报道表明，MT的分子量比较小，具有较高脂溶性，易通过血脑屏障发挥直接清除自由基的作用，此外，它还能提高脑内GSH含量，间接的对抗自由基的影响.〔10〕因此，MT具有清除自由基及增加脑内GSH含量的功能可能是MT对抗谷氨酸毒性的原因之一.另一方面，MT可能拮抗NMDA受体介导的Ca2+内流，减少NO及自由基的产生，进而减轻Glu对脑组织的损伤〔11〕.但这方面的研究尚少，需进一步深入探讨.
综上所述，MT可有效地对抗谷氨酸所致MDA的生成.根据谷氨酸与衰老学说，这一作用可能是MT抗衰老的一系列机制之一.
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基金项目:国家自然科学基金资助项目，编号：39570820
参考文献
1 Poeggeler B,Reiter RJ,Tan DX，et al.Melatonin,hydroxyl radical-mediated oxidative damage,and aging：Ahypothesis.J Pineal Res，1993，14(2)：151～168
2 向荣，王鼎年.过氧化脂质硫代巴比妥酸分光光度法的改进.生物化学与生物物理进展，1990，17(3)：241～242
3 陈重阳，唐祖年，梁荣感.青蒿琥酯对正常及脏脏毒物中毒小鼠肝脏谷胱甘肽影响.中国药理学通报，1993，9(1)：52～55
4 Meldrum B,Garthqaite J.Excitotarory amino acid neurotoxicity and neurodegenerative disease.TINS,1990，11(3)：379～384
, http://www.100md.com
5 许生坤.NMDA-Ca2+-NO路径与中枢神经系统.国外医学生理、病理科学与临床，1997；17(2)：136～138
6 林凌，周峰泉，汤国枝.谷氨酸诱导体外培养的鸡胚脊髓神经细胞释放NO.药学学报，1997，32(1)：19～22
7 焦鸿丽，杨和平，杨永宇.一氧化氮介导的细胞凋亡.国外医学生理、病理科学与临床，1997，17(2)：134～136
8 Pierpaoli W,Maestroni GJM.Melatonin:a principal neuroimmunoregulatory and anti-stress hormone:its anti-aging effects.Immunology Letters,1987，16(4)：355～361
9 Armstrong S M,Redman JR.Melatonin:A chronobiotic with anti-aging properties.Medical Hypotheses,1991，(34)：300～309
10 周向华，李经才.褪黑素抗自由基作用及其机制.中国药理学通报，1997，15(1)：24～27
11 张朝晖，徐国钧，徐珞珊.五种海马提取物对L-谷氨酸致大鼠神经元钙内流的拮抗作用.中国海洋药物杂志，1994，52(4)：6～8
收稿日期:1999-10-18
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