视网膜感光细胞纯化方法的研究
作者：罗燕 唐仕波 林少芬 杨斌 郑湖玲
单位：510060 广州，中山医科大学中山眼科中心
关键词：纯感光细胞；准分子激光；酶消化；视网膜移植
眼科研究000303 摘要 目的探讨改进获取视网膜纯感光细胞的方法。方法应用改良的准分子激光切削法和酶分层消化法来分离纯化视网膜感光细胞层。结果由两种方法获取的视网膜组织片经苏木素-伊红染色均证实为单一的纯感光细胞层并保持生物活性。结论改良的准分子激光切削法和酶分层消化法均能获取视网膜纯感光细胞，且对细胞损伤小，内外节段保持完好，可为视网膜的移植创造条件。
分类号 R774
A study on the purification of retinal photoreceptors
, 百拇医药
Luo Yan，Tang Shibo，Lin Shaofen
(Zhongshan Ophthalmic Center，Sun Yat-sen University of Medical
Sciences，Guangzhou 510060)
Abstract：Objective：To investigate methods for isolation of the pure retinal photoreceptors.MethodsModified excimer laser surgery，regular excimer laser surgery， and enzyme gradation digestion were used to isolate retinal photoreceptors.The resulting retinal tissues were stained with hematoxylin-eosin(HE).Results：The retinal sheets obtained by these three methods each demonstrated a layer of pure photoreceptors by HE staining.Modified and regular excimer laser surgery could both precisely ablate retina.Modified excimer laser ablation obtained photoreceptor sheets with perfect inner and outer segment，while regular excimer laser ablation got photoreceptor sheets with impaired inner and outer segment.Enzyme gradation digestion could also result in photoreceptor sheets with good inner and outer segments，although there was non-precise digestion.Conclusion：Modified excimer laser surgery and enzyme gradation digestion can be used to obtain a layer of pure photoreceptors with good tissue preservation；specially perfect inner and outer segment.These cells may be a source for retinal transplantation.
, 百拇医药
Key words pure photoreceptors laser surgery enzyme digestion retinal transplantation
近10年来，视网膜移植的研究已取得了长足的进步，其中研究较多的是色素上皮细胞和感光细胞的移植。对感光细胞变性的眼病，移植纯的感光细胞则更有针对性，且更能正确对位移植，避免玫瑰花结构的形成。但是目前分离纯化和鉴定视网膜感光细胞仍存在一定的困难，获取视网膜纯感光细胞的方法主要有两种：组织细胞震动切削机切削法和准分子激光切削法。本研究比较了不同眼球来源的感光细胞的取材并改良了获取视网膜纯感光细胞的方法，结果报告如下。
1 材料与方法
1.1 材料来源
材料来源包括角膜移植后的成人眼球、治疗性引产的8～9个月胚胎人眼、屠宰场提供的猪眼、新西兰兔眼、成年SD大鼠眼，以上均在死后24h以内取材。
, 百拇医药
1.2 视网膜取材
在角巩缘后4mm处平行角膜缘环行剪开眼球，去除眼前节部分，用镊子将玻璃体剥除，钝性分离视网膜神经上皮层和色素上皮层，在视乳头处剪断，游离出完整的视网膜神经上皮层，置于D-Hank’s液中漂洗干净其上的色素及色素上皮细胞，按象限四分视网膜神经上皮层(SD大鼠的视网膜除外)。
1.3 感光细胞的分离和纯化
1.3.1 改良的准分子激光切削法：经过摸索，我们改进了准分子激光切削视网膜的过程，将人、兔、猪和鼠眼的视网膜神经上皮层的感光细胞层朝下平铺在35mm的塑料培养皿上，吸净培养皿中和视网膜表面的D-Hank’s液。选用波长为193nm的准分子激光仪(Keracor217型，美国CHIRON公司)。将瞄准指示光聚焦于所要切削的视网膜处，选调其工作参数：能量密度120mJ/cm2，频率50Hz，激光发射采用光性治疗性角膜切削术(phototherapeutic keratectomy，PTK)模式，切削直径3mm，切削深度在视网膜后极部为63～65μm。为了对比，我们同时参照国内外一些学者的方法[1，2]，即将视网膜平铺在20%的明胶托上，滴5%的明胶液(35℃)于明胶托上使视网膜漂浮起来，然后在5%的明胶重新凝固前迅速将其吸出，静置5min使视网膜牢固粘贴于20%的明胶托上，再用准分子激光作同样的切削。
, 百拇医药
1.3.2 酶分层消化法：即将视网膜神经上皮的内层用酶学方法消化去除，剩下纯的感光细胞层。将备用的人、兔、猪眼的视网膜感光细胞层朝上平铺在1mm×1mm孔径的不锈钢筛网上后，再放在玻璃培养皿中，靠近筛网加入含2.5%胰酶、0.4%EDTA和0.2%胶原酶的消化液刚好至筛网表面，利用筛网的蔓延作用使消化液全面接触朝下的视网膜内层，于37℃孵育约1h(胚眼组织则为45min)，其间在筛网下用消化液轻轻吹打视网膜内层3次，最后用含10%的胎牛血清的培养液终止酶的消化作用，并在筛网下面轻柔反复地吹打已消化松脱的视网膜神经上皮层的内层组织，收取筛网上的纯视网膜感光细胞层。
1.4 HE标本制作
小心仔细地将上述方法所得的菲薄的视网膜组织片(有明胶固定的组织片连同明胶一起)置于10%的中性缓冲福尔马林液固定、系列梯度酒精脱水、石蜡包埋、切片、苏木素-伊红染色(hematoxylin-eosin，HE)、光镜下观察。
, 百拇医药
2 结果
由改良的准分子激光切削法和酶分层消化法获取的视网膜组织片经苏木素-伊红染色，并与正常的视网膜标本进行对照，结果均显示为单一的纯感光细胞层并具有内外节段，可用于视网膜纯感光细胞移植研究中。改良的准分子激光切削法能精确地切削去除视网膜内8层结构，只剩下完整的外核层即感光细胞胞核所在(图1)，且锥杆细胞的内外节段保持良好(箭头所示)。本研究发现人、兔、猪和鼠眼材料来源的视网膜所用的激光切削参数都相同，视网膜后极部血管分布区的切削深度为63～65μm，这与Dowling[3]报道的大多数脊椎动物视网膜的结构和厚度都基本一致的理论相符，切削参数的确定也极大方便日后进行多种种属视网膜感光细胞移植供体的取材。酶分层消化法虽不能精确地将视网膜消化至只剩完整的外核层，但也可得数量较多的感光细胞(图2)，也仍具较好的内外节段(箭头所示)。各种材料来源的视网膜所用酶的浓度和作用时间也都相同，但胚眼组织消化时间则可短些，因为胚胎组织细胞间的连接较成年组织的疏松。而所用明胶粘贴固定的视网膜经激光切削后同样可获得纯感光细胞层(图3)，但其内外节段因接触粘附在明胶中，已模糊不清，无法辨认，明显受损(箭头所示)。(图1～3见237页)
, 百拇医药
3 讨论
分离出足够数量和纯的感光细胞以替代患眼功能不全或已遭破坏的感光细胞是视网膜感光细胞移植最关键的第一步。为使移植细胞能更好发育和存活，分离时应尽可能减少对细胞的损伤。早在1988年Townes-Anderson等[4]就用酶分离的方法获得兔视网膜的视杆细胞，但此法所得的是视网膜多种细胞的混悬液，且也破坏了感光细胞层的正常组织结构和细胞极性，感光细胞活性差。
最近国内外已有用准分子激光更精确地切削视网膜，获得成片纯感光细胞的报道[1，2]，但他们都是用明胶作为包埋粘贴剂，移植时连同明胶一起移植到视网膜下腔，这样获取的感光细胞，从本文结果看内外节段大多受损，而且妨碍了感光细胞和色素上皮细胞的尽快接触，不利于感光细胞移植后的存活和功能恢复。
另外，还有人采用组织细胞震动切削机切削法从视网膜上获取纯感光细胞层[5～7]。同样利用两种不同浓度的明胶来包埋粘贴固定待切削的外核层朝下的视网膜片，再用组织细胞震动切削机以20～60μm的厚度切削视网膜，直至切下的组织用美蓝染色后在显微镜下检查证实刚达感光细胞层为止。此法除存在与常规准分子激光切削用明胶作为包埋粘贴剂的缺点外，其操作繁琐、耗时，且震荡切削力对感光细胞也可能造成较严重的损伤[8]。
, 百拇医药
本研究中我们利用视网膜结构层次分明的特点和不锈钢筛网为视网膜薄片的支架，经反复摸索酶的浓度和作用时间，首次提出了酶分层消化法可获得纯视网膜感光细胞。这种方法操作时间较长，但对仪器设备要求不高，费用低，在不具备准分子激光仪的条件下值得推广应用。我们改良的准分子激光切削法省略了明胶粘贴固定的复杂程序，并避免了明胶粘固对内外节段的破坏，所得的视网膜感光细胞层植片具有完好的内外节段，且没有明胶粘附，植入到视网膜下腔后，可立即与色素上皮细胞正常接触，便于移植感光细胞功能的恢复与发挥。改良的准分子激光切削法在简化操作步骤、缩短操作时间及减少细胞的破坏等方面较常规的准分子激光切削法有显著的改善。
本研究两种方法所获得的视网膜感光细胞的内外节段仍存在，提示其所受损伤较小，为视网膜的移植创造了条件，至于其进一步的功能状况及生物学活性，我们目前正在研究中。
, 百拇医药
图1 改良的准分子激光切削法获取的感光细胞组织片，箭头示完好的内外节段(HE×400) 图2 酶分层消化法获取的感光细胞组织片，箭头示较好的外节段(HE×400) 图3 常规明胶粘固的视网膜经激光切削后的感光细胞组织片，箭头示受损的外节段(HE×400) Fig.1 Photoreceptor sheets ablated by modified excimer laser
surgery arrows indicate photoreceptors with perfect inner and outer segment(HE×400) Fig.2 Photoreceptor sheets obtained by enzyme gradation digestion
arrows indicate photoreceptors with good inner and outer segment(HE×400) Fig.3 Photoreceptor sheets ablated by regular excimer laser
, 百拇医药
surgery arrows indicate photoreceptors with impaired inner and outer segment(HE×400)
本课题获国家自然科学基金基金编号：39770790及广东省自然科学基金基金编号：950329资助
1，马美云，王薇，陈越国，等.准分子激光切削视网膜板层移植术.中华眼底病杂志，1998，14(4)∶209
2，Huang JC，Ishida M，Hersh P，et al.Preparation and transplantation of photoreceptor sheets.Curr Eye Res，1998，17(6)∶573
3，Dowling JE，著.吴淼鑫，杨雄里，译.视网膜.上海：上海医科大学出版社，1989.8-14
, http://www.100md.com
4，Townes-Anderson E，Dacheux RF，Raviola E.Rod photoreceptors dissociated from the adult rabbit retina.J Neurosci，1988，8(1)∶320
5，Silverman MS，Hughes SE.Transplantation of retinal photo-receptors to light-damaged retina.Invest Ophthalmmol Vis Sci，1989，30∶1684
6，姜德咏，高玲.视网膜移植抗原性的初步研究.中华眼底病杂志，1997，13(4)∶234
7，Kaplan HJ，Tezel TH，Berger AS，et al.Human photoreceptor transplantation in retinitis pigmentosa.Arch Ophthalmol，1997，115∶1168
8，Tezel TH，Kaplan HJ.Harvest and storage of adult human photoreceptor cells：the vibratome compared to the excimer laser.Curr Eye Res，1998，17(7)∶748
(收稿：1999-12-21), 百拇医药
单位：510060 广州，中山医科大学中山眼科中心
关键词：纯感光细胞；准分子激光；酶消化；视网膜移植
眼科研究000303 摘要 目的探讨改进获取视网膜纯感光细胞的方法。方法应用改良的准分子激光切削法和酶分层消化法来分离纯化视网膜感光细胞层。结果由两种方法获取的视网膜组织片经苏木素-伊红染色均证实为单一的纯感光细胞层并保持生物活性。结论改良的准分子激光切削法和酶分层消化法均能获取视网膜纯感光细胞，且对细胞损伤小，内外节段保持完好，可为视网膜的移植创造条件。
分类号 R774
A study on the purification of retinal photoreceptors
, 百拇医药
Luo Yan，Tang Shibo，Lin Shaofen
(Zhongshan Ophthalmic Center，Sun Yat-sen University of Medical
Sciences，Guangzhou 510060)
Abstract：Objective：To investigate methods for isolation of the pure retinal photoreceptors.MethodsModified excimer laser surgery，regular excimer laser surgery， and enzyme gradation digestion were used to isolate retinal photoreceptors.The resulting retinal tissues were stained with hematoxylin-eosin(HE).Results：The retinal sheets obtained by these three methods each demonstrated a layer of pure photoreceptors by HE staining.Modified and regular excimer laser surgery could both precisely ablate retina.Modified excimer laser ablation obtained photoreceptor sheets with perfect inner and outer segment，while regular excimer laser ablation got photoreceptor sheets with impaired inner and outer segment.Enzyme gradation digestion could also result in photoreceptor sheets with good inner and outer segments，although there was non-precise digestion.Conclusion：Modified excimer laser surgery and enzyme gradation digestion can be used to obtain a layer of pure photoreceptors with good tissue preservation；specially perfect inner and outer segment.These cells may be a source for retinal transplantation.
, 百拇医药
Key words pure photoreceptors laser surgery enzyme digestion retinal transplantation
近10年来，视网膜移植的研究已取得了长足的进步，其中研究较多的是色素上皮细胞和感光细胞的移植。对感光细胞变性的眼病，移植纯的感光细胞则更有针对性，且更能正确对位移植，避免玫瑰花结构的形成。但是目前分离纯化和鉴定视网膜感光细胞仍存在一定的困难，获取视网膜纯感光细胞的方法主要有两种：组织细胞震动切削机切削法和准分子激光切削法。本研究比较了不同眼球来源的感光细胞的取材并改良了获取视网膜纯感光细胞的方法，结果报告如下。
1 材料与方法
1.1 材料来源
材料来源包括角膜移植后的成人眼球、治疗性引产的8～9个月胚胎人眼、屠宰场提供的猪眼、新西兰兔眼、成年SD大鼠眼，以上均在死后24h以内取材。
, 百拇医药
1.2 视网膜取材
在角巩缘后4mm处平行角膜缘环行剪开眼球，去除眼前节部分，用镊子将玻璃体剥除，钝性分离视网膜神经上皮层和色素上皮层，在视乳头处剪断，游离出完整的视网膜神经上皮层，置于D-Hank’s液中漂洗干净其上的色素及色素上皮细胞，按象限四分视网膜神经上皮层(SD大鼠的视网膜除外)。
1.3 感光细胞的分离和纯化
1.3.1 改良的准分子激光切削法：经过摸索，我们改进了准分子激光切削视网膜的过程，将人、兔、猪和鼠眼的视网膜神经上皮层的感光细胞层朝下平铺在35mm的塑料培养皿上，吸净培养皿中和视网膜表面的D-Hank’s液。选用波长为193nm的准分子激光仪(Keracor217型，美国CHIRON公司)。将瞄准指示光聚焦于所要切削的视网膜处，选调其工作参数：能量密度120mJ/cm2，频率50Hz，激光发射采用光性治疗性角膜切削术(phototherapeutic keratectomy，PTK)模式，切削直径3mm，切削深度在视网膜后极部为63～65μm。为了对比，我们同时参照国内外一些学者的方法[1，2]，即将视网膜平铺在20%的明胶托上，滴5%的明胶液(35℃)于明胶托上使视网膜漂浮起来，然后在5%的明胶重新凝固前迅速将其吸出，静置5min使视网膜牢固粘贴于20%的明胶托上，再用准分子激光作同样的切削。
, 百拇医药
1.3.2 酶分层消化法：即将视网膜神经上皮的内层用酶学方法消化去除，剩下纯的感光细胞层。将备用的人、兔、猪眼的视网膜感光细胞层朝上平铺在1mm×1mm孔径的不锈钢筛网上后，再放在玻璃培养皿中，靠近筛网加入含2.5%胰酶、0.4%EDTA和0.2%胶原酶的消化液刚好至筛网表面，利用筛网的蔓延作用使消化液全面接触朝下的视网膜内层，于37℃孵育约1h(胚眼组织则为45min)，其间在筛网下用消化液轻轻吹打视网膜内层3次，最后用含10%的胎牛血清的培养液终止酶的消化作用，并在筛网下面轻柔反复地吹打已消化松脱的视网膜神经上皮层的内层组织，收取筛网上的纯视网膜感光细胞层。
1.4 HE标本制作
小心仔细地将上述方法所得的菲薄的视网膜组织片(有明胶固定的组织片连同明胶一起)置于10%的中性缓冲福尔马林液固定、系列梯度酒精脱水、石蜡包埋、切片、苏木素-伊红染色(hematoxylin-eosin，HE)、光镜下观察。
, 百拇医药
2 结果
由改良的准分子激光切削法和酶分层消化法获取的视网膜组织片经苏木素-伊红染色，并与正常的视网膜标本进行对照，结果均显示为单一的纯感光细胞层并具有内外节段，可用于视网膜纯感光细胞移植研究中。改良的准分子激光切削法能精确地切削去除视网膜内8层结构，只剩下完整的外核层即感光细胞胞核所在(图1)，且锥杆细胞的内外节段保持良好(箭头所示)。本研究发现人、兔、猪和鼠眼材料来源的视网膜所用的激光切削参数都相同，视网膜后极部血管分布区的切削深度为63～65μm，这与Dowling[3]报道的大多数脊椎动物视网膜的结构和厚度都基本一致的理论相符，切削参数的确定也极大方便日后进行多种种属视网膜感光细胞移植供体的取材。酶分层消化法虽不能精确地将视网膜消化至只剩完整的外核层，但也可得数量较多的感光细胞(图2)，也仍具较好的内外节段(箭头所示)。各种材料来源的视网膜所用酶的浓度和作用时间也都相同，但胚眼组织消化时间则可短些，因为胚胎组织细胞间的连接较成年组织的疏松。而所用明胶粘贴固定的视网膜经激光切削后同样可获得纯感光细胞层(图3)，但其内外节段因接触粘附在明胶中，已模糊不清，无法辨认，明显受损(箭头所示)。(图1～3见237页)
, 百拇医药
3 讨论
分离出足够数量和纯的感光细胞以替代患眼功能不全或已遭破坏的感光细胞是视网膜感光细胞移植最关键的第一步。为使移植细胞能更好发育和存活，分离时应尽可能减少对细胞的损伤。早在1988年Townes-Anderson等[4]就用酶分离的方法获得兔视网膜的视杆细胞，但此法所得的是视网膜多种细胞的混悬液，且也破坏了感光细胞层的正常组织结构和细胞极性，感光细胞活性差。
最近国内外已有用准分子激光更精确地切削视网膜，获得成片纯感光细胞的报道[1，2]，但他们都是用明胶作为包埋粘贴剂，移植时连同明胶一起移植到视网膜下腔，这样获取的感光细胞，从本文结果看内外节段大多受损，而且妨碍了感光细胞和色素上皮细胞的尽快接触，不利于感光细胞移植后的存活和功能恢复。
另外，还有人采用组织细胞震动切削机切削法从视网膜上获取纯感光细胞层[5～7]。同样利用两种不同浓度的明胶来包埋粘贴固定待切削的外核层朝下的视网膜片，再用组织细胞震动切削机以20～60μm的厚度切削视网膜，直至切下的组织用美蓝染色后在显微镜下检查证实刚达感光细胞层为止。此法除存在与常规准分子激光切削用明胶作为包埋粘贴剂的缺点外，其操作繁琐、耗时，且震荡切削力对感光细胞也可能造成较严重的损伤[8]。
, 百拇医药
本研究中我们利用视网膜结构层次分明的特点和不锈钢筛网为视网膜薄片的支架，经反复摸索酶的浓度和作用时间，首次提出了酶分层消化法可获得纯视网膜感光细胞。这种方法操作时间较长，但对仪器设备要求不高，费用低，在不具备准分子激光仪的条件下值得推广应用。我们改良的准分子激光切削法省略了明胶粘贴固定的复杂程序，并避免了明胶粘固对内外节段的破坏，所得的视网膜感光细胞层植片具有完好的内外节段，且没有明胶粘附，植入到视网膜下腔后，可立即与色素上皮细胞正常接触，便于移植感光细胞功能的恢复与发挥。改良的准分子激光切削法在简化操作步骤、缩短操作时间及减少细胞的破坏等方面较常规的准分子激光切削法有显著的改善。
本研究两种方法所获得的视网膜感光细胞的内外节段仍存在，提示其所受损伤较小，为视网膜的移植创造了条件，至于其进一步的功能状况及生物学活性，我们目前正在研究中。
, 百拇医药
图1 改良的准分子激光切削法获取的感光细胞组织片，箭头示完好的内外节段(HE×400) 图2 酶分层消化法获取的感光细胞组织片，箭头示较好的外节段(HE×400) 图3 常规明胶粘固的视网膜经激光切削后的感光细胞组织片，箭头示受损的外节段(HE×400) Fig.1 Photoreceptor sheets ablated by modified excimer laser
surgery arrows indicate photoreceptors with perfect inner and outer segment(HE×400) Fig.2 Photoreceptor sheets obtained by enzyme gradation digestion
arrows indicate photoreceptors with good inner and outer segment(HE×400) Fig.3 Photoreceptor sheets ablated by regular excimer laser
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surgery arrows indicate photoreceptors with impaired inner and outer segment(HE×400)
本课题获国家自然科学基金基金编号：39770790及广东省自然科学基金基金编号：950329资助
1，马美云，王薇，陈越国，等.准分子激光切削视网膜板层移植术.中华眼底病杂志，1998，14(4)∶209
2，Huang JC，Ishida M，Hersh P，et al.Preparation and transplantation of photoreceptor sheets.Curr Eye Res，1998，17(6)∶573
3，Dowling JE，著.吴淼鑫，杨雄里，译.视网膜.上海：上海医科大学出版社，1989.8-14
, http://www.100md.com
4，Townes-Anderson E，Dacheux RF，Raviola E.Rod photoreceptors dissociated from the adult rabbit retina.J Neurosci，1988，8(1)∶320
5，Silverman MS，Hughes SE.Transplantation of retinal photo-receptors to light-damaged retina.Invest Ophthalmmol Vis Sci，1989，30∶1684
6，姜德咏，高玲.视网膜移植抗原性的初步研究.中华眼底病杂志，1997，13(4)∶234
7，Kaplan HJ，Tezel TH，Berger AS，et al.Human photoreceptor transplantation in retinitis pigmentosa.Arch Ophthalmol，1997，115∶1168
8，Tezel TH，Kaplan HJ.Harvest and storage of adult human photoreceptor cells：the vibratome compared to the excimer laser.Curr Eye Res，1998，17(7)∶748
(收稿：1999-12-21), 百拇医药