反义核酸对人肺腺癌细胞多药耐药逆转的实验研究
作者：陈良安 刘又宁
单位：(中国人民解放军总医院呼吸科 100853 北京)
关键词：抗药性，多药；寡核苷酸类，反义；肺肿瘤
中华医学杂志000326 摘 要：目的 探讨反义核酸对人肺腺癌细胞多药耐药的逆转效果。方法 以mdr1cDNA -9—+6为靶位点，合成反义核酸(ATCCATCCCGACCTC)并用正义链作为对照(GAGGTCGGGATGGAT)，通过脂质体将其导入肺腺癌细胞A549/R，分别采用逆转录聚合酶链反应、流式细胞仪、罗丹明试验及药敏试验观察两组细胞的mdr1 mRNA、P糖蛋白(Pgp)表达、罗丹明的聚集和对阿霉素的敏感性。结果 反义核酸处理的细胞mdr1 mRNA下降51.2%，正义组细胞和对照组细胞无明显变化、反义组细胞Pgp含量明显降低，细胞内罗丹明聚集，反义组，正义组和对照组的阿霉素IC50分别为0.009 μg/ml、0.17 μg/ml和0.18 μg/ml。结论 反义核酸具有逆转人肺腺癌多药耐药的作用，其作用水平在mRNA或DNA水平，使Pgp的表达受到明显抑制，对阿霉素的敏感性明显提高。
, http://www.100md.com
Reversal of multidrug resistance in lung adenocarcinoma-resistant cell line A549/R by mdr1 antisense oligodeoxynucleotides in vitro
CHEN Liangan LIU Youning.
(Department of Pulmonary Medicine, General Hospital of PLA, Beijing 100853, China)
Abstract：Objective To investigate the possibility of reversion of multidrug resistance (MDR) in lung adenocarcinoma-resistant cell line A549/R by mdr1 antisense oligodeoxynucleotide. Methods A 15-mer phosphorothioate antisense oligodeoxynucleotide (ATCCATCCCGACCTC), complementary to -9～+6 in mdr1 cDNA sequence, was synthesized. Meanwhile, sense sequence (GAGGTCGGGATGGAT) was taken as control. Both antisense and sense oligodeoxynucleotides were transduced to A549/R cell line by lipofectin. The mdr1 mRNA, expression of Pgp, cellular rhodamine accumulation and sensitivity to daunorubicin were detected in antisense and sense oligodeoxynucleotides treated cells, using RT-PCR, flow cytometry, rhodamine test and MTT method. Results Treatment with antisense oligodeoxynucleotide in A549/R cells led to a decrease in mdr1 mRNA and Pgp expression, an increase in rhodamine cellular accumulation, and a 20-fold increase of sensitivity to doxorubicin compared with those treated with sense oligodeoxynucleotide or control cells. Conclusion The mdr1 antisense oligodeoxynucleotide possesses an effect of reversing MDR in lung adenocarcinoma-resistant cell A549/R by inhibiting mdr1 transcription and Pgp expression.
, 百拇医药
Key words：Resistance, multidrug; Antisense oligodeoxynucleotide; Lung neoplasms
多药耐药(multidrug resistance, MDR)是肿瘤化疗的重大障碍。从分子生物学理解MDR的形成过程是mdr1基因-转录→mdr1 mRNA-翻译→P糖蛋白(Pgp)→MDR表型。传统的MDR逆转剂都是作用在Pgp水平，效率较低，副作用大。近年发展起来的反义技术为MDR的逆转提供了新的策略[1]。使我们从分子水平在MDR形成的最上游来阻止MDR的发生成为可能，也为从基因水平逆转MDR展示了良好的前景。
材料与方法
一、主要试剂
Pgp抗体、罗丹明(中山公司)、聚合酶链反应(PCR)，逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)试剂盒(鼎国公司)、噻唑蓝(SIGMA公司)，反义核酸(反义链：ATCCATCCCGACCTC，正义链：GAGGTCGGGATGGAT)由塞百盛生物工程公司合成并硫代磷酸修饰、对阿霉素耐药肺腺癌细胞系A549/R(第三军医大学)，脂质体(美国GIBCO公司)。
, 百拇医药
二、方法
1.DNA、RNA提取：PCR、RT-PCR按常规方法进行。
2.反义核酸的细胞转导：细胞以4×104/孔接种24孔培养板，并将其分为反义、正义、对照3组，待其生长至70%～80%汇合时开始转染。所用反义和正义核苷酸量分别为10 μg/孔，脂质体6 μg/孔。孵育12 h后换用常规培养液，间隔12 h再转染一次，连续3 d。
3.反义核酸和脂质体的细胞毒性检测：以2×104细胞/孔种于96孔板，37℃，5% CO2孵育12 h，细胞贴壁后，用无血清1640细胞培养液洗2次，加入反义核苷酸或正义链核苷酸(10 μg/ml)或脂质体(6 μl/ml)作用12 h后，换成常规培养液，反复3次，共3天。每孔加入噻唑蓝20 μl(10 mg/ml)，37℃，5% CO2保温4 h，取出后，每孔加入200 μl二甲基亚砜，在酶标仪上570 nm测定吸收值，计算肿瘤细胞存活率。肿瘤细胞成活率=实验组570/对照组570×100%。
, 百拇医药
4.细胞mdr1表达检测：Pgp的流式细胞术检测、罗丹明试验按文献方法进行[2，3]。
5.药敏试验：将细胞数调整至3×104/ml，取96孔板，每孔加入200 μl细胞悬液，培养箱中过夜，去掉培养液，加入用PRMI 1640培养液配制的不同浓度的阿霉素溶液200 μl/孔，细胞培养箱中48 h后，每孔加入噻唑蓝20 μl(10 mg/ml)，保温4 h。弃上清，加入二甲基亚砜200 μl/孔，酶标仪上测出570 nm值，算出IC50，并作图。
结果
一、细胞A549/R的MDR特性
1.DNA水平：PCR在A549/R细胞扩增出mdr1基因片断(图1)，证明细胞内有mdr1基因存在。
, 百拇医药
M：分子量标准；1.阳性对照；2.阴性对照；3.A549/R细胞
图1 A549/R细胞mdr1基因片断
2.mRNA水平：RT-PCR证实A549/R有mdr1 mRNA(图2)，提示该细胞内已有mdr1基因转录。
M：分子量标准 1.阳性对照；2.阴性对照；3.对照组；4.反义组；5.正义组
图2 各组细胞MDR1 RT-PCR比较
3.Pgp水平：流式细胞术证明A549/R有Pgp的存在，提示该细胞有mdr1基因的表达(图3)。
, 百拇医药
图3 各组细胞Pgp表达比较
二、反义核酸及脂质体的细胞毒性作用
A549/R细胞经反义链、正义链和脂质体处理后细胞存活率分别为98%、96.5%和94%，提示反义、正义核苷酸及脂质体在本实验条件下其本身对肿瘤细胞未造成毒性作用，经反义核酸处理的肿瘤细胞对阿霉素敏感性的增加亦非反义核酸的细胞毒性作用所致，而是反义核酸对肿瘤细胞MDR逆转的结果。
三、反义核酸的MDR逆转作用
1.mRNA水平：RT-PCR和吸光度扫描提示，反义组细胞mdr1 mRNA下降51.2%，正义组细胞和对照组细胞无明显差异。
2.Pgp表达：图3可看出反义组细胞Pgp含量明显低于正义组细胞和对照组细胞，提示在反义组细胞Pgp表达受到抑制。
, 百拇医药
3.罗丹明试验：罗丹明是Pgp的特异性荧光底物，能被Pgp从细胞内泵出。3组细胞经罗丹明处理后，反义组荧光强度明显高于其他2组。提示反义组细胞由于Pgp减少，泵出罗丹明减少，细胞内罗丹明聚集(图4)。
图4 各组细胞罗丹明实验结果
4.药敏试验：反义组，正义组和对照组的IC50分别为0.009 μg/ml，0.17 μg/ml和0.18 μg/ml，提示反义组细胞对阿霉素敏感性增加。随阿霉素浓度增加，反义组细胞存活率明显低于另两组(图5)。
图5 各组细胞药敏曲线比较结果
讨论
, 百拇医药
mdr1基因是导致MDR最直接的原因之一，其结构特征是[4-6]：含有28个外显子，其启动子为CAAT，无TATA。转录起始点是TAG，其下游+5至+127的区域影响mdr1转录效率。Mdr1全长4.5 kb，仅有一个开放性阅读框架，编码1 280个氨基酸的Pgp。后者为相对分子质量170 000的糖蛋白分子。整个肽链有6对疏水区、使其嵌在细胞膜内，还有两个ATP结合位点。它能通过消耗ATP能量将细胞内药物排出胞外，降低细胞内药物浓度，增加对药物的抗性。
传统MDR逆转剂作用于Pgp水平，效率低，除对Pgp功能产生影响外，还有许多严重的非特异性作用，并可影响具有Pgp表达的正常组织细胞的功能，难以应用于临床。反义核酸技术给肺癌的MDR逆转提供了新的策略并展示了广阔的前景。其基本原理是通过碱基配对特异性地与某些DNA或RNA结合，阻止其复制、转录和翻译，从而达到封闭基因和抑制表达的作用。用反义技术逆转MDR的作用点在Pgp以上水平，可以把MDR消灭在“萌芽”状态。具有高效率、高特异性。
, 百拇医药
本课题证实了mdr1基因的表达是肺腺癌细胞株A549/R MDR形成的重要原因，随即根据mdr1基因序列和mdr1转录图谱设计了反义核酸序列：ATCCATCCCGACCTC。该序列是跨越内含子与开放性阅读框架起始部分的一段互补反义DNA片断(mdr1 DNA -9—+6)。而转录起始点及其上游的一段非编码区正是影响mdr1转录的敏感区。在该位点结合上一段反义链就可有效地抑制转录。我们的实验结果证实了该序列的效果，也许可作为以后肺腺癌MDR逆转反义核酸序列的参考。
反义核酸对基因表达抑制作用有剂量依赖性趋势。这就要求提高和保持细胞内反义核酸的浓度。我们将反义核酸进行了整链的硫代磷酸修饰，使它可以抵抗核酸酶的攻击而不致降解，又可保持对靶基因的特异性结合。另外，采用脂质体包埋来促进细胞对反义核酸的摄取，取得了较好的效果。
本结果表明，经反义核酸处理的细胞内mdr1 mRNA和细胞的Pgp表达明显低于正义链和对照组，罗丹明试验提示反义核酸处理的细胞内罗丹明明显聚集，药敏试验提示对抗癌药的敏感性提高20倍。而反义核酸和脂质体在我们的实验条件下其本身未对A549细胞产生毒性作用。说明反义核酸具有明显的逆转肺癌MDR的作用，其作用水平在mRNA或DNA水平，使Pgp的表达受到明显抑制。
, 百拇医药
参考文献：
1 Bouffard DY, Ohkawa T, Kijima H. Oligonucleotide modulation of multidrug resistance. Eur J Cancer, 1996,32A：1010-1018.
2 鄂征.组织培养和分子细胞学技术.分子细胞技术.在研究中的应用.第1版.北京：北京出版社，1995，436-441.
3 杨景山.医学细胞化学与细胞生物技术.第1版.北京：北京医科大学，中国协和医科大学联合出版社，1990，381-410.
4 Roninson IB, Abelson HT, Housman DE, et al. Amplification of specific DNA sequence correlates with MDR in Chinese hamster cell. Nature, 1984,309：626-628.
5 Gros P, Neriah YB, Croop JM, et al. Isolation and expression of a complementary DNA that confers multidrug resistance. Nature, 1986,323：728-731.
6 Gottesman MM, Hrycyna CA. Genetic analysis of the multidrug transpoter. Annu Rev Genet, 1995,29：607-649.
收稿日期：1999-05-06, 百拇医药
单位：(中国人民解放军总医院呼吸科 100853 北京)
关键词：抗药性，多药；寡核苷酸类，反义；肺肿瘤
中华医学杂志000326 摘 要：目的 探讨反义核酸对人肺腺癌细胞多药耐药的逆转效果。方法 以mdr1cDNA -9—+6为靶位点，合成反义核酸(ATCCATCCCGACCTC)并用正义链作为对照(GAGGTCGGGATGGAT)，通过脂质体将其导入肺腺癌细胞A549/R，分别采用逆转录聚合酶链反应、流式细胞仪、罗丹明试验及药敏试验观察两组细胞的mdr1 mRNA、P糖蛋白(Pgp)表达、罗丹明的聚集和对阿霉素的敏感性。结果 反义核酸处理的细胞mdr1 mRNA下降51.2%，正义组细胞和对照组细胞无明显变化、反义组细胞Pgp含量明显降低，细胞内罗丹明聚集，反义组，正义组和对照组的阿霉素IC50分别为0.009 μg/ml、0.17 μg/ml和0.18 μg/ml。结论 反义核酸具有逆转人肺腺癌多药耐药的作用，其作用水平在mRNA或DNA水平，使Pgp的表达受到明显抑制，对阿霉素的敏感性明显提高。
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Reversal of multidrug resistance in lung adenocarcinoma-resistant cell line A549/R by mdr1 antisense oligodeoxynucleotides in vitro
CHEN Liangan LIU Youning.
(Department of Pulmonary Medicine, General Hospital of PLA, Beijing 100853, China)
Abstract：Objective To investigate the possibility of reversion of multidrug resistance (MDR) in lung adenocarcinoma-resistant cell line A549/R by mdr1 antisense oligodeoxynucleotide. Methods A 15-mer phosphorothioate antisense oligodeoxynucleotide (ATCCATCCCGACCTC), complementary to -9～+6 in mdr1 cDNA sequence, was synthesized. Meanwhile, sense sequence (GAGGTCGGGATGGAT) was taken as control. Both antisense and sense oligodeoxynucleotides were transduced to A549/R cell line by lipofectin. The mdr1 mRNA, expression of Pgp, cellular rhodamine accumulation and sensitivity to daunorubicin were detected in antisense and sense oligodeoxynucleotides treated cells, using RT-PCR, flow cytometry, rhodamine test and MTT method. Results Treatment with antisense oligodeoxynucleotide in A549/R cells led to a decrease in mdr1 mRNA and Pgp expression, an increase in rhodamine cellular accumulation, and a 20-fold increase of sensitivity to doxorubicin compared with those treated with sense oligodeoxynucleotide or control cells. Conclusion The mdr1 antisense oligodeoxynucleotide possesses an effect of reversing MDR in lung adenocarcinoma-resistant cell A549/R by inhibiting mdr1 transcription and Pgp expression.
, 百拇医药
Key words：Resistance, multidrug; Antisense oligodeoxynucleotide; Lung neoplasms
多药耐药(multidrug resistance, MDR)是肿瘤化疗的重大障碍。从分子生物学理解MDR的形成过程是mdr1基因-转录→mdr1 mRNA-翻译→P糖蛋白(Pgp)→MDR表型。传统的MDR逆转剂都是作用在Pgp水平，效率较低，副作用大。近年发展起来的反义技术为MDR的逆转提供了新的策略[1]。使我们从分子水平在MDR形成的最上游来阻止MDR的发生成为可能，也为从基因水平逆转MDR展示了良好的前景。
材料与方法
一、主要试剂
Pgp抗体、罗丹明(中山公司)、聚合酶链反应(PCR)，逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)试剂盒(鼎国公司)、噻唑蓝(SIGMA公司)，反义核酸(反义链：ATCCATCCCGACCTC，正义链：GAGGTCGGGATGGAT)由塞百盛生物工程公司合成并硫代磷酸修饰、对阿霉素耐药肺腺癌细胞系A549/R(第三军医大学)，脂质体(美国GIBCO公司)。
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二、方法
1.DNA、RNA提取：PCR、RT-PCR按常规方法进行。
2.反义核酸的细胞转导：细胞以4×104/孔接种24孔培养板，并将其分为反义、正义、对照3组，待其生长至70%～80%汇合时开始转染。所用反义和正义核苷酸量分别为10 μg/孔，脂质体6 μg/孔。孵育12 h后换用常规培养液，间隔12 h再转染一次，连续3 d。
3.反义核酸和脂质体的细胞毒性检测：以2×104细胞/孔种于96孔板，37℃，5% CO2孵育12 h，细胞贴壁后，用无血清1640细胞培养液洗2次，加入反义核苷酸或正义链核苷酸(10 μg/ml)或脂质体(6 μl/ml)作用12 h后，换成常规培养液，反复3次，共3天。每孔加入噻唑蓝20 μl(10 mg/ml)，37℃，5% CO2保温4 h，取出后，每孔加入200 μl二甲基亚砜，在酶标仪上570 nm测定吸收值，计算肿瘤细胞存活率。肿瘤细胞成活率=实验组570/对照组570×100%。
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4.细胞mdr1表达检测：Pgp的流式细胞术检测、罗丹明试验按文献方法进行[2，3]。
5.药敏试验：将细胞数调整至3×104/ml，取96孔板，每孔加入200 μl细胞悬液，培养箱中过夜，去掉培养液，加入用PRMI 1640培养液配制的不同浓度的阿霉素溶液200 μl/孔，细胞培养箱中48 h后，每孔加入噻唑蓝20 μl(10 mg/ml)，保温4 h。弃上清，加入二甲基亚砜200 μl/孔，酶标仪上测出570 nm值，算出IC50，并作图。
结果
一、细胞A549/R的MDR特性
1.DNA水平：PCR在A549/R细胞扩增出mdr1基因片断(图1)，证明细胞内有mdr1基因存在。
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M：分子量标准；1.阳性对照；2.阴性对照；3.A549/R细胞
图1 A549/R细胞mdr1基因片断
2.mRNA水平：RT-PCR证实A549/R有mdr1 mRNA(图2)，提示该细胞内已有mdr1基因转录。
M：分子量标准 1.阳性对照；2.阴性对照；3.对照组；4.反义组；5.正义组
图2 各组细胞MDR1 RT-PCR比较
3.Pgp水平：流式细胞术证明A549/R有Pgp的存在，提示该细胞有mdr1基因的表达(图3)。
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图3 各组细胞Pgp表达比较
二、反义核酸及脂质体的细胞毒性作用
A549/R细胞经反义链、正义链和脂质体处理后细胞存活率分别为98%、96.5%和94%，提示反义、正义核苷酸及脂质体在本实验条件下其本身对肿瘤细胞未造成毒性作用，经反义核酸处理的肿瘤细胞对阿霉素敏感性的增加亦非反义核酸的细胞毒性作用所致，而是反义核酸对肿瘤细胞MDR逆转的结果。
三、反义核酸的MDR逆转作用
1.mRNA水平：RT-PCR和吸光度扫描提示，反义组细胞mdr1 mRNA下降51.2%，正义组细胞和对照组细胞无明显差异。
2.Pgp表达：图3可看出反义组细胞Pgp含量明显低于正义组细胞和对照组细胞，提示在反义组细胞Pgp表达受到抑制。
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3.罗丹明试验：罗丹明是Pgp的特异性荧光底物，能被Pgp从细胞内泵出。3组细胞经罗丹明处理后，反义组荧光强度明显高于其他2组。提示反义组细胞由于Pgp减少，泵出罗丹明减少，细胞内罗丹明聚集(图4)。
图4 各组细胞罗丹明实验结果
4.药敏试验：反义组，正义组和对照组的IC50分别为0.009 μg/ml，0.17 μg/ml和0.18 μg/ml，提示反义组细胞对阿霉素敏感性增加。随阿霉素浓度增加，反义组细胞存活率明显低于另两组(图5)。
图5 各组细胞药敏曲线比较结果
讨论
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mdr1基因是导致MDR最直接的原因之一，其结构特征是[4-6]：含有28个外显子，其启动子为CAAT，无TATA。转录起始点是TAG，其下游+5至+127的区域影响mdr1转录效率。Mdr1全长4.5 kb，仅有一个开放性阅读框架，编码1 280个氨基酸的Pgp。后者为相对分子质量170 000的糖蛋白分子。整个肽链有6对疏水区、使其嵌在细胞膜内，还有两个ATP结合位点。它能通过消耗ATP能量将细胞内药物排出胞外，降低细胞内药物浓度，增加对药物的抗性。
传统MDR逆转剂作用于Pgp水平，效率低，除对Pgp功能产生影响外，还有许多严重的非特异性作用，并可影响具有Pgp表达的正常组织细胞的功能，难以应用于临床。反义核酸技术给肺癌的MDR逆转提供了新的策略并展示了广阔的前景。其基本原理是通过碱基配对特异性地与某些DNA或RNA结合，阻止其复制、转录和翻译，从而达到封闭基因和抑制表达的作用。用反义技术逆转MDR的作用点在Pgp以上水平，可以把MDR消灭在“萌芽”状态。具有高效率、高特异性。
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本课题证实了mdr1基因的表达是肺腺癌细胞株A549/R MDR形成的重要原因，随即根据mdr1基因序列和mdr1转录图谱设计了反义核酸序列：ATCCATCCCGACCTC。该序列是跨越内含子与开放性阅读框架起始部分的一段互补反义DNA片断(mdr1 DNA -9—+6)。而转录起始点及其上游的一段非编码区正是影响mdr1转录的敏感区。在该位点结合上一段反义链就可有效地抑制转录。我们的实验结果证实了该序列的效果，也许可作为以后肺腺癌MDR逆转反义核酸序列的参考。
反义核酸对基因表达抑制作用有剂量依赖性趋势。这就要求提高和保持细胞内反义核酸的浓度。我们将反义核酸进行了整链的硫代磷酸修饰，使它可以抵抗核酸酶的攻击而不致降解，又可保持对靶基因的特异性结合。另外，采用脂质体包埋来促进细胞对反义核酸的摄取，取得了较好的效果。
本结果表明，经反义核酸处理的细胞内mdr1 mRNA和细胞的Pgp表达明显低于正义链和对照组，罗丹明试验提示反义核酸处理的细胞内罗丹明明显聚集，药敏试验提示对抗癌药的敏感性提高20倍。而反义核酸和脂质体在我们的实验条件下其本身未对A549细胞产生毒性作用。说明反义核酸具有明显的逆转肺癌MDR的作用，其作用水平在mRNA或DNA水平，使Pgp的表达受到明显抑制。
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参考文献：
1 Bouffard DY, Ohkawa T, Kijima H. Oligonucleotide modulation of multidrug resistance. Eur J Cancer, 1996,32A：1010-1018.
2 鄂征.组织培养和分子细胞学技术.分子细胞技术.在研究中的应用.第1版.北京：北京出版社，1995，436-441.
3 杨景山.医学细胞化学与细胞生物技术.第1版.北京：北京医科大学，中国协和医科大学联合出版社，1990，381-410.
4 Roninson IB, Abelson HT, Housman DE, et al. Amplification of specific DNA sequence correlates with MDR in Chinese hamster cell. Nature, 1984,309：626-628.
5 Gros P, Neriah YB, Croop JM, et al. Isolation and expression of a complementary DNA that confers multidrug resistance. Nature, 1986,323：728-731.
6 Gottesman MM, Hrycyna CA. Genetic analysis of the multidrug transpoter. Annu Rev Genet, 1995,29：607-649.
收稿日期：1999-05-06, 百拇医药