血小板和T细胞活化抗原配体的初步鉴定
作者：孙凯 金伯泉 冯琦 朱勇 杨琨 刘雪松 张建平
单位：孙凯(第四军医大学西京医院肝胆外科 710032 西安)；金伯泉 朱勇 杨琨 刘雪松 张建平(第四军医大学免疫学教研室)；冯琦(第四军医大学血液内科)
关键词：
中华医学杂志000329 1985年Burns等[1]通过Leo-A1 mAb发现了一种人T细胞活化抗原TLiSA1(T lineage specific activation antigen 1,TLiSA1)。由于该分子也高表达于血小板膜表面，遂于1989年更名为血小板和T细胞活化抗原1( platelet and T cell activation antigen 1, PTA1)[2]，1997年获得基因克隆[3]。但到目前为止，PTA1配体尚未被基因克隆，亦未见有关PTA1配体的研究报道。作者拟通过PTA1/Ig融合蛋白对PTA1配体进行了初步的鉴定。
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一、材料和方法
1. 材料：COS-7细胞系、结肠癌Colo205细胞系、U937细胞系及分泌抗PTA1单克隆抗体的Leo-A1杂交瘤细胞系由第四军医大学免疫学教研室提供。羊抗人Ig-SABC试剂盒购自博士德公司。Na251CrO4购自Amersham公司。用于混合淋巴细胞反应的外周血取自正常健康志愿者。
2. PTA1/Ig融合蛋白的制备及鉴定：由本课题组完成，详见文献[4]。
3. 配体鉴定靶细胞的制备：无菌收集2个正常个体外周血，密度梯度法分离纯化PBMC。按2×106细胞/4 ml比例在培养瓶中培养，4 d内不要晃动，第5 d加入1 ml新鲜培养基，培养7～10 d。活化Jurkat细胞制备方法如下：取对数期生长Jurkat细胞，调整密度为1×106/ml，加入TPA，终浓度为50 ng/ml，37℃、5% CO2培养18～30 h，收集细胞备用。
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4.流式细胞仪检测：收集细胞，用10%小牛血清培养基调整细胞浓度为1×107。取50 μl细胞悬液加入PTA1/Ig融合蛋白10 μg(用1∶20灭活正常兔血清稀释)，4℃作用30 min。洗涤液洗涤1 000 r/min×5 min×2次。弃上清，加入50 μl工作浓度的羊抗人Ig荧光标记抗体，充分振摇，4℃作用30 min。洗涤液洗涤2次。加入固定液，流式细胞仪检测。
5. 粘附阻断实验：96孔培养板中以Colo205细胞铺底，0.5×105/孔，37℃、5% CO2培养1 d，使之紧密贴附以单层细胞生长。加入3.7 MBq标记的静止或活化的Jurkat细胞，1×105/孔，37℃、5% CO2培养4 h。用PBS轻柔洗去未粘附细胞后，以2% Triton X-100的PBS裂解细胞。测定cpm值。在粘附阻断实验中，加入不同浓度的PTA1/Ig融合蛋白、PTA1 mAb或对照。
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6. PTA1/Ig免疫组织化学观察：细胞制片后，0.3%甲醇双氧水，37℃，30 min。滴加5%正常羊血清封闭30 min，甩去封闭液后不洗，滴加PTA1/Ig融合蛋白，4℃作用过夜，0.01 mol/LPBS洗2 min×3次。滴加1∶100稀释的生物素化羊抗人Ig，37℃作用2 h，0.01 mol/L PBS洗2 min×3次。加入SABC工作液，37℃作用1 h，0.01 mol/L PBS洗5 min×4次。而后DAB显色、脱水、透明、封片、镜检。
二、结果
1.流式细胞仪筛选结果：经荧光显微镜及流式细胞仪筛选，对活化Jurkat细胞、混合淋巴细胞反应细胞、Colo205细胞、U937细胞均未获得阳性结果。可能的原因是由于流式细胞仪检测敏感性不够或靶细胞配体数目较少。因此，我们进行了下一步实验。
2.Colo205细胞膜能被PTA1/Ig特异性着色：免疫组织化学结果显示，Colo205细胞能被PTA1/Ig特异性染色，显色部位主要位于胞膜，呈棕褐色粗颗粒，表明PTA1/Ig能结合于Colo205细胞膜表面的分子。对照组抗体hIgG不能使Colo205细胞染色，排除了PTA1/Ig融合蛋白Fc段非特异性吸附的可能性。
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3.PTA1/Ig及PTA1 mAb阻断活化Jurkat细胞对Colo205细胞的粘附：静止Jurkat细胞表达极低水平的PTA1，而TPA刺激后表达水平可达90%以上。在本实验中，我们以静止及活化Jurkat细胞分别作为PTA1表达阴性及阳性细胞。实验结果表明，静止Jurkat细胞对Colo205细胞无明显粘附作用，而活化Jurkat细胞能明显粘附于Colo205细胞(P<0.01)，表明Colo205细胞表面存在能与活化Jurkat细胞膜表面分子结合的分子。粘附阻断实验证实，PTA1/Ig及Leo-A1 mAb能部分阻断活化Jurkat细胞对Colo205细胞的粘附(P<0.01)，而对照Ig及IL-1 mAb无此作用，证实PTA1分子参与了这种特异性的粘附作用。
三、讨论
人PTA1成熟蛋白由318个氨基酸组成，属I型跨膜糖蛋白。胞膜外区由232个氨基酸组成，形成2个免疫球蛋白超家族V样结构域，这种结构在免疫球蛋白超家族成员中是唯一的。胞浆区存在多种与细胞信号转导相关的结构和基序，提示PTA1分子参与了T细胞和血小板活化的信号转导过程[2，3]，可能具有重要的功能。有趣的是，PTA1的基因序列与1996年Shibuya等发表的DNAM-1分子(DNAX accessory molecular-1, DNAM-1)序列相同。DNAM-1的单抗DX11能明显抑制CTL对Colo205、PA-1、MCF7等细胞的杀伤作用，提示DNAM-1是一种新的粘附分子，并可能与信号转导有关[5]。
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免疫球蛋白超家族成员的主要作用是介导分子识别，这是由其胞膜外区的免疫球蛋白结构域所决定的。因此，我们分析PTA1及其配体的生理作用可能是介导活化T细胞与其它细胞的识别或相互作用。已有的实验证明，PTA1主要表达于原始造血细胞、巨核/血小板谱系、T细胞。但在多种肿瘤细胞中不表达(如Colo205、PA-1、SK-N-SH、MCF-7、BDMEL-1及CaOV3)。根据上述实验资料，我们决定在活化Jurkat细胞、混合淋巴细胞反应细胞、Colo205细胞及U937细胞中对PTA1配体的表达进行初步的筛选。结果证实采用PTA1/Ig的策略是可行的。实验中，流式细胞仪未能检测到PTA1配体的表达，可能原因是Colo205细胞膜表面PTA1配体密度过低或PTA1/Ig的亲和力较低。
基金项目：国家自然科学基金资助项目(39700065)
参考文献：
1 Burns GF, Triglia T, Werkmeister JA, et al. TLiSA, a human T lineage-specific activation antigen involved in the differentiation of cytotoxic T lymphocytes and anomalous killer cells from their precursors. J Exp Med,1985，161:1063-1078.
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2 Scott JL, Dunn SM, Jin B, et al. Characterization of a novel membrane glycoprotein involved in platelet activation. J Biol Chem,1989，264:13475-13482.
3 Sherrington PD, Scott JL, Jin BQ, et al. TLiSA(PTA1) activation antigen implicated in T cell differentiation and platelet activation is a member of the regulation of expression. J Biol Chem, 1997，272:21735-21744.
4 孙凯，金伯泉，冯琦，等.血小板/T细胞活化抗原1(PTA1)胞膜外区基因片段的克隆及其融合蛋白的表达.中华微生物学和免疫学杂志，1999，19:377-381.
5 Shibuya A, Campbell D, Hunnum C, et al. DNAM-1, A novel adhesion molecule involved in the cytolytic function of T lymphocytes. Immunity, 1998，4：573-581.
收稿日期：1999-05-20, 百拇医药
单位：孙凯(第四军医大学西京医院肝胆外科 710032 西安)；金伯泉 朱勇 杨琨 刘雪松 张建平(第四军医大学免疫学教研室)；冯琦(第四军医大学血液内科)
关键词：
中华医学杂志000329 1985年Burns等[1]通过Leo-A1 mAb发现了一种人T细胞活化抗原TLiSA1(T lineage specific activation antigen 1,TLiSA1)。由于该分子也高表达于血小板膜表面，遂于1989年更名为血小板和T细胞活化抗原1( platelet and T cell activation antigen 1, PTA1)[2]，1997年获得基因克隆[3]。但到目前为止，PTA1配体尚未被基因克隆，亦未见有关PTA1配体的研究报道。作者拟通过PTA1/Ig融合蛋白对PTA1配体进行了初步的鉴定。
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一、材料和方法
1. 材料：COS-7细胞系、结肠癌Colo205细胞系、U937细胞系及分泌抗PTA1单克隆抗体的Leo-A1杂交瘤细胞系由第四军医大学免疫学教研室提供。羊抗人Ig-SABC试剂盒购自博士德公司。Na251CrO4购自Amersham公司。用于混合淋巴细胞反应的外周血取自正常健康志愿者。
2. PTA1/Ig融合蛋白的制备及鉴定：由本课题组完成，详见文献[4]。
3. 配体鉴定靶细胞的制备：无菌收集2个正常个体外周血，密度梯度法分离纯化PBMC。按2×106细胞/4 ml比例在培养瓶中培养，4 d内不要晃动，第5 d加入1 ml新鲜培养基，培养7～10 d。活化Jurkat细胞制备方法如下：取对数期生长Jurkat细胞，调整密度为1×106/ml，加入TPA，终浓度为50 ng/ml，37℃、5% CO2培养18～30 h，收集细胞备用。
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4.流式细胞仪检测：收集细胞，用10%小牛血清培养基调整细胞浓度为1×107。取50 μl细胞悬液加入PTA1/Ig融合蛋白10 μg(用1∶20灭活正常兔血清稀释)，4℃作用30 min。洗涤液洗涤1 000 r/min×5 min×2次。弃上清，加入50 μl工作浓度的羊抗人Ig荧光标记抗体，充分振摇，4℃作用30 min。洗涤液洗涤2次。加入固定液，流式细胞仪检测。
5. 粘附阻断实验：96孔培养板中以Colo205细胞铺底，0.5×105/孔，37℃、5% CO2培养1 d，使之紧密贴附以单层细胞生长。加入3.7 MBq标记的静止或活化的Jurkat细胞，1×105/孔，37℃、5% CO2培养4 h。用PBS轻柔洗去未粘附细胞后，以2% Triton X-100的PBS裂解细胞。测定cpm值。在粘附阻断实验中，加入不同浓度的PTA1/Ig融合蛋白、PTA1 mAb或对照。
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6. PTA1/Ig免疫组织化学观察：细胞制片后，0.3%甲醇双氧水，37℃，30 min。滴加5%正常羊血清封闭30 min，甩去封闭液后不洗，滴加PTA1/Ig融合蛋白，4℃作用过夜，0.01 mol/LPBS洗2 min×3次。滴加1∶100稀释的生物素化羊抗人Ig，37℃作用2 h，0.01 mol/L PBS洗2 min×3次。加入SABC工作液，37℃作用1 h，0.01 mol/L PBS洗5 min×4次。而后DAB显色、脱水、透明、封片、镜检。
二、结果
1.流式细胞仪筛选结果：经荧光显微镜及流式细胞仪筛选，对活化Jurkat细胞、混合淋巴细胞反应细胞、Colo205细胞、U937细胞均未获得阳性结果。可能的原因是由于流式细胞仪检测敏感性不够或靶细胞配体数目较少。因此，我们进行了下一步实验。
2.Colo205细胞膜能被PTA1/Ig特异性着色：免疫组织化学结果显示，Colo205细胞能被PTA1/Ig特异性染色，显色部位主要位于胞膜，呈棕褐色粗颗粒，表明PTA1/Ig能结合于Colo205细胞膜表面的分子。对照组抗体hIgG不能使Colo205细胞染色，排除了PTA1/Ig融合蛋白Fc段非特异性吸附的可能性。
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3.PTA1/Ig及PTA1 mAb阻断活化Jurkat细胞对Colo205细胞的粘附：静止Jurkat细胞表达极低水平的PTA1，而TPA刺激后表达水平可达90%以上。在本实验中，我们以静止及活化Jurkat细胞分别作为PTA1表达阴性及阳性细胞。实验结果表明，静止Jurkat细胞对Colo205细胞无明显粘附作用，而活化Jurkat细胞能明显粘附于Colo205细胞(P<0.01)，表明Colo205细胞表面存在能与活化Jurkat细胞膜表面分子结合的分子。粘附阻断实验证实，PTA1/Ig及Leo-A1 mAb能部分阻断活化Jurkat细胞对Colo205细胞的粘附(P<0.01)，而对照Ig及IL-1 mAb无此作用，证实PTA1分子参与了这种特异性的粘附作用。
三、讨论
人PTA1成熟蛋白由318个氨基酸组成，属I型跨膜糖蛋白。胞膜外区由232个氨基酸组成，形成2个免疫球蛋白超家族V样结构域，这种结构在免疫球蛋白超家族成员中是唯一的。胞浆区存在多种与细胞信号转导相关的结构和基序，提示PTA1分子参与了T细胞和血小板活化的信号转导过程[2，3]，可能具有重要的功能。有趣的是，PTA1的基因序列与1996年Shibuya等发表的DNAM-1分子(DNAX accessory molecular-1, DNAM-1)序列相同。DNAM-1的单抗DX11能明显抑制CTL对Colo205、PA-1、MCF7等细胞的杀伤作用，提示DNAM-1是一种新的粘附分子，并可能与信号转导有关[5]。
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免疫球蛋白超家族成员的主要作用是介导分子识别，这是由其胞膜外区的免疫球蛋白结构域所决定的。因此，我们分析PTA1及其配体的生理作用可能是介导活化T细胞与其它细胞的识别或相互作用。已有的实验证明，PTA1主要表达于原始造血细胞、巨核/血小板谱系、T细胞。但在多种肿瘤细胞中不表达(如Colo205、PA-1、SK-N-SH、MCF-7、BDMEL-1及CaOV3)。根据上述实验资料，我们决定在活化Jurkat细胞、混合淋巴细胞反应细胞、Colo205细胞及U937细胞中对PTA1配体的表达进行初步的筛选。结果证实采用PTA1/Ig的策略是可行的。实验中，流式细胞仪未能检测到PTA1配体的表达，可能原因是Colo205细胞膜表面PTA1配体密度过低或PTA1/Ig的亲和力较低。
基金项目：国家自然科学基金资助项目(39700065)
参考文献：
1 Burns GF, Triglia T, Werkmeister JA, et al. TLiSA, a human T lineage-specific activation antigen involved in the differentiation of cytotoxic T lymphocytes and anomalous killer cells from their precursors. J Exp Med,1985，161:1063-1078.
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2 Scott JL, Dunn SM, Jin B, et al. Characterization of a novel membrane glycoprotein involved in platelet activation. J Biol Chem,1989，264:13475-13482.
3 Sherrington PD, Scott JL, Jin BQ, et al. TLiSA(PTA1) activation antigen implicated in T cell differentiation and platelet activation is a member of the regulation of expression. J Biol Chem, 1997，272:21735-21744.
4 孙凯，金伯泉，冯琦，等.血小板/T细胞活化抗原1(PTA1)胞膜外区基因片段的克隆及其融合蛋白的表达.中华微生物学和免疫学杂志，1999，19:377-381.
5 Shibuya A, Campbell D, Hunnum C, et al. DNAM-1, A novel adhesion molecule involved in the cytolytic function of T lymphocytes. Immunity, 1998，4：573-581.
收稿日期：1999-05-20, 百拇医药