脑胶质瘤p16基因转染对细胞生长及放射敏感性的影响
作者：陈一招 徐如祥 张世忠 郑景熙 张云 邹琳
单位：陈一招(第一军医大学珠江医院神经外科，广东 广州510282)；徐如祥(第一军医大学珠江医院神经外科，广东 广州510282)；张世忠(第一军医大学珠江医院神经外科，广东 广州510282)；郑景熙(第一军医大学珠江医院放疗科，广东 广州510282)
关键词：脑胶质瘤；p16基因；放射治疗；辐射敏感性
第一军医大学学报000303 摘要：目的 探索p16基因在脑胶质瘤发生发展过程中的作用及p16基因与肿瘤细胞放射敏感性间的关系。方法 将外源野生型p16基因导入胶质瘤细胞株U251、C6，筛选阳性克隆。同时以空载体质粒pCDNA3为对照，免疫组化检测p16基因表达，用MTT法测定细胞生长曲线及肿瘤杀伤率。结果 转染p16基因的U251、C6细胞有外源p16基因的整合及表达，克隆形成率减少，生长速度明显减慢，对辐射的敏感性增强。结论 导入外源野生型p16基因可抑制胶质瘤细胞恶性增殖，提高胶质瘤细胞对辐射的敏感性。
, 百拇医药
中图分类号：R730.5 文献标识码：A 文章编号：1000-2588 (2000)-03-0202-02
Effects of p16 gene on the growth and radiation sensitivity of human glioma cell line
CHEN Yi-zhao1, XU Ru-xiang1, ZHANG Shi-zhong1, ZHENG Jing-xi2, ZHANG Yun2, ZOU Lin1
(1Department of Neurosurgery, 2Department of Radiation, Zhujiang Hospital, First Military Medical University, Guangzhou 510282, China)
, 百拇医药
Abstract: Objective To observe the effects of p16 gene transfection on the growth and radiation sensitivity of human glioma cell lines. Methods Wild-type p16 gene was transfected into U251 and C6 glioma cell lines by lipofectin, and incorporation and expression of exogenous p16 gene were detected. Thiazolyl Blue colorimetric assay was used to measure cell growth and determine the rate of damaged cells by radiation. Results Expression of p16 gene was demonstrated by immunohistochemistry. The growth rate of both p16 gene transfected U251 and C6 glioma cells were reduced; both wild-type p16 positive U251 and C6 were more sensitive to radiation than control cell lines. Conclusion The expression of p16 gene can inhibit the growth of human glioma cells and increase its sensitivity to radiation.
, http://www.100md.com
Key words: glioma; p16 gene; radiation sensitivity
p16基因是近年发现的一种新的抑癌基因，在脑胶质瘤恶性转化中起着重要的作用。本研究通过基因转染将野生型p16基因导入人胶质瘤细胞系U251及C6胶质瘤细胞系，以探讨p16基因的表达对胶质瘤细胞生长和放射敏感性的影响。
1 材料和方法
1.1材料
详见文献[1] 。
1.2 方法
1.2.1 基因转染、免疫组织化学及细胞生长曲线的测定 详见文献[1]。
1.2.2 流式细胞仪细胞周期分析 详见文献[1]。
, 百拇医药
1.2.3 放射治疗及肿瘤杀伤率的计算 消化上述各细胞系，调整细胞浓度为每孔104/200 μl并分别接种到96孔板中。照射组与对照组分别设立10个复孔。5% CO2、37℃培养24 h后，照射组用美国瓦利安Clinac 2300 C/D直线加速器 (8 MHz X射线、距离100 cm、照射野20 cm×15 cm、吸收剂量8 Gy、剂量率500 cGy/min)进行放射治疗。照射完毕继续培养48 h后，照射组与对照组均加入20 μl MTT依上法测定吸光度值，按以下公式计算肿瘤细胞杀伤率[2]：
肿瘤细胞杀伤率＝[对照孔平均D(λ)值- 照射孔平均D(λ)值]/对照孔平均D(λ)值×100%
1.2.4 统计学分析 曲线之间的比较采用方差分析，各组肿瘤细胞杀伤率的比较采用方差分析和q检验。
2 结果
, 百拇医药
2.1 表达p16基因的胶质瘤细胞系C6、U251的转染和筛选
详见文献[1]。
2.2 细胞生长曲线的绘制
U251-p16(+)和C6-p16(+)与C6、U251亲代及分别转染PCDNA3空质粒的C6、U251细胞系相比，生长速度均明显减慢(见图1A、B)。
图1A p16基因表达对脑胶质瘤细胞系U251生长的影响
Fig.1A Effect of expression of wild-type p16 on the growth rate of U251 cells
, http://www.100md.com
图1B 野生型p16基因表达对胶质瘤细胞系C6的影响
Fig.1B Effect of expression of wild-type p16 on the growth rate of C6 cells
2.3 细胞周期分析
p16基因转染的胶质瘤细胞系与对照组相比，二倍体峰后细胞及四倍体峰细胞明显减少[1]。细胞周期分析提示p16基因转染后胶质瘤细胞生长周期的G1/G0期细胞比例明显增加(P<0.01，表1)。
表1 基因转染后胶质瘤细胞周期的分布(t检验，n=10)
Tab.1 Cell cycle assay of U251, U251-p16, C6, C6-p16 cells ( n=10) Cell line
, 百拇医药
G1%
G2%
S%
U251
69.8±3.1*
12.3±2.9
19.9±2.2
U251-p16
85.5±4.4
0.3±0.2
14.2±3.4
C6
, 百拇医药 66.3±3.8#
10.1±2.5
23.6±4.7
C6-p16
77.1±4.0
3.1±1.5
19.8±2.7
*P<0.01 vs U251-p16 cell line; # 0.01
2.4 p16基因转染对C6，U251细胞系放射敏感性的影响
经照射后细胞抑制率的比较见图2。转染p16基因的 C6、U251细胞系对x线照射敏感性增强，与其余2组比较有显著差异(P<0.01)，C6、U251细胞系与转染空PCDNA3质粒细胞系无显著差异(P>0.01)。
, http://www.100md.com
图2 p16基因的表达对胶质瘤细胞放疗敏感性的影响
Fig.2 Expression of wt p16 on radiation sensitivity of U251 and C6 cells
3 讨论
对于p16基因对胶质瘤细胞放射敏感性的作用，目前研究较少。本实验通过p16基因转染的方法证明，p16基因能使胶质瘤细胞对射线的敏感性增强。究其原因，目前认为细胞的辐射敏感性是随着细胞周期时相的变化而变化的。
大多数细胞在G1期有一定的抗性，并且随着向S期移行而下降，在G1/S边界上敏感性最高，这是此时细胞DNA切除修复水平降低的结果。当细胞进入S期后抗性又逐渐升高，到晚S期最高，而当进入G2期与M期，细胞又呈现出较高的敏感性[3]。我们认为，这一现象的主要机制是：当细胞转染了p16基因后，外源p16基因大量表达，此时，一方面胶质瘤细胞不断诱使肿瘤细胞从G1期进入S期；而另一方面，由于外源p16基因的高度表达，cyclin D-CDK复合体的活性被抑制或不能形成，细胞不能有效的进入S期，这两方面的原因互相作用最终导致大量细胞被阻滞在G1/S边界。经一定剂量的射线照射后，细胞DNA切除修复水平降低，DNA损伤难以修复，从而诱导细胞的增殖期死亡。
, http://www.100md.com
p16基因与胶质瘤恶性转化有着密切的关系，同时，p16基因产物相对分子质量小(仅148个氨基酸残基)且特异性强、易于操作，因此， 对p16基因的研究成为目前胶质瘤研究的热点之一。我们的实验表明，p16基因能抑制胶质瘤细胞的生长，并增强胶质瘤细胞的放疗敏感性，为进一步研究提供了实验依据。
国家自然科学基金项目(39700143)
陈一招(1974-)，男，湖南长沙人，住院医师，在读研究生
作者单位:张云(第一军医大学珠江医院放疗科，广东 广州510282)
邹琳(第一军医大学珠江医院神经外科，广东 广州510282)
参考文献
[1] 陈一招，徐如祥，张世忠. p16基因对脑胶质瘤细胞顺铂化疗敏感性的影响[J]. 第一军医大学学报, 2000, 20(2):137～9.
[2] 李杰，刘玉琴.MTT 法在肿瘤研究中的改良及应用进展[J]. 中国肿瘤临床, 1998, 25(4):312～3.
[3] 夏寿萱. 放射生物学[M].军事医学科学出版社, 1998. 211～32.
1999-06-11, http://www.100md.com
单位：陈一招(第一军医大学珠江医院神经外科，广东 广州510282)；徐如祥(第一军医大学珠江医院神经外科，广东 广州510282)；张世忠(第一军医大学珠江医院神经外科，广东 广州510282)；郑景熙(第一军医大学珠江医院放疗科，广东 广州510282)
关键词：脑胶质瘤；p16基因；放射治疗；辐射敏感性
第一军医大学学报000303 摘要：目的 探索p16基因在脑胶质瘤发生发展过程中的作用及p16基因与肿瘤细胞放射敏感性间的关系。方法 将外源野生型p16基因导入胶质瘤细胞株U251、C6，筛选阳性克隆。同时以空载体质粒pCDNA3为对照，免疫组化检测p16基因表达，用MTT法测定细胞生长曲线及肿瘤杀伤率。结果 转染p16基因的U251、C6细胞有外源p16基因的整合及表达，克隆形成率减少，生长速度明显减慢，对辐射的敏感性增强。结论 导入外源野生型p16基因可抑制胶质瘤细胞恶性增殖，提高胶质瘤细胞对辐射的敏感性。
, 百拇医药
中图分类号：R730.5 文献标识码：A 文章编号：1000-2588 (2000)-03-0202-02
Effects of p16 gene on the growth and radiation sensitivity of human glioma cell line
CHEN Yi-zhao1, XU Ru-xiang1, ZHANG Shi-zhong1, ZHENG Jing-xi2, ZHANG Yun2, ZOU Lin1
(1Department of Neurosurgery, 2Department of Radiation, Zhujiang Hospital, First Military Medical University, Guangzhou 510282, China)
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Abstract: Objective To observe the effects of p16 gene transfection on the growth and radiation sensitivity of human glioma cell lines. Methods Wild-type p16 gene was transfected into U251 and C6 glioma cell lines by lipofectin, and incorporation and expression of exogenous p16 gene were detected. Thiazolyl Blue colorimetric assay was used to measure cell growth and determine the rate of damaged cells by radiation. Results Expression of p16 gene was demonstrated by immunohistochemistry. The growth rate of both p16 gene transfected U251 and C6 glioma cells were reduced; both wild-type p16 positive U251 and C6 were more sensitive to radiation than control cell lines. Conclusion The expression of p16 gene can inhibit the growth of human glioma cells and increase its sensitivity to radiation.
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Key words: glioma; p16 gene; radiation sensitivity
p16基因是近年发现的一种新的抑癌基因，在脑胶质瘤恶性转化中起着重要的作用。本研究通过基因转染将野生型p16基因导入人胶质瘤细胞系U251及C6胶质瘤细胞系，以探讨p16基因的表达对胶质瘤细胞生长和放射敏感性的影响。
1 材料和方法
1.1材料
详见文献[1] 。
1.2 方法
1.2.1 基因转染、免疫组织化学及细胞生长曲线的测定 详见文献[1]。
1.2.2 流式细胞仪细胞周期分析 详见文献[1]。
, 百拇医药
1.2.3 放射治疗及肿瘤杀伤率的计算 消化上述各细胞系，调整细胞浓度为每孔104/200 μl并分别接种到96孔板中。照射组与对照组分别设立10个复孔。5% CO2、37℃培养24 h后，照射组用美国瓦利安Clinac 2300 C/D直线加速器 (8 MHz X射线、距离100 cm、照射野20 cm×15 cm、吸收剂量8 Gy、剂量率500 cGy/min)进行放射治疗。照射完毕继续培养48 h后，照射组与对照组均加入20 μl MTT依上法测定吸光度值，按以下公式计算肿瘤细胞杀伤率[2]：
肿瘤细胞杀伤率＝[对照孔平均D(λ)值- 照射孔平均D(λ)值]/对照孔平均D(λ)值×100%
1.2.4 统计学分析 曲线之间的比较采用方差分析，各组肿瘤细胞杀伤率的比较采用方差分析和q检验。
2 结果
, 百拇医药
2.1 表达p16基因的胶质瘤细胞系C6、U251的转染和筛选
详见文献[1]。
2.2 细胞生长曲线的绘制
U251-p16(+)和C6-p16(+)与C6、U251亲代及分别转染PCDNA3空质粒的C6、U251细胞系相比，生长速度均明显减慢(见图1A、B)。
图1A p16基因表达对脑胶质瘤细胞系U251生长的影响
Fig.1A Effect of expression of wild-type p16 on the growth rate of U251 cells
, http://www.100md.com
图1B 野生型p16基因表达对胶质瘤细胞系C6的影响
Fig.1B Effect of expression of wild-type p16 on the growth rate of C6 cells
2.3 细胞周期分析
p16基因转染的胶质瘤细胞系与对照组相比，二倍体峰后细胞及四倍体峰细胞明显减少[1]。细胞周期分析提示p16基因转染后胶质瘤细胞生长周期的G1/G0期细胞比例明显增加(P<0.01，表1)。
表1 基因转染后胶质瘤细胞周期的分布(t检验，n=10)
Tab.1 Cell cycle assay of U251, U251-p16, C6, C6-p16 cells ( n=10) Cell line
, 百拇医药
G1%
G2%
S%
U251
69.8±3.1*
12.3±2.9
19.9±2.2
U251-p16
85.5±4.4
0.3±0.2
14.2±3.4
C6
, 百拇医药 66.3±3.8#
10.1±2.5
23.6±4.7
C6-p16
77.1±4.0
3.1±1.5
19.8±2.7
*P<0.01 vs U251-p16 cell line; # 0.01
2.4 p16基因转染对C6，U251细胞系放射敏感性的影响
经照射后细胞抑制率的比较见图2。转染p16基因的 C6、U251细胞系对x线照射敏感性增强，与其余2组比较有显著差异(P<0.01)，C6、U251细胞系与转染空PCDNA3质粒细胞系无显著差异(P>0.01)。
, http://www.100md.com
图2 p16基因的表达对胶质瘤细胞放疗敏感性的影响
Fig.2 Expression of wt p16 on radiation sensitivity of U251 and C6 cells
3 讨论
对于p16基因对胶质瘤细胞放射敏感性的作用，目前研究较少。本实验通过p16基因转染的方法证明，p16基因能使胶质瘤细胞对射线的敏感性增强。究其原因，目前认为细胞的辐射敏感性是随着细胞周期时相的变化而变化的。
大多数细胞在G1期有一定的抗性，并且随着向S期移行而下降，在G1/S边界上敏感性最高，这是此时细胞DNA切除修复水平降低的结果。当细胞进入S期后抗性又逐渐升高，到晚S期最高，而当进入G2期与M期，细胞又呈现出较高的敏感性[3]。我们认为，这一现象的主要机制是：当细胞转染了p16基因后，外源p16基因大量表达，此时，一方面胶质瘤细胞不断诱使肿瘤细胞从G1期进入S期；而另一方面，由于外源p16基因的高度表达，cyclin D-CDK复合体的活性被抑制或不能形成，细胞不能有效的进入S期，这两方面的原因互相作用最终导致大量细胞被阻滞在G1/S边界。经一定剂量的射线照射后，细胞DNA切除修复水平降低，DNA损伤难以修复，从而诱导细胞的增殖期死亡。
, http://www.100md.com
p16基因与胶质瘤恶性转化有着密切的关系，同时，p16基因产物相对分子质量小(仅148个氨基酸残基)且特异性强、易于操作，因此， 对p16基因的研究成为目前胶质瘤研究的热点之一。我们的实验表明，p16基因能抑制胶质瘤细胞的生长，并增强胶质瘤细胞的放疗敏感性，为进一步研究提供了实验依据。
国家自然科学基金项目(39700143)
陈一招(1974-)，男，湖南长沙人，住院医师，在读研究生
作者单位:张云(第一军医大学珠江医院放疗科，广东 广州510282)
邹琳(第一军医大学珠江医院神经外科，广东 广州510282)
参考文献
[1] 陈一招，徐如祥，张世忠. p16基因对脑胶质瘤细胞顺铂化疗敏感性的影响[J]. 第一军医大学学报, 2000, 20(2):137～9.
[2] 李杰，刘玉琴.MTT 法在肿瘤研究中的改良及应用进展[J]. 中国肿瘤临床, 1998, 25(4):312～3.
[3] 夏寿萱. 放射生物学[M].军事医学科学出版社, 1998. 211～32.
1999-06-11, http://www.100md.com