补骨胶囊对去睾丸大鼠骨代谢影响的定量研究
作者：李青南 陈艳 黄连芳 胡彬 金勋杰 吴铁
单位：李青南(524023 湛江，广东医学院骨生物学研究室)陈艳(524023 湛江，广东医学院骨生物学研究室)；黄连芳(524023 湛江，广东医学院骨生物学研究室)；胡彬(524023 湛江，广东医学院骨生物学研究室)；金勋杰(524023 湛江，广东医学院骨生物学研究室)；吴铁(524023 湛江，广东医学院骨生物学研究室)
关键词：睾丸切除术；骨质疏松；骨组织形态计量学
中国骨质疏松杂志000321 [摘要] 目的 观察补骨胶囊防治大鼠去睾丸致骨质疏松的作用及其机理的探讨。方法 21只3月半龄SD雄性大鼠，随机分成年龄对照组、去睾丸组和补骨胶囊用药组(含淫羊藿，黄芪，白术)按5 ml.kg-1.d-1 ig，持续90天。实验结束，取胫骨近心端行不脱钙骨制片进行骨组织形态计量学分析。结果 去睾丸90天大鼠的骨量与年龄对照组相比明显下降(骨小梁面积百分率%Tb.Ar-50%)；补骨胶囊用药组骨量高于去睾丸组(%Tb.Ar+59%)，但未达到年龄对照组的水平。结论 补骨胶囊能部分的防止去睾丸引起的骨丢失。
, http://www.100md.com
Quantitative study on effect of Bugu capsules on bone in orchiectomized rats
Li Qingnan，Chen Yan，Huang Lianfang
(Laboratory Bone Biology,Guangdong Medical College.Zhanjiang 524023,China)
[Abstract] Objective To study the skeletal effects of Bugu capsules in orchiectomized(ORX)rats by bone histomorphometry.Methods Thirty 3.5-month-old male SD rats were randomly divided into three groups:age control group,orchiectomized (ORX) group,and ORX with Bugu capsule treatment group(drug).Bugu capsules were administered 5ml/kg/d(330g.kg-1)ig,7 times a week.After 90 days,all rats were killed.The proximal tibia (PTM) were processed into undecalcified sections of 5 μm and 10μm thickness for histomorphometric analysis. Results ORX group manifested reduction of bone mass as compared with age control group (%Tb.Ar-50%).Percent trabecular area in Bugu capsule treatment group increased 59%,compared with ORX group.Dynamic data showed that Bugu capsules decreased part of bone formation indices such as percent labeling perimeter but did not decrease MAR. Conclusion Bugu capsules can partly prevent the bone loss in ORX rats.
, 百拇医药
[Key words] Orchiectomy; Osteoporosis; Bone histomorphometry
去卵巢大鼠骨质疏松防治的实验研究已多见报道[1-3]，但对去睾丸大鼠所致的骨质疏松防治未见报道。本实验在我室以往用补骨胶囊可防治去卵巢大鼠骨丢失的实验基础上[4]，采用去睾丸大鼠作为模型，观察补骨胶囊对去睾丸大鼠骨质疏松的影响，探讨其作用机理。
1 材料与方法
1.1 药物：中药复方补骨胶囊：由本院医药科技术开发中心从箭叶淫羊藿(Epimedium sagittatum Maxim)、黄芪(Astragalus membranaceus)和白术(Rhizoma atractylodis macrocephalae)中提取，制备成1g相当于2.6g生药材的复方制剂(组方中国专利申请号95100697.5)，药材原料由广东湛江市药材公司提供。盐酸四环素：上海新亚制药厂生产，批号：8912；Calcein (Sigma Co.USA,Lot:61F-0527)。甲基丙烯酸甲酯：北京化工厂生产，批号：940117。Dibutyl phthalate (Sigma USA Lot:106H1217)。骨染料(Masson-Goldner Trichrome;Poncean Fuchsin Stock;Phoshotungstic acid-Orange G;Light green,Sigma.Co.USA)。
, 百拇医药
1.2 动物 3月半龄雄性Sprague Dawley(SD)大白鼠(广东省实验动物中心提供)。
1.3 仪器 低速据(Buehler LTD.USA)半自动图象数字化分析仪，包括光镜和荧光显微镜(Nikon,日本)，数字化板，电脑和形态学程序“Stereology”体视学软件(USA)。
1.4 方法 取上述SD大鼠21只，体重299±22g，随机分为3组。年龄对照组(Aging)：7只，在2%戊巴比妥钠(40mg/kg)麻醉下，取仰卧式，碘酒、酒精消毒阴囊皮肤，纵隔旁相距1cm各开一纵行切口，剪开鞘膜后，分别将双侧睾丸与附睾分离(不切除)，然后放回阴囊，缝合切口。去睾丸组(ORX)：7只，行年龄对照组方法找出双侧睾丸并切除之。补骨胶囊用药组(Drug)：去睾丸第二天用补骨胶囊，7只。所有动物在同等条件下饲养，自由摄食和摄水，每周称体重一次。年龄对照组和去睾丸组动物喂生理盐水，5ml/kg；补骨胶囊用药组动物用补骨胶囊，按5 ml*kg-1 ig，每周7次灌胃(根据每周体重，调整用药量)，持续90d。全部大鼠在处死前第14、13天和第3、2天分别给其皮下注射盐酸四环素(25mg/kg)和Calcein(5mg/kg)，这样就可在骨表面形成黄色和绿色两层双荧光标记，以动态观察两次注射期间骨形成的情况。测量距骺线1mm处至远端3mm范围内的骨组织的各参数并据此得出计算参数[5]。各参数值用均数和标准差表示，百分率(%)用“
2÷1×100-100”公式计算。各组之间的差异性用组间t检验。
, 百拇医药
2 结果
补骨胶囊对去睾丸大鼠胫骨上段松质骨组织形态计量学比较(表1)。
表1 补骨胶囊对去睾丸大鼠骨代谢影响松质骨组织形态计量学比较 组别
%Tb.Ar
(%)
Tb.Th
mcm
Tb.N
(#/mm)
Tb.Sp
mcm
%L.Pm
, http://www.100md.com
%
MAR
mcm/d
BFR/BS
mcm/d*100
BFR/BV
%/year
N.OC/Tb.P
m
#/mm
年龄对照组
Mean
12.27
, 百拇医药
55.33
2.11
491.17
16.84
1.08
18.35
201.38
0.28
7
SD
±6.61
±7.75
±0.92
, http://www.100md.com
±217.14
±4.59
±0.21
±6.96
±65.88
±0.11
ORX
mean
6.13
63.67
0.96
1252.83
24.80
, 百拇医药
1.11
28.03
276.36
0.52
7
SD
±2.94
±8.62
±0.43
±767.95
±5.79
±0.20
±10.06
, http://www.100md.com
±111.87
±0.23
%-A
-50
15
-54
155
47
3
53
37
89
, 百拇医药
用药组
Menn
9.72
62.02
1.58
631.92
16.72
1.20
20.87
205.02
0.19
SD
±3.23
, http://www.100md.com
±6.64
±0.48
±228.76
±5.65
±0.28
±10.42
±95.50
±0.13
%-A
-20
12
-25
29
, 百拇医药
-1
11
14
2
-31
%-orx
59
-3
64
-50
-33
8
, 百拇医药
-26
-26
-63
注：%-A：与年龄对照组比较百分变化，%-orx：去睾丸组比较百分变化；P<0.05；P<0.01
2.1 去睾丸组的变化
ORX组与Aging组比较，骨量%Tb.Ar减少-50%(P<0.05)，骨小梁数量Tb.N减少-55%(P<0.05)，骨小梁分离度Tb.Sp增加+155%(P<0.05)；代表骨形成的参数值明显增加，如荧光周长百分率%L.Pm+47%(P<0.01)，骨形成率BFR/BV+37%(P<0.01)和骨形成率BFR/BS+52%(P<0.05)；代表骨吸收的参数值明显增加，如N.OC/Tb.Pm+89%(P<0.05)。
, 百拇医药
2.2 补骨胶囊用药组的变化
Drug组与ORX组比较：骨量增加：%Tb.Ar+59%(P<0.05)，骨结构改善:Tb.N+64%(P<0.05),Tb.Sp-50%(P<0.05);骨形成的参数值仅%L.Pm下降-33%(P<0.05)，其余骨形成参数值变化无显著性差异；代表骨吸收的参数值明显减少，N.OC/Tb.Pm-63%(P<0.001)。
3 讨论
本实验的结果表明，去睾丸90天大鼠的骨量在年龄对照组的基础上减少，动态参数显示去睾丸后呈现骨高转换的改变，由于骨吸收大于骨形成，导致骨质丢失。其机制可能是雄激素(睾酮)水平下降对骨骼的直接影响。有文献报道[6]，人的成骨细胞上有雄激素受体，雄激素与这些受体结合，降低骨高转换率，使骨量增加，去睾丸后，雄激素急剧下降，骨转换率增加。最近研究[7]表明破骨细胞上也存在雄激素受体，雄激素对破骨细胞也有直接作用，雄激素下降后，破骨细胞活性增强。另外，睾酮可促进降钙素分泌，而降钙素能抑制破骨细胞的活性[8]，所以去睾丸后导致的降钙素减少可能也是破骨细胞活性增强的原因之一。破骨细胞活性增强的结果是骨吸收增加，造成骨量丢失。
, 百拇医药
补骨胶囊用药组的骨量高于去睾丸组(%Tb.Ar+59%)，但与年龄对照组比减少(%Tb.Ar-20%)。这说明该药能防止去睾丸所致的骨丢失，但不能完全预防去睾丸所致的骨丢失，仅为部分预防。其预防骨丢失的机理是明显抑制骨吸收，选择性地抑制去睾丸大鼠的骨形成参数，如荧光周长百分率，此参数代表成骨细胞的数量；而该药物不抑制矿化沉积率，对成骨细胞的功能无直接影响。荧光周长百分率和矿化沉积率的变化使相应的骨形成参数变化无统计学差异。此结果与我室以前报道的补骨胶囊预防去卵巢大鼠的结果[4]基本相同，区别在补骨胶囊对去卵巢大鼠的预防作用强于对去睾丸大鼠。其原因可能是雌雄大鼠对补骨胶囊的反应不同，也可能此中药组方更适合雌性大鼠。
本实验说明补骨胶囊能预防去睾丸大鼠所致的骨质疏松，但补骨胶囊预防去睾丸大鼠骨丢失的作用不如补骨胶囊预防去卵巢大鼠骨丢失的作用强。基金项目：广东省科委重点公关项目(99B07801Q)；广东省卫生厅“五个一科教兴医工程”重点实验室(9601)
, 百拇医药
参考文献
1，Li QN,Liang NC,Huang LF,et al.Skeletal effects of constant and terminated use of risedronate on cortical bone in ovariectomized rats.J Bone Miner Metab.Japan.1999,17:18.
2，Katsumata T,Nakamura T,Ohnishi H,et al.Intermittent cyclical etidronate treatment maintains the mass,structure and the mechanical property of bone in ovariectomized rats.J Bone Miner Res,1995,10:921.
3，李青南，梁念慈，黄连芳，等.利塞膦酸钠和前列腺素E2联合用药对去卵巢大鼠骨骼的影响.中华老年医学杂志，2000，19：45-47.
, 百拇医药
4，李朝阳，吴铁，林柏云，等.芪藿肾宝与己烯雌酚对去卵巢大鼠骨代谢的影响.中国骨质疏松杂志，1997，3：67-69.
5，Jee WSS,Li XJ,Inoue J, et al.Histomorphometric assay of growing long bone. In:Takahashi H.ed.Handbook of bone morphometry.Niigata City.Japan:Nishimusa;1997.7(2):87-112.
6，Galus Ma.Osteoporosis in men.Arch Intern Med,1998,158:194.
7，Gunness M,Orwoll E.Early induction of alterations in cancellous and cortical bone histology after orchiectomy in mature rats.J Bone Miner Res,1995,10:1735.
8，Krongrand A,Levis S,Roos BA.Osteoporosis after orchiectomy for prostate cancer.J Urol,1997,158:1529., 百拇医药
单位：李青南(524023 湛江，广东医学院骨生物学研究室)陈艳(524023 湛江，广东医学院骨生物学研究室)；黄连芳(524023 湛江，广东医学院骨生物学研究室)；胡彬(524023 湛江，广东医学院骨生物学研究室)；金勋杰(524023 湛江，广东医学院骨生物学研究室)；吴铁(524023 湛江，广东医学院骨生物学研究室)
关键词：睾丸切除术；骨质疏松；骨组织形态计量学
中国骨质疏松杂志000321 [摘要] 目的 观察补骨胶囊防治大鼠去睾丸致骨质疏松的作用及其机理的探讨。方法 21只3月半龄SD雄性大鼠，随机分成年龄对照组、去睾丸组和补骨胶囊用药组(含淫羊藿，黄芪，白术)按5 ml.kg-1.d-1 ig，持续90天。实验结束，取胫骨近心端行不脱钙骨制片进行骨组织形态计量学分析。结果 去睾丸90天大鼠的骨量与年龄对照组相比明显下降(骨小梁面积百分率%Tb.Ar-50%)；补骨胶囊用药组骨量高于去睾丸组(%Tb.Ar+59%)，但未达到年龄对照组的水平。结论 补骨胶囊能部分的防止去睾丸引起的骨丢失。
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Quantitative study on effect of Bugu capsules on bone in orchiectomized rats
Li Qingnan，Chen Yan，Huang Lianfang
(Laboratory Bone Biology,Guangdong Medical College.Zhanjiang 524023,China)
[Abstract] Objective To study the skeletal effects of Bugu capsules in orchiectomized(ORX)rats by bone histomorphometry.Methods Thirty 3.5-month-old male SD rats were randomly divided into three groups:age control group,orchiectomized (ORX) group,and ORX with Bugu capsule treatment group(drug).Bugu capsules were administered 5ml/kg/d(330g.kg-1)ig,7 times a week.After 90 days,all rats were killed.The proximal tibia (PTM) were processed into undecalcified sections of 5 μm and 10μm thickness for histomorphometric analysis. Results ORX group manifested reduction of bone mass as compared with age control group (%Tb.Ar-50%).Percent trabecular area in Bugu capsule treatment group increased 59%,compared with ORX group.Dynamic data showed that Bugu capsules decreased part of bone formation indices such as percent labeling perimeter but did not decrease MAR. Conclusion Bugu capsules can partly prevent the bone loss in ORX rats.
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[Key words] Orchiectomy; Osteoporosis; Bone histomorphometry
去卵巢大鼠骨质疏松防治的实验研究已多见报道[1-3]，但对去睾丸大鼠所致的骨质疏松防治未见报道。本实验在我室以往用补骨胶囊可防治去卵巢大鼠骨丢失的实验基础上[4]，采用去睾丸大鼠作为模型，观察补骨胶囊对去睾丸大鼠骨质疏松的影响，探讨其作用机理。
1 材料与方法
1.1 药物：中药复方补骨胶囊：由本院医药科技术开发中心从箭叶淫羊藿(Epimedium sagittatum Maxim)、黄芪(Astragalus membranaceus)和白术(Rhizoma atractylodis macrocephalae)中提取，制备成1g相当于2.6g生药材的复方制剂(组方中国专利申请号95100697.5)，药材原料由广东湛江市药材公司提供。盐酸四环素：上海新亚制药厂生产，批号：8912；Calcein (Sigma Co.USA,Lot:61F-0527)。甲基丙烯酸甲酯：北京化工厂生产，批号：940117。Dibutyl phthalate (Sigma USA Lot:106H1217)。骨染料(Masson-Goldner Trichrome;Poncean Fuchsin Stock;Phoshotungstic acid-Orange G;Light green,Sigma.Co.USA)。
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1.2 动物 3月半龄雄性Sprague Dawley(SD)大白鼠(广东省实验动物中心提供)。
1.3 仪器 低速据(Buehler LTD.USA)半自动图象数字化分析仪，包括光镜和荧光显微镜(Nikon,日本)，数字化板，电脑和形态学程序“Stereology”体视学软件(USA)。
1.4 方法 取上述SD大鼠21只，体重299±22g，随机分为3组。年龄对照组(Aging)：7只，在2%戊巴比妥钠(40mg/kg)麻醉下，取仰卧式，碘酒、酒精消毒阴囊皮肤，纵隔旁相距1cm各开一纵行切口，剪开鞘膜后，分别将双侧睾丸与附睾分离(不切除)，然后放回阴囊，缝合切口。去睾丸组(ORX)：7只，行年龄对照组方法找出双侧睾丸并切除之。补骨胶囊用药组(Drug)：去睾丸第二天用补骨胶囊，7只。所有动物在同等条件下饲养，自由摄食和摄水，每周称体重一次。年龄对照组和去睾丸组动物喂生理盐水，5ml/kg；补骨胶囊用药组动物用补骨胶囊，按5 ml*kg-1 ig，每周7次灌胃(根据每周体重，调整用药量)，持续90d。全部大鼠在处死前第14、13天和第3、2天分别给其皮下注射盐酸四环素(25mg/kg)和Calcein(5mg/kg)，这样就可在骨表面形成黄色和绿色两层双荧光标记，以动态观察两次注射期间骨形成的情况。测量距骺线1mm处至远端3mm范围内的骨组织的各参数并据此得出计算参数[5]。各参数值用均数和标准差表示，百分率(%)用“
2÷1×100-100”公式计算。各组之间的差异性用组间t检验。, 百拇医药
2 结果
补骨胶囊对去睾丸大鼠胫骨上段松质骨组织形态计量学比较(表1)。
表1 补骨胶囊对去睾丸大鼠骨代谢影响松质骨组织形态计量学比较 组别
%Tb.Ar
(%)
Tb.Th
mcm
Tb.N
(#/mm)
Tb.Sp
mcm
%L.Pm
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%
MAR
mcm/d
BFR/BS
mcm/d*100
BFR/BV
%/year
N.OC/Tb.P
m
#/mm
年龄对照组
Mean
12.27
, 百拇医药
55.33
2.11
491.17
16.84
1.08
18.35
201.38
0.28
7
SD
±6.61
±7.75
±0.92
, http://www.100md.com
±217.14
±4.59
±0.21
±6.96
±65.88
±0.11
ORX
mean
6.13
63.67
0.96
1252.83
24.80
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1.11
28.03
276.36
0.52
7
SD
±2.94
±8.62
±0.43
±767.95
±5.79
±0.20
±10.06
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±111.87
±0.23
%-A
-50
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用药组
Menn
9.72
62.02
1.58
631.92
16.72
1.20
20.87
205.02
0.19
SD
±3.23
, http://www.100md.com
±6.64
±0.48
±228.76
±5.65
±0.28
±10.42
±95.50
±0.13
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12
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-1
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14
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%-orx
59
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注：%-A：与年龄对照组比较百分变化，%-orx：去睾丸组比较百分变化；P<0.05；P<0.01
2.1 去睾丸组的变化
ORX组与Aging组比较，骨量%Tb.Ar减少-50%(P<0.05)，骨小梁数量Tb.N减少-55%(P<0.05)，骨小梁分离度Tb.Sp增加+155%(P<0.05)；代表骨形成的参数值明显增加，如荧光周长百分率%L.Pm+47%(P<0.01)，骨形成率BFR/BV+37%(P<0.01)和骨形成率BFR/BS+52%(P<0.05)；代表骨吸收的参数值明显增加，如N.OC/Tb.Pm+89%(P<0.05)。
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2.2 补骨胶囊用药组的变化
Drug组与ORX组比较：骨量增加：%Tb.Ar+59%(P<0.05)，骨结构改善:Tb.N+64%(P<0.05),Tb.Sp-50%(P<0.05);骨形成的参数值仅%L.Pm下降-33%(P<0.05)，其余骨形成参数值变化无显著性差异；代表骨吸收的参数值明显减少，N.OC/Tb.Pm-63%(P<0.001)。
3 讨论
本实验的结果表明，去睾丸90天大鼠的骨量在年龄对照组的基础上减少，动态参数显示去睾丸后呈现骨高转换的改变，由于骨吸收大于骨形成，导致骨质丢失。其机制可能是雄激素(睾酮)水平下降对骨骼的直接影响。有文献报道[6]，人的成骨细胞上有雄激素受体，雄激素与这些受体结合，降低骨高转换率，使骨量增加，去睾丸后，雄激素急剧下降，骨转换率增加。最近研究[7]表明破骨细胞上也存在雄激素受体，雄激素对破骨细胞也有直接作用，雄激素下降后，破骨细胞活性增强。另外，睾酮可促进降钙素分泌，而降钙素能抑制破骨细胞的活性[8]，所以去睾丸后导致的降钙素减少可能也是破骨细胞活性增强的原因之一。破骨细胞活性增强的结果是骨吸收增加，造成骨量丢失。
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补骨胶囊用药组的骨量高于去睾丸组(%Tb.Ar+59%)，但与年龄对照组比减少(%Tb.Ar-20%)。这说明该药能防止去睾丸所致的骨丢失，但不能完全预防去睾丸所致的骨丢失，仅为部分预防。其预防骨丢失的机理是明显抑制骨吸收，选择性地抑制去睾丸大鼠的骨形成参数，如荧光周长百分率，此参数代表成骨细胞的数量；而该药物不抑制矿化沉积率，对成骨细胞的功能无直接影响。荧光周长百分率和矿化沉积率的变化使相应的骨形成参数变化无统计学差异。此结果与我室以前报道的补骨胶囊预防去卵巢大鼠的结果[4]基本相同，区别在补骨胶囊对去卵巢大鼠的预防作用强于对去睾丸大鼠。其原因可能是雌雄大鼠对补骨胶囊的反应不同，也可能此中药组方更适合雌性大鼠。
本实验说明补骨胶囊能预防去睾丸大鼠所致的骨质疏松，但补骨胶囊预防去睾丸大鼠骨丢失的作用不如补骨胶囊预防去卵巢大鼠骨丢失的作用强。基金项目：广东省科委重点公关项目(99B07801Q)；广东省卫生厅“五个一科教兴医工程”重点实验室(9601)
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参考文献
1，Li QN,Liang NC,Huang LF,et al.Skeletal effects of constant and terminated use of risedronate on cortical bone in ovariectomized rats.J Bone Miner Metab.Japan.1999,17:18.
2，Katsumata T,Nakamura T,Ohnishi H,et al.Intermittent cyclical etidronate treatment maintains the mass,structure and the mechanical property of bone in ovariectomized rats.J Bone Miner Res,1995,10:921.
3，李青南，梁念慈，黄连芳，等.利塞膦酸钠和前列腺素E2联合用药对去卵巢大鼠骨骼的影响.中华老年医学杂志，2000，19：45-47.
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4，李朝阳，吴铁，林柏云，等.芪藿肾宝与己烯雌酚对去卵巢大鼠骨代谢的影响.中国骨质疏松杂志，1997，3：67-69.
5，Jee WSS,Li XJ,Inoue J, et al.Histomorphometric assay of growing long bone. In:Takahashi H.ed.Handbook of bone morphometry.Niigata City.Japan:Nishimusa;1997.7(2):87-112.
6，Galus Ma.Osteoporosis in men.Arch Intern Med,1998,158:194.
7，Gunness M,Orwoll E.Early induction of alterations in cancellous and cortical bone histology after orchiectomy in mature rats.J Bone Miner Res,1995,10:1735.
8，Krongrand A,Levis S,Roos BA.Osteoporosis after orchiectomy for prostate cancer.J Urol,1997,158:1529., 百拇医药