APP17肽对高糖引起神经毒作用的影响
http://www.100md.com
中国糖尿病杂志 2000年第3期第8卷 论 著
王蓉(首都医科大学附属北京宣武医院 北京脑老化研究实验室 邮政编码 100053)；张景艳(首都医科大学附属北京宣武医院 北京脑老化研究实验室 邮政编码 100053)；张岱(北京医科大学精神卫生研究所)；孟艳(首都医科大学附属北京宣武医院 北京脑老化研究实验室 邮政编码 100053)；姬志娟(首都医科大学附属北京宣武医院 北京脑老化研究实验室 邮政编码 100053)；盛树力(首都医科大学附属北京宣武医院 北京脑老化研究实验室 邮政编码 100053) 王蓉 张景艳 张岱 孟艳 姬志娟 盛树力
关键词：APP17肽；高糖环境
摘要：
中国糖尿病杂志000312 摘要 目的 通过观察APP17肽和高糖环境对人神经母细胞瘤株SY5Y生长的影响，从细胞水平证实此肽有促进神经细胞生长的作用，并初步观察其对高糖引起神经元毒性作用的保护效应。方法 将细胞计数、MTT代谢率及LDH漏出率作为观察指标。结果 APP17肽可使细胞数和MTT代谢率明显增加，高糖环境下细胞数和MTT代谢率明显降低，LDH漏出率升高，此时加入APP17肽仍可使MTT代谢率增加。结论 ①APP17肽具有促进神经元生长的作用，且能增加细胞线粒体活性，故可能是一种细胞代谢促进剂。②在无胰岛素的情况下，高糖环境对神经元有损伤作用，而APP17肽对神经元有一定的保护作用。
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Effect of APP17 peptide on the neurotoxicity of high glucose
Wang Rong,Zhang Jingyan,Zhang Dai,et al
(Capital University of Medical Sciences,Xuan Wu Hospital,Beijing Aging Research Laboratory,Beijing 100053)
Abstract Objective To observe the effect of APP17 peptide and a high glucose environment on the growth of human neuroblastoma cells,SY5Y,to prove that this peptide can enhance neuronal growth from a cellular perspective,and to make preliminary observations of its preventive effect on the neurotoxicity of high glucose.Methods Cells number,MTT metabolic rate and LDH leakage rate were assessed.Results APP17 peptide significantly increased cell number and MTT metabolic rate.Cell number and MTT metabolic rate were reduced,and LDH leakage was increased in a high glucose environment,but the addition of APP17 peptide under such conditions can still raise MTT metabolic rate.Conclusion ①APP17 peptide had neurotrophic effect and promoted mitochondrial activity,therefore it may be a metabolic enhancer.②In the absence of insulin a high glucose environment was neurotoxic,and APP17 peptide was neuroprotective.
, 百拇医药
Key words APP17 peptide High glucose environment
APP是β-淀粉样肽(β-Amyloid,Aβ或β/A4)的前体蛋白(amyloid β/A4 protein precusor,APP)[1]。APP695由695个氨基酸组成[2]，其中319～335肽段为APP17肽(APP 17-mer peptide)[3]。已有报道，大鼠脑内注射此肽段两周，即可引起细胞学及行为学方面的改变，并能提高动物的学习记忆能力[4]。本实验室近年来对APP17肽进行了免疫组织化学方面的研究，结果表明它能明显改善糖尿病脑病动物海马神经元的退变(未发表资料)。葡萄糖作为动物体内能量来源之一，参与细胞生长代谢过程。但在缺乏胰岛素的情况下，高于体内正常水平的葡萄糖对神经元是否存在损伤作用，却少有报道[5]。本研究目的在于通过观察APP17肽和高糖环境对人神经母细胞瘤株(human neuroblastoma cells)SY5Y生长的影响，从细胞水平证实此肽促进神经细胞生长的作用，并初步观察其对高糖引起神经元毒性作用的保护效应。
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材料和方法
一、材料
1.SY5Y细胞株：由瑞典卡罗琳斯卡研究所Bengt Winblad教授和裴进京博士赠送。细胞培养条件为MEM(Gibco BRL,41500-034)培养基中加入10%胎牛血清(Sigma,F4135)15mmol/L HEPES(DNN company)、青霉素100IU/ml、链霉素100IU/ml及5% CO2，37℃，每周换液两次，传代1次。
2.APP17肽：由本研究室用固相法合成，高效液相(HPLC)纯化，纯度接近100%。
3.3-[4，5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyltetrazolium broide(MTT)：Sigma产品。
4.二甲基亚砜(DMSO)：北京亚太精细化工公司。
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5.乳酸脱氢酶(LDH)测定试剂盒：北京化工厂，编号001012。
二、方法
1.APP17肽对SY5Y生长的影响：
(1)细胞计数：将SY5Y细胞以密度为1×104/ml接种于24孔板(Costar产品)，24小时后细胞贴壁生长，将其分为对照组、APP17肽1μmol/L组和10μmol/L组，每组8孔。于接种后第三、六、九天对各组进行细胞计数。
(2)MTT代谢率测定：将SY5Y细胞以密度为2.5×103/ml接种于96孔板(Costar产品)，24小时后将其分为对照组、APP17肽10μmol/L组，每组12孔。于接种后第七天，每孔加MTT(5mg/ml)20μl，37℃孵育4小时，吸出培养液，每孔加入DMSO 200μl，振摇10分钟，用酶标仪(Diagnostic Pasteur LP400)测定550nm处光密度值(OD)。
, 百拇医药
(3)LDH漏出率测定：将SY5Y细胞以密度为1×104/ml接种于24孔板，24小时后将其分为对照组和APP17肽10μmol/L组，每组8孔。于接种后第七天留取各组细胞培养液，按照LDH测定试剂盒所示方法(比色法)，测定550nm处光密度值，同时做LDH标准曲线。
(4)统计学处理：应用SPSS软件做成组t检验统计。
2.高糖环境对SY5Y生长的影响：
(1)细胞计数：将SY5Y细胞以密度为1×104/ml接种于24孔板，24小时后细胞贴壁生长，换无血清培养液，将细胞分为对照组、高糖组(葡萄糖8.33mmol/L)和高糖加APP17肽10μmol/L组，每组8孔。于接种后第三、六、九天对各组进行细胞计数。
(2)MTT代谢率测定：将SY5Y细胞以密度为2.5×103/ml接种于96孔板，24小时后换无血清培养液，将细胞分为上述3组，每组12孔。于接种后第七天做MTT代谢率测定。
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(3)LDH漏出率测定：将SY5Y细胞以密度为1×104/ml接种于24孔板，24小时后换无血清培养液，将细胞分为上述3组，每组8孔。于接种后第七天留取各组细胞培养液，测定LDH漏出率。
(4)统计学处理：应用SPSS软件做成组t检验统计。
结 果
1.细胞计数结果显示：从接种第六天开始，APP17肽组细胞数增加，1μmol/L组与对照组相比，P<0.05，10μmol/L组与对照组相比，P<0.01；接种后第九天，APP17肽组细胞数仍高于对照组，有高度显著性差异(表1)。而高糖组细胞数从第三天始，明显低于对照组，二者相比P<0.01，且一直持续至第九天；高糖加APP17肽组与高糖组相比，细胞数无显著性差异(表2)。
2.MTT代谢率测定结果显示：APP17肽组OD值为0.440±0.004，明显高于对照组(0.160±0.012)，增加幅度为175%，两组相比P<0.01。而高糖组OD值为0.66±0.06， 明显低于对照组(0.87±0.02)， 降低幅度为26.15%，P<0.01。高糖加APP17肽组OD值为1.05±0.14，明显高于对照组，升高幅度为20.08%，P<0.01。
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表1 细胞计数观察APP17肽对SY5Y生长的影响(×104/ml，
±s) 分组
例数
接种时
第三天
第六天
第九天
对照组
8
1
1.63±0.52
2.15±0.58
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6.10±1.33
APP17肽 1μmol/L组
8
1
1.56±0.59
3.02±0.71*
8.10±0.75**
APP17肽 10μmol/L组
8
1
1.52±0.91
, http://www.100md.com 3.92±0.79**
11.04±4.19**
与对照组相比 *P<0.05，**P<0.01表2 细胞计数观察高糖环境对SY5Y生长的影响(×104/ml，±s) 分组
例数
接种时
第三天
第六天
第九天
对照组
, http://www.100md.com 8
1
5.00±1.15
5.38±0.91
3.05±0.57
高糖组
8
1
2.46±0.98*
1.17±0.58*
1.00±0.47*
高糖加APP17肽
, 百拇医药
8
1
2.33±0.88
2.25±0.92
1.00±0.32
与对照组相比 *P<0.01
3.LDH漏出率测定结果显示：APP17肽组LDH为254.3±44.1U，与对照组(306.3±71.8U)相比无显著性差异。高糖组LDH为1760.2±16.6U，明显高于对照组(503.5±78.6U)，P<0.01。高糖加APP17肽组LDH为1 560.0±25.8U，低于高糖组，P<0.01。
讨 论
Aβ是APP的近C端肽段，在老年性痴呆(Alzheimer's diseases,AD)的发病过程中起重要作用[6]。而可溶性APP中的APP17肽却可促进神经元生长[7]，如使前脑皮质突触前膜的数量增加18%[4]，轴突延长[8]，提高动物的学习记忆能力。本实验表明，APP17肽可使SY5Y细胞数明显增加，且呈剂量依赖关系。MTT为噻唑蓝，被培养的细胞摄取后，通过线粒体代谢生成甲赞(formazan)，故线粒体活力越旺盛，甲赞生成越多，光密度值也越高。本研究显示，无论是在正常情况或者是在缺乏胰岛素的高糖环境下，APP17肽均可使SY5Y MTT代谢率升高，说明APP17肽可以刺激细胞线粒体活性增加。在高糖环境下，虽然APP17肽组的细胞数并未增加，但MTT代谢率却显著高于对照组，说明MTT升高是由于每单位数量细胞线粒体活性增加所致。APP17肽是否作为一种代谢促进剂参与细胞生长活动，尚待进一步研究证实。
, 百拇医药
高糖环境下，SY5Y细胞数明显减少，MTT代谢率下降，LDH漏出率升高，说明高糖环境对神经元生长有损伤作用。此时加入APP17肽只能使MTT代谢率升高，不能使细胞数增加，说明在细胞受损时，APP17肽仍有增加细胞线粒体活性的作用，但促细胞生长作用减弱。虽然APP17肽在高糖环境中不能使SY5Y LDH漏出率降至正常，但与高糖组相比有高度显著性差异，说明在外界损伤条件存在下，APP17肽对神经细胞仍有一定保护作用。
本实验结论为：①APP17肽具有促进神经元生长的作用，且能增加细胞线粒体活性，故可能是一种细胞代谢促进剂。②在缺乏胰岛素的条件下，高糖环境对神经元有损伤作用，而APP17肽对神经元有一定保护作用。
参 考 文 献
1，Goldgaber D,Lerman MI,McBride OW,et al.Characterization and chromomal localization of cDNA encoding brain amyloid of Alzheimer's disease.Science,1987,235:877.
, http://www.100md.com
2，Kang J,Lemarie HG,Unterbeck A,et al.The precursor of Alzheimer's disease amyloid A4 protein resembles a cell-surface receptor.Nature,1987,325:733.
3，Yamamoto KT,Miyoshi T,Yea K,et al.The survival of rat cerebral cortical neurons in the presence of trophic APP peptide.J Neurobiol,1994,25:585.
4，Jean-Marc R,Eliezer M,Anne-Catherine RL.Increase of synatic density and memory retention by a peptide representiny the trophic domain of the amyloid β/A4 protein precursor.Proc Natl Acad Sci USA,1994,91:7450.
, 百拇医药
5，程宁莉，吴圣楣，蔡文杰，等.静脉补糖对脑组织损伤的实验研究.上海医学，1994，17：501.
6，Glenner GG,Wong CW.Alzheimer's disease and Down's syndrome:sharing of a unique cerebrovascular amyliod fibrilprotein.Biochem Biophys Res Commun,1984,122:1131.
7，Mark P,Eliezer M,Deborah AC,et al.Reduction of neurological damage by a peptide segment of the amyloid β/A4 protein precursor in a rabbit spinal cord ischemia model.Experimental Neurology,1994,129:112.
8，Lee-Way J,Haruaki N,Jean-Marc R,et al.Peptide containing the RERMS sequence of amyloid β/A4 protein precursor bind cell surface and promote neurite extension.The J of Neuroscience,1994,14:5461.
(收稿：1998-09-04 修回：1999-10-12), 百拇医药
关键词：APP17肽；高糖环境
摘要：
中国糖尿病杂志000312 摘要 目的 通过观察APP17肽和高糖环境对人神经母细胞瘤株SY5Y生长的影响，从细胞水平证实此肽有促进神经细胞生长的作用，并初步观察其对高糖引起神经元毒性作用的保护效应。方法 将细胞计数、MTT代谢率及LDH漏出率作为观察指标。结果 APP17肽可使细胞数和MTT代谢率明显增加，高糖环境下细胞数和MTT代谢率明显降低，LDH漏出率升高，此时加入APP17肽仍可使MTT代谢率增加。结论 ①APP17肽具有促进神经元生长的作用，且能增加细胞线粒体活性，故可能是一种细胞代谢促进剂。②在无胰岛素的情况下，高糖环境对神经元有损伤作用，而APP17肽对神经元有一定的保护作用。
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Effect of APP17 peptide on the neurotoxicity of high glucose
Wang Rong,Zhang Jingyan,Zhang Dai,et al
(Capital University of Medical Sciences,Xuan Wu Hospital,Beijing Aging Research Laboratory,Beijing 100053)
Abstract Objective To observe the effect of APP17 peptide and a high glucose environment on the growth of human neuroblastoma cells,SY5Y,to prove that this peptide can enhance neuronal growth from a cellular perspective,and to make preliminary observations of its preventive effect on the neurotoxicity of high glucose.Methods Cells number,MTT metabolic rate and LDH leakage rate were assessed.Results APP17 peptide significantly increased cell number and MTT metabolic rate.Cell number and MTT metabolic rate were reduced,and LDH leakage was increased in a high glucose environment,but the addition of APP17 peptide under such conditions can still raise MTT metabolic rate.Conclusion ①APP17 peptide had neurotrophic effect and promoted mitochondrial activity,therefore it may be a metabolic enhancer.②In the absence of insulin a high glucose environment was neurotoxic,and APP17 peptide was neuroprotective.
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Key words APP17 peptide High glucose environment
APP是β-淀粉样肽(β-Amyloid,Aβ或β/A4)的前体蛋白(amyloid β/A4 protein precusor,APP)[1]。APP695由695个氨基酸组成[2]，其中319～335肽段为APP17肽(APP 17-mer peptide)[3]。已有报道，大鼠脑内注射此肽段两周，即可引起细胞学及行为学方面的改变，并能提高动物的学习记忆能力[4]。本实验室近年来对APP17肽进行了免疫组织化学方面的研究，结果表明它能明显改善糖尿病脑病动物海马神经元的退变(未发表资料)。葡萄糖作为动物体内能量来源之一，参与细胞生长代谢过程。但在缺乏胰岛素的情况下，高于体内正常水平的葡萄糖对神经元是否存在损伤作用，却少有报道[5]。本研究目的在于通过观察APP17肽和高糖环境对人神经母细胞瘤株(human neuroblastoma cells)SY5Y生长的影响，从细胞水平证实此肽促进神经细胞生长的作用，并初步观察其对高糖引起神经元毒性作用的保护效应。
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材料和方法
一、材料
1.SY5Y细胞株：由瑞典卡罗琳斯卡研究所Bengt Winblad教授和裴进京博士赠送。细胞培养条件为MEM(Gibco BRL,41500-034)培养基中加入10%胎牛血清(Sigma,F4135)15mmol/L HEPES(DNN company)、青霉素100IU/ml、链霉素100IU/ml及5% CO2，37℃，每周换液两次，传代1次。
2.APP17肽：由本研究室用固相法合成，高效液相(HPLC)纯化，纯度接近100%。
3.3-[4，5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyltetrazolium broide(MTT)：Sigma产品。
4.二甲基亚砜(DMSO)：北京亚太精细化工公司。
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5.乳酸脱氢酶(LDH)测定试剂盒：北京化工厂，编号001012。
二、方法
1.APP17肽对SY5Y生长的影响：
(1)细胞计数：将SY5Y细胞以密度为1×104/ml接种于24孔板(Costar产品)，24小时后细胞贴壁生长，将其分为对照组、APP17肽1μmol/L组和10μmol/L组，每组8孔。于接种后第三、六、九天对各组进行细胞计数。
(2)MTT代谢率测定：将SY5Y细胞以密度为2.5×103/ml接种于96孔板(Costar产品)，24小时后将其分为对照组、APP17肽10μmol/L组，每组12孔。于接种后第七天，每孔加MTT(5mg/ml)20μl，37℃孵育4小时，吸出培养液，每孔加入DMSO 200μl，振摇10分钟，用酶标仪(Diagnostic Pasteur LP400)测定550nm处光密度值(OD)。
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(3)LDH漏出率测定：将SY5Y细胞以密度为1×104/ml接种于24孔板，24小时后将其分为对照组和APP17肽10μmol/L组，每组8孔。于接种后第七天留取各组细胞培养液，按照LDH测定试剂盒所示方法(比色法)，测定550nm处光密度值，同时做LDH标准曲线。
(4)统计学处理：应用SPSS软件做成组t检验统计。
2.高糖环境对SY5Y生长的影响：
(1)细胞计数：将SY5Y细胞以密度为1×104/ml接种于24孔板，24小时后细胞贴壁生长，换无血清培养液，将细胞分为对照组、高糖组(葡萄糖8.33mmol/L)和高糖加APP17肽10μmol/L组，每组8孔。于接种后第三、六、九天对各组进行细胞计数。
(2)MTT代谢率测定：将SY5Y细胞以密度为2.5×103/ml接种于96孔板，24小时后换无血清培养液，将细胞分为上述3组，每组12孔。于接种后第七天做MTT代谢率测定。
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(3)LDH漏出率测定：将SY5Y细胞以密度为1×104/ml接种于24孔板，24小时后换无血清培养液，将细胞分为上述3组，每组8孔。于接种后第七天留取各组细胞培养液，测定LDH漏出率。
(4)统计学处理：应用SPSS软件做成组t检验统计。
结 果
1.细胞计数结果显示：从接种第六天开始，APP17肽组细胞数增加，1μmol/L组与对照组相比，P<0.05，10μmol/L组与对照组相比，P<0.01；接种后第九天，APP17肽组细胞数仍高于对照组，有高度显著性差异(表1)。而高糖组细胞数从第三天始，明显低于对照组，二者相比P<0.01，且一直持续至第九天；高糖加APP17肽组与高糖组相比，细胞数无显著性差异(表2)。
2.MTT代谢率测定结果显示：APP17肽组OD值为0.440±0.004，明显高于对照组(0.160±0.012)，增加幅度为175%，两组相比P<0.01。而高糖组OD值为0.66±0.06， 明显低于对照组(0.87±0.02)， 降低幅度为26.15%，P<0.01。高糖加APP17肽组OD值为1.05±0.14，明显高于对照组，升高幅度为20.08%，P<0.01。
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表1 细胞计数观察APP17肽对SY5Y生长的影响(×104/ml，
±s) 分组例数
接种时
第三天
第六天
第九天
对照组
8
1
1.63±0.52
2.15±0.58
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6.10±1.33
APP17肽 1μmol/L组
8
1
1.56±0.59
3.02±0.71*
8.10±0.75**
APP17肽 10μmol/L组
8
1
1.52±0.91
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11.04±4.19**
与对照组相比 *P<0.05，**P<0.01表2 细胞计数观察高糖环境对SY5Y生长的影响(×104/ml，
±s) 分组例数
接种时
第三天
第六天
第九天
对照组
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1
5.00±1.15
5.38±0.91
3.05±0.57
高糖组
8
1
2.46±0.98*
1.17±0.58*
1.00±0.47*
高糖加APP17肽
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8
1
2.33±0.88
2.25±0.92
1.00±0.32
与对照组相比 *P<0.01
3.LDH漏出率测定结果显示：APP17肽组LDH为254.3±44.1U，与对照组(306.3±71.8U)相比无显著性差异。高糖组LDH为1760.2±16.6U，明显高于对照组(503.5±78.6U)，P<0.01。高糖加APP17肽组LDH为1 560.0±25.8U，低于高糖组，P<0.01。
讨 论
Aβ是APP的近C端肽段，在老年性痴呆(Alzheimer's diseases,AD)的发病过程中起重要作用[6]。而可溶性APP中的APP17肽却可促进神经元生长[7]，如使前脑皮质突触前膜的数量增加18%[4]，轴突延长[8]，提高动物的学习记忆能力。本实验表明，APP17肽可使SY5Y细胞数明显增加，且呈剂量依赖关系。MTT为噻唑蓝，被培养的细胞摄取后，通过线粒体代谢生成甲赞(formazan)，故线粒体活力越旺盛，甲赞生成越多，光密度值也越高。本研究显示，无论是在正常情况或者是在缺乏胰岛素的高糖环境下，APP17肽均可使SY5Y MTT代谢率升高，说明APP17肽可以刺激细胞线粒体活性增加。在高糖环境下，虽然APP17肽组的细胞数并未增加，但MTT代谢率却显著高于对照组，说明MTT升高是由于每单位数量细胞线粒体活性增加所致。APP17肽是否作为一种代谢促进剂参与细胞生长活动，尚待进一步研究证实。
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高糖环境下，SY5Y细胞数明显减少，MTT代谢率下降，LDH漏出率升高，说明高糖环境对神经元生长有损伤作用。此时加入APP17肽只能使MTT代谢率升高，不能使细胞数增加，说明在细胞受损时，APP17肽仍有增加细胞线粒体活性的作用，但促细胞生长作用减弱。虽然APP17肽在高糖环境中不能使SY5Y LDH漏出率降至正常，但与高糖组相比有高度显著性差异，说明在外界损伤条件存在下，APP17肽对神经细胞仍有一定保护作用。
本实验结论为：①APP17肽具有促进神经元生长的作用，且能增加细胞线粒体活性，故可能是一种细胞代谢促进剂。②在缺乏胰岛素的条件下，高糖环境对神经元有损伤作用，而APP17肽对神经元有一定保护作用。
参 考 文 献
1，Goldgaber D,Lerman MI,McBride OW,et al.Characterization and chromomal localization of cDNA encoding brain amyloid of Alzheimer's disease.Science,1987,235:877.
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2，Kang J,Lemarie HG,Unterbeck A,et al.The precursor of Alzheimer's disease amyloid A4 protein resembles a cell-surface receptor.Nature,1987,325:733.
3，Yamamoto KT,Miyoshi T,Yea K,et al.The survival of rat cerebral cortical neurons in the presence of trophic APP peptide.J Neurobiol,1994,25:585.
4，Jean-Marc R,Eliezer M,Anne-Catherine RL.Increase of synatic density and memory retention by a peptide representiny the trophic domain of the amyloid β/A4 protein precursor.Proc Natl Acad Sci USA,1994,91:7450.
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5，程宁莉，吴圣楣，蔡文杰，等.静脉补糖对脑组织损伤的实验研究.上海医学，1994，17：501.
6，Glenner GG,Wong CW.Alzheimer's disease and Down's syndrome:sharing of a unique cerebrovascular amyliod fibrilprotein.Biochem Biophys Res Commun,1984,122:1131.
7，Mark P,Eliezer M,Deborah AC,et al.Reduction of neurological damage by a peptide segment of the amyloid β/A4 protein precursor in a rabbit spinal cord ischemia model.Experimental Neurology,1994,129:112.
8，Lee-Way J,Haruaki N,Jean-Marc R,et al.Peptide containing the RERMS sequence of amyloid β/A4 protein precursor bind cell surface and promote neurite extension.The J of Neuroscience,1994,14:5461.
(收稿：1998-09-04 修回：1999-10-12), 百拇医药