糖尿病大鼠肾脏一氧化氮系统基因表达的研究
http://www.100md.com
中国糖尿病杂志 2000年第3期第8卷 论 著
倪连松(温州医学院附属第一医院内分泌科)；吴万龄(上海第二医科大学附属第九人民医院内分泌科 邮政编码 200011)；盛宏光(上海第二医科大学附属第九人民医院内分泌科 邮政编码 200011)；杨裕国(上海第二医科大学附属第九人民医院内分泌科 邮政编码 200011) 倪连松 吴万龄 盛宏光 杨裕国
关键词：糖尿病肾病；一氧化氮
摘要：
中国糖尿病杂志000310 摘要 目的 研究糖尿病大鼠肾脏一氧化氮系统基因的表达。方法 观察了12周STZ-糖尿病大鼠肾脏皮质一氧化氮(NO)含量及一氧化氮合成酶(NOS)活力，并应用RT-PCR技术检测了肾脏皮质诱生型一氧化氮合成酶(iNOS)mRNA水平的改变。结果 糖尿病大鼠肾脏皮质NOS活性及iNOS mRNA水平明显高于正常对照组(P<0.05)，然而NO含量却反而下降(P<0.05)。结论 糖尿病大鼠肾脏一氧化氮合成障碍，灭活加速。
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A study on the gene expression of nitric oxide system in diabetic kidney
Ni Liansong,Wu Wanling,Sheng Hongguang,et al
(Department of Endocrinology,The Nineth Affiliated Hospital,Shanghai Second Medical University,Shanghai 200011)
Abstract Objective To study on the gene expression of nitric oxide system in diabetic kidney.Methods We have investigated the level of nitric oxide (NO) and the nitric oxide synthase (NOS) activity in the renal cortex of streptozotocin-induced diabetic and control rats at the 12th week.The level of inducible nitric oxide synthase (iNOS) mRNA of renal cortex was also observed by RT-PCR.Results The nitric oxide synthase activity and the level of iNOS mRNA were increased in the diabetic rats,however the nitric oxide level showed a significant decrease in contrast to normal group.Conclusion There are impaired production and/or accelerated deactivity of nitric oxide in the renal cortex of diabetic rats.
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Key words Diabetic nephropathy Nitric oxide
糖尿病肾病是糖尿病慢性微血管并发症之一，其发病机理迄今尚未完全阐明。一氧化氮(NO)是一种自由基性质的气体，在生物体内它可作为重要的信使物质和效应分子在多个系统的病理生理过程中发挥重要的作用。然而有关NO在糖尿病肾病发生与发展中的作用迄今尚无定论。本研究观察了12周链脲佐菌素诱导的糖尿病大鼠肾脏皮质一氧化氮、一氧化氮合成酶(NOS)活力及诱生型一氧化氮合成酶(iNOS)的mRNA水平，并探讨其意义。
材料与方法
一、动物模型及实验设计
选择体重200～250g的健康雄性Wistar大鼠20只，随机取12只，以链脲佐菌素(STZ)50mg/kg体重一次性腹腔内注射；另取8只注射相当体积的柠檬酸缓冲液，作为对照组(NC组)。24小时后，用One Touch Ⅱ血糖仪测定尾静脉全血血糖，当血糖≥13.8mmol/L时为糖尿病大鼠，作为糖尿病组(DM组)。自由进食进水，12周后仅8只糖尿病大鼠及8只正常对照组大鼠存活。
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二、肾脏皮质NO含量及NOS活力的检测
于12周时，以2%戊巴比妥钠2ml腹腔内注射麻醉，取双肾，去包膜后取肾脏皮质0.5g，用生理盐水冰浴下制成10%的组织匀浆后测定NO及NOS活力，NO及NOS试剂盒由南京建成生物工程研究所提供。
三、肾脏皮质总RNA的抽提及逆转录反应
取肾脏皮质100mg，加液氮研碎后，用异硫氰酸胍一步法制备总RNA。取1μg总RNA加0.5μg Oligo(dT)12～18后加DEPC水至12μl，70℃ 10分钟后置冰浴中5分钟，短暂离心。按以下次序加入试剂5×RT Buffer 4μg,10mmol/L dNTP 2μg,Rnasin(40U/ml)0.5μl，AMV(10U/μl)1.5μl(所用试剂皆为Promega公司产品)。转弹管壁，短暂离心后42℃ 1小时。置冰浴后，保存于-20℃。
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四、引物
iNOS引物(美国赛百盛公司合成)：上游：5′-GT GTTCCACCAGGAGATGTTG-3′；下游：5′-CTCCT GCCCGCTGAGTTCGCT-3′，扩增长度为576bp。β-actin引物(美国赛百盛公司合成)：上游：5′-GTGGGCCGCTCTAGGCACCAA-3′；下游：5′-CTCTTTGATGTCACGCACGATTTC-3′，扩增长度为540bp。
五、PCR扩增
优化PCR扩增条件，使PCR扩增在对数期内进行。最后扩增条件为：ddH2O 10.5μl,15mmol/L MgCl2 5.5μl，10×Buffer 2.5μl，2mmol/L NTP 2.5μl，10μmol/L的上、下游引物各1μl，逆转录产物1μl。分别进行iNOS及β-actin扩增。离心混匀后，加石蜡油20μl覆盖表面，97℃ 7分钟后加Taq酶1U。在DNA扩增仪(GeneAmp PCR system 9600，美国 PE公司)上进行PCR扩增：94℃ 50秒，60℃ 40秒，72℃ 60秒，反应30个循环后72℃延伸 7分钟。分别取iNOS PCR产物10μl、β-actin 5μl在1.2%琼脂糖中电泳，摄影后应用计算机图像分析系统行灰度扫描。以iNOS与β-actin的PCR产物DNA条带灰度值之比(iNOS/β-actin)作为反映iNOS mRNA水平的相对指标。所用试剂皆为Promega公司产品。
, 百拇医药
六、统计学处理
方差齐性的两样本均数比较采用t检验；方差不齐的两样本均数比较则采用t′检验。设α=0.05。
结 果
一、体重、肾重、血糖、HbAlc、尿蛋白的变化
表1显示，糖尿病形成12周后，DM组肾重/体重、血糖、HbAlc、尿蛋白均高于NC组(P<0.05)，体重则低于NC组(P<0.05)。
二、肾脏皮质NO含量及NOS活性测定
表1 各组大鼠体重、肾重、血糖、HbAlc、尿蛋白的变化(
±s) 分组
, 百拇医药 例数
体重(g)
肾重(g)
肾重/体重(‰)
血糖(mmo/L)
HbAlc(%)
尿蛋白(g/24h)
NC组
8
404.75±45.13
1.47±0.02
3.67±0.40
, 百拇医药
4.52±0.41
4.48±2.04
0.03±0.02
DM组
8
218.87±20.13*
1.22±0.12*
5.85±0.33*
20.00±5.23*
16.02±3.31*
, 百拇医药 0.17±0.08**
与NC组比较 *P<0.05(t检验)，**P<0.05(t′检验)表2 对照组与糖尿病组肾脏皮质NO含量、NOS活性的比较(±s) 分组
例数
NO(μmol/g.pro)
NOS(U/g.pro)
NC组
8
1.9±0.6
59.8±9.3
, 百拇医药
DM组
8
1.2±0.3*
90.0±14.9**
与NC组比较 *P<0.05(t检验)，**P<0.05(t′检验)
结果显示DM组肾脏皮质NOS活性较NC组明显增强(P<0.05)，然而NO含量却低于NC组(P<0.05)，见表2。
三、RT-PCR检测肾脏皮质iNOS的mRNA表达
糖尿病大鼠肾脏皮质iNOS与β-actin PCR产物的DENS(灰度×面积)比值(0.594±0.116)较正常组(0.309±0.063)明显增高(P<0.05)。结果表明，糖尿病大鼠肾脏皮质iNOS的mRNA表达明显增高(附图)。
, 百拇医药
附图 iNOS及β-actin PCR产物电泳图
(DM组：D1～4；NC组：C1～4)
讨 论
一氧化氮由L-精氨酸经NOS酶促合成。NOS主要有二种类型，其一为结构型，由这种酶合成的NO主要作为传递介质，介导多种生理性应答。另一种酶为诱生型，可由巨噬细胞、内皮细胞等多种细胞经诱导而合成NO，一旦合成，数量较大。通过这种途径合成的NO可作为一种细胞毒性因子或产生其它生物学作用，从而导致组织损害及病理性血管扩张。肾组织内一氧化氮主要通过激活可溶性鸟苷酸环化酶，使细胞内环鸟苷酸(cGMP)升高，从而介导肾组织舒血管反应，调节肾小球毛细血管内压及拮抗缩血管物质对肾小球系膜细胞的收缩作用。
已有研究表明肾脏NO生成增多在糖尿病肾小球高滤过状态及血管功能紊乱中起一定作用。这一方面，氨基胍阻断早期糖尿病大鼠血管对白蛋白通透性的增加可能归因于抑制了NOS活性[1]。再者，Bank等[2]亦发现糖尿病大鼠高滤过状态下NO合成增加，并认为NO的合成增加与高滤过状态形成有关。然而有作者却报道应用NOS抑制剂L-NAME (5mg/ml水)口服2个月可使Wistar大鼠全身血压、肾小球内压增高，肾小球毛细血管超滤系数降低，并导致白蛋白尿及肾小球硬化的发生；提示了NO产生或作用减少可导致肾小球毛细血管内高压及肾小球硬化的形成[3]。
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近来，Choi等[4]曾应用Western Blot技术发现糖尿病大鼠肾皮质、内外髓NOS三种异构体(bNOS、ecNOS、iNOS)的蛋白含量较正常明显增高。祈忠华等[5]亦报道4周STZ-糖尿病大鼠肾皮质、髓质iNOS的mRNA水平较正常明显增高。本实验检测了12周STZ-糖尿病大鼠肾皮质总NOS活性及iNOS的mRNA水平的变化，发现肾皮质NOS活性及iNOS mRNA均较正常组明显增高。因此在糖尿病早期，可能存在肾组织NO合成增多或作用增强，从而参与肾小球高滤状态的形成及血管功能紊乱。
然而本实验却又发现12周糖尿病大鼠肾皮质NO含量较正常降低，提示了糖尿病大鼠肾皮质存在NO合成障碍和/或降解加速。此与NOS活性和iNOS mRNA水平的增高似有矛盾，这可能与以下因素有关：首先，由于NO的生物合成除受NOS调节外，还受底物浓度、辅助因子等调节，因此糖尿鼠大鼠肾皮质NO合成障碍可能与糖尿病状态下底物、辅助因子的耗竭有关。Trachtman等[6]曾报道高葡萄糖浓度可抑制体外培养的肾脏系膜细胞NO的合成，而不影响系膜细胞NOS蛋白的表达。补充L-精氨酸可使NO合成浓度呈依赖性增加，直至正常水平。其次，糖尿病状态下多元醇旁路及蛋白激酶C的激活也可能与NO合成的抑制有关[7]。再者，糖尿病状态下氧自由基产生的增多也可能会加速NO的降解[8]。最后，糖尿病时糖基化终末产物的形成增加也可能加速NO的降解[9]。
, 百拇医药
总之，尽管我们发现糖尿病大鼠肾皮质NOS活力增强，iNOS mRNA表达增加，然而NO的含量却反而下降，提示了糖尿病大鼠肾脏存在NO合成障碍和/或降解加速，这一变化可能在糖尿病肾病的发生、发展中起重要作用。
参 考 文 献
1，Corbett JA,Tilton RG,Chang K,et al.Aminoguanidine,a novel inhibitor of NO formation,prevents diabetic vascular dysfunction.Diabetes,1992,41:552.
2，Bank N,Aymedjian HS.Role EDRF(nitic oxide) in diabetic renal hyperfiltration.Kidney Int,1993,43:1306.
, http://www.100md.com 3，Baylis C,Mitruka B,Deng A,et al.Chronic blockade of nitric oxide synthesis in the rat produces systemic hypertension and glomerular damage.J Clin Invest,1992,90:278.
4，Choi KC,Kim NH,An MR,et al.Alterations of intrarenal renin-angiotensin and oxide systems in streptozotocin-induced diabetic rats.Kidney Int,1997,52(Suppl):S23.
5，祈忠华，林善锬.早期糖尿病大鼠肾脏诱生型一氧化氮合成酶基因表达.中华内分泌代谢杂志，1998，14：41.
6，Trachtman H,Futterweit S,Crimmins DL,et al.High glucose inhibits nitric oxide production in cultured rat mesangial cells.J Am Soc Nephrol,1997,8:1276.
, http://www.100md.com
7，Bredt DS,Ferris DC,Snyder H,et al.Nitric oxide synthase regulatory sites:phosphorylation by cyclic AMP-depend protion kinase,protein kinase C and calcium/calmodulin protein kinase:indentification of flavin and calmodulin binding sites.J Biol Chem,1992,267:10976.
8，Pieper GM,Langenstroer P,Siebeneich W,et al.Diabetic-induced endothelial dysfunction in rat aorta:role of hydroxyl radicals.Cardiovascular Research,1997,34:145.
9，Bucala R,Tracey KJ,Cerami A,et al.Advanced glycosylation products quench nitric oxide and mediate defective endothelium-dependent vasodilatation in experimental diabetes.J Clin Invest,1991,87:432.
(收稿：1998-12-03 修回：2000-01-03), 百拇医药
关键词：糖尿病肾病；一氧化氮
摘要：
中国糖尿病杂志000310 摘要 目的 研究糖尿病大鼠肾脏一氧化氮系统基因的表达。方法 观察了12周STZ-糖尿病大鼠肾脏皮质一氧化氮(NO)含量及一氧化氮合成酶(NOS)活力，并应用RT-PCR技术检测了肾脏皮质诱生型一氧化氮合成酶(iNOS)mRNA水平的改变。结果 糖尿病大鼠肾脏皮质NOS活性及iNOS mRNA水平明显高于正常对照组(P<0.05)，然而NO含量却反而下降(P<0.05)。结论 糖尿病大鼠肾脏一氧化氮合成障碍，灭活加速。
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A study on the gene expression of nitric oxide system in diabetic kidney
Ni Liansong,Wu Wanling,Sheng Hongguang,et al
(Department of Endocrinology,The Nineth Affiliated Hospital,Shanghai Second Medical University,Shanghai 200011)
Abstract Objective To study on the gene expression of nitric oxide system in diabetic kidney.Methods We have investigated the level of nitric oxide (NO) and the nitric oxide synthase (NOS) activity in the renal cortex of streptozotocin-induced diabetic and control rats at the 12th week.The level of inducible nitric oxide synthase (iNOS) mRNA of renal cortex was also observed by RT-PCR.Results The nitric oxide synthase activity and the level of iNOS mRNA were increased in the diabetic rats,however the nitric oxide level showed a significant decrease in contrast to normal group.Conclusion There are impaired production and/or accelerated deactivity of nitric oxide in the renal cortex of diabetic rats.
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Key words Diabetic nephropathy Nitric oxide
糖尿病肾病是糖尿病慢性微血管并发症之一，其发病机理迄今尚未完全阐明。一氧化氮(NO)是一种自由基性质的气体，在生物体内它可作为重要的信使物质和效应分子在多个系统的病理生理过程中发挥重要的作用。然而有关NO在糖尿病肾病发生与发展中的作用迄今尚无定论。本研究观察了12周链脲佐菌素诱导的糖尿病大鼠肾脏皮质一氧化氮、一氧化氮合成酶(NOS)活力及诱生型一氧化氮合成酶(iNOS)的mRNA水平，并探讨其意义。
材料与方法
一、动物模型及实验设计
选择体重200～250g的健康雄性Wistar大鼠20只，随机取12只，以链脲佐菌素(STZ)50mg/kg体重一次性腹腔内注射；另取8只注射相当体积的柠檬酸缓冲液，作为对照组(NC组)。24小时后，用One Touch Ⅱ血糖仪测定尾静脉全血血糖，当血糖≥13.8mmol/L时为糖尿病大鼠，作为糖尿病组(DM组)。自由进食进水，12周后仅8只糖尿病大鼠及8只正常对照组大鼠存活。
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二、肾脏皮质NO含量及NOS活力的检测
于12周时，以2%戊巴比妥钠2ml腹腔内注射麻醉，取双肾，去包膜后取肾脏皮质0.5g，用生理盐水冰浴下制成10%的组织匀浆后测定NO及NOS活力，NO及NOS试剂盒由南京建成生物工程研究所提供。
三、肾脏皮质总RNA的抽提及逆转录反应
取肾脏皮质100mg，加液氮研碎后，用异硫氰酸胍一步法制备总RNA。取1μg总RNA加0.5μg Oligo(dT)12～18后加DEPC水至12μl，70℃ 10分钟后置冰浴中5分钟，短暂离心。按以下次序加入试剂5×RT Buffer 4μg,10mmol/L dNTP 2μg,Rnasin(40U/ml)0.5μl，AMV(10U/μl)1.5μl(所用试剂皆为Promega公司产品)。转弹管壁，短暂离心后42℃ 1小时。置冰浴后，保存于-20℃。
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四、引物
iNOS引物(美国赛百盛公司合成)：上游：5′-GT GTTCCACCAGGAGATGTTG-3′；下游：5′-CTCCT GCCCGCTGAGTTCGCT-3′，扩增长度为576bp。β-actin引物(美国赛百盛公司合成)：上游：5′-GTGGGCCGCTCTAGGCACCAA-3′；下游：5′-CTCTTTGATGTCACGCACGATTTC-3′，扩增长度为540bp。
五、PCR扩增
优化PCR扩增条件，使PCR扩增在对数期内进行。最后扩增条件为：ddH2O 10.5μl,15mmol/L MgCl2 5.5μl，10×Buffer 2.5μl，2mmol/L NTP 2.5μl，10μmol/L的上、下游引物各1μl，逆转录产物1μl。分别进行iNOS及β-actin扩增。离心混匀后，加石蜡油20μl覆盖表面，97℃ 7分钟后加Taq酶1U。在DNA扩增仪(GeneAmp PCR system 9600，美国 PE公司)上进行PCR扩增：94℃ 50秒，60℃ 40秒，72℃ 60秒，反应30个循环后72℃延伸 7分钟。分别取iNOS PCR产物10μl、β-actin 5μl在1.2%琼脂糖中电泳，摄影后应用计算机图像分析系统行灰度扫描。以iNOS与β-actin的PCR产物DNA条带灰度值之比(iNOS/β-actin)作为反映iNOS mRNA水平的相对指标。所用试剂皆为Promega公司产品。
, 百拇医药
六、统计学处理
方差齐性的两样本均数比较采用t检验；方差不齐的两样本均数比较则采用t′检验。设α=0.05。
结 果
一、体重、肾重、血糖、HbAlc、尿蛋白的变化
表1显示，糖尿病形成12周后，DM组肾重/体重、血糖、HbAlc、尿蛋白均高于NC组(P<0.05)，体重则低于NC组(P<0.05)。
二、肾脏皮质NO含量及NOS活性测定
表1 各组大鼠体重、肾重、血糖、HbAlc、尿蛋白的变化(
±s) 分组, 百拇医药 例数
体重(g)
肾重(g)
肾重/体重(‰)
血糖(mmo/L)
HbAlc(%)
尿蛋白(g/24h)
NC组
8
404.75±45.13
1.47±0.02
3.67±0.40
, 百拇医药
4.52±0.41
4.48±2.04
0.03±0.02
DM组
8
218.87±20.13*
1.22±0.12*
5.85±0.33*
20.00±5.23*
16.02±3.31*
, 百拇医药 0.17±0.08**
与NC组比较 *P<0.05(t检验)，**P<0.05(t′检验)表2 对照组与糖尿病组肾脏皮质NO含量、NOS活性的比较(
±s) 分组例数
NO(μmol/g.pro)
NOS(U/g.pro)
NC组
8
1.9±0.6
59.8±9.3
, 百拇医药
DM组
8
1.2±0.3*
90.0±14.9**
与NC组比较 *P<0.05(t检验)，**P<0.05(t′检验)
结果显示DM组肾脏皮质NOS活性较NC组明显增强(P<0.05)，然而NO含量却低于NC组(P<0.05)，见表2。
三、RT-PCR检测肾脏皮质iNOS的mRNA表达
糖尿病大鼠肾脏皮质iNOS与β-actin PCR产物的DENS(灰度×面积)比值(0.594±0.116)较正常组(0.309±0.063)明显增高(P<0.05)。结果表明，糖尿病大鼠肾脏皮质iNOS的mRNA表达明显增高(附图)。
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附图 iNOS及β-actin PCR产物电泳图
(DM组：D1～4；NC组：C1～4)
讨 论
一氧化氮由L-精氨酸经NOS酶促合成。NOS主要有二种类型，其一为结构型，由这种酶合成的NO主要作为传递介质，介导多种生理性应答。另一种酶为诱生型，可由巨噬细胞、内皮细胞等多种细胞经诱导而合成NO，一旦合成，数量较大。通过这种途径合成的NO可作为一种细胞毒性因子或产生其它生物学作用，从而导致组织损害及病理性血管扩张。肾组织内一氧化氮主要通过激活可溶性鸟苷酸环化酶，使细胞内环鸟苷酸(cGMP)升高，从而介导肾组织舒血管反应，调节肾小球毛细血管内压及拮抗缩血管物质对肾小球系膜细胞的收缩作用。
已有研究表明肾脏NO生成增多在糖尿病肾小球高滤过状态及血管功能紊乱中起一定作用。这一方面，氨基胍阻断早期糖尿病大鼠血管对白蛋白通透性的增加可能归因于抑制了NOS活性[1]。再者，Bank等[2]亦发现糖尿病大鼠高滤过状态下NO合成增加，并认为NO的合成增加与高滤过状态形成有关。然而有作者却报道应用NOS抑制剂L-NAME (5mg/ml水)口服2个月可使Wistar大鼠全身血压、肾小球内压增高，肾小球毛细血管超滤系数降低，并导致白蛋白尿及肾小球硬化的发生；提示了NO产生或作用减少可导致肾小球毛细血管内高压及肾小球硬化的形成[3]。
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近来，Choi等[4]曾应用Western Blot技术发现糖尿病大鼠肾皮质、内外髓NOS三种异构体(bNOS、ecNOS、iNOS)的蛋白含量较正常明显增高。祈忠华等[5]亦报道4周STZ-糖尿病大鼠肾皮质、髓质iNOS的mRNA水平较正常明显增高。本实验检测了12周STZ-糖尿病大鼠肾皮质总NOS活性及iNOS的mRNA水平的变化，发现肾皮质NOS活性及iNOS mRNA均较正常组明显增高。因此在糖尿病早期，可能存在肾组织NO合成增多或作用增强，从而参与肾小球高滤状态的形成及血管功能紊乱。
然而本实验却又发现12周糖尿病大鼠肾皮质NO含量较正常降低，提示了糖尿病大鼠肾皮质存在NO合成障碍和/或降解加速。此与NOS活性和iNOS mRNA水平的增高似有矛盾，这可能与以下因素有关：首先，由于NO的生物合成除受NOS调节外，还受底物浓度、辅助因子等调节，因此糖尿鼠大鼠肾皮质NO合成障碍可能与糖尿病状态下底物、辅助因子的耗竭有关。Trachtman等[6]曾报道高葡萄糖浓度可抑制体外培养的肾脏系膜细胞NO的合成，而不影响系膜细胞NOS蛋白的表达。补充L-精氨酸可使NO合成浓度呈依赖性增加，直至正常水平。其次，糖尿病状态下多元醇旁路及蛋白激酶C的激活也可能与NO合成的抑制有关[7]。再者，糖尿病状态下氧自由基产生的增多也可能会加速NO的降解[8]。最后，糖尿病时糖基化终末产物的形成增加也可能加速NO的降解[9]。
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总之，尽管我们发现糖尿病大鼠肾皮质NOS活力增强，iNOS mRNA表达增加，然而NO的含量却反而下降，提示了糖尿病大鼠肾脏存在NO合成障碍和/或降解加速，这一变化可能在糖尿病肾病的发生、发展中起重要作用。
参 考 文 献
1，Corbett JA,Tilton RG,Chang K,et al.Aminoguanidine,a novel inhibitor of NO formation,prevents diabetic vascular dysfunction.Diabetes,1992,41:552.
2，Bank N,Aymedjian HS.Role EDRF(nitic oxide) in diabetic renal hyperfiltration.Kidney Int,1993,43:1306.
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4，Choi KC,Kim NH,An MR,et al.Alterations of intrarenal renin-angiotensin and oxide systems in streptozotocin-induced diabetic rats.Kidney Int,1997,52(Suppl):S23.
5，祈忠华，林善锬.早期糖尿病大鼠肾脏诱生型一氧化氮合成酶基因表达.中华内分泌代谢杂志，1998，14：41.
6，Trachtman H,Futterweit S,Crimmins DL,et al.High glucose inhibits nitric oxide production in cultured rat mesangial cells.J Am Soc Nephrol,1997,8:1276.
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7，Bredt DS,Ferris DC,Snyder H,et al.Nitric oxide synthase regulatory sites:phosphorylation by cyclic AMP-depend protion kinase,protein kinase C and calcium/calmodulin protein kinase:indentification of flavin and calmodulin binding sites.J Biol Chem,1992,267:10976.
8，Pieper GM,Langenstroer P,Siebeneich W,et al.Diabetic-induced endothelial dysfunction in rat aorta:role of hydroxyl radicals.Cardiovascular Research,1997,34:145.
9，Bucala R,Tracey KJ,Cerami A,et al.Advanced glycosylation products quench nitric oxide and mediate defective endothelium-dependent vasodilatation in experimental diabetes.J Clin Invest,1991,87:432.
(收稿：1998-12-03 修回：2000-01-03), 百拇医药