系统性红斑狼疮患者骨髓造血干/祖细胞体外培养及其发病机制的研究
作者：李娟 尹培达 罗绍凯 彭爱华
单位：李娟(510080 广州，中山医科大学附属第一医院血液科) 尹培达(风湿科)；罗绍凯(510080 广州，中山医科大学附属第一医院血液科)；彭爱华(510080 广州，中山医科大学附属第一医院血液科)
关键词：红斑狼疮，系统性；造血干细胞；集落形成单位测定
中华风湿病学杂志000304
【摘 要】 目的 比较正常人与系统性红班狼疮(SLE)患者的造血干/祖细胞生长情况及从造血干/祖细胞水平探讨SLE的发病机制。方法 用半固体甲基纤维素集落培养法观察16例活动期及其中3例经治疗缓解的SLE患者的粒-巨噬细胞集落(GM-CFU)、红系集落(E-CFU)、巨核细胞集落(MK-CFU)。结果 活动期SLE患者的GM-CFU、E-CFU、MK-CFU分别为(182±50)、(56±27)、(8±5)，均明显低于正常对照组，缓解期SLE患者的GM-CFU、E-CFU比活动期的明显增加，而MK-CFU与活动期比较无明显变化。结论 活动期SLE患者的造血干/祖细胞增生、分化功能异常，缓解后的SLE患者其巨核细胞系恢复迟于粒系、红系，SLE的发病可能与造血干/祖细胞的异常有关。
, http://www.100md.com
In vitro SLE hematopoietic stem/progenitor cell growth of bone marrow and research of the pathogenesis
LI Juan,YIN Peida,LUO Shaokai
(Department of Hematology,First Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University of Medical Science,Guangzhou 510080,China)
【Abstract】 Objective To compare SLE patients′ with controls′ hematopoietic stem/progenitor cell growth of bone marrow in vitro and research on the pathogenesis of hematopoietic stem/progenitor cell.Method GM-CFU,E-CFU and MK-CFU of 16 active SLE patients and 3 remission patients were cultured in vitro with semisolid methylcellulose.Results GM-CFU,E-CFU and MK-CFU in active SLE were (182±50),(56±27) and (8±5),respectively,and their yield was lower than that in controls.The yield of GM-CFU and E-CFU in remission patients was higher than in active patients,but MK-CFU had no obvious change in two groups. Conclusion Hematopoietic stem/progenitor cells of active SLE are abnormal in the functions of proliferation and differentiation.Recovery of MK-CFU is later than that of GM-CFU and E-CFU.The abnormality of hematopoietic stem/progenitor cells may be relative to pathogenesis of SLE.
, 百拇医药
【Key words】 Lupus erythematosus,systemic;Hematopoietic stem cell;Colony forming unit assay
系统性红斑狼疮(SLE)的病因尚未完全明了，越来越多的动物实验和临床研究证实，包括SLE在内的自身免疫性疾病存在造血干细胞的异常[1]。本研究旨在体外观察SLE患者骨髓造血干/祖细胞的生长情况，通过其结果进一步探讨SLE的发病机制。
1 资料与方法
1.1 病例来源：选择16例处于活动期及其中3例经治疗后缓解的SLE患者，所有病例诊断符合1982年美国的SLE诊断标准，其活动性采用Bombardier等提出的标准。其中男性3例，女性13例，年龄18～49.5岁，平均年龄33.5岁，16例处于活动期的SLE患者外周血象：红细胞(3.1～3.8)×1012/L，血红蛋白79～98 g/L，白细胞(3.0～4.0)×109/L，血小板(70～99)×109/L；3例经治疗后达缓解的SLE患者红细胞(3.5～4.2)×1012/L，血红蛋白110～120 g/L，白细胞(4.0～7.8)×109/L，血小板(100～300)×109/L。治疗方案：一经确诊，即用糖皮质激素和/或环磷酰胺(CTX)冲击治疗。
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1.2 标本采集：所有病例均取髂前上棘或髂后上棘，抽出骨髓10 ml，用Ficoll液离心，，取出造血干/祖细胞，RPMI-1640洗3次，调整细胞数为2×106/ml。正常对照标本取自异基因骨髓移植供者的骨髓，RPMI-1640洗3次，调整细胞数如上。
1.3 造血干/祖细胞集落培养及鉴定：粒-巨噬细胞集落(GM-CFU)、红系集落(E-CFU)、巨核细胞集落(MK-CFU)的体外培养按常规的方法进行，GM-CFU培养体系，主要包括：终浓度为30%的胎牛血清(FCS)、10%的粒-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、0.9%的甲基纤维素、细胞浓度为2×105/ml，此外， 含少许谷胺酰胺、2-巯基乙醇、双抗(104 U/ml的青霉素和104 μg/ml的链霉素)。培养条件：37 ℃、5%CO2、100%湿度，培养7 d后计数，细胞数≥40个为一集落，3～39个为一丛落。GM-CFU的形态学观察及组织化学分析：用自制的毛细吸管吸出集落细胞于经粘胶处理过的载玻片上，干燥后甲醇固定30 min，瑞氏染色，油镜下可见集落由中性中幼粒细胞、中性杆状核细胞、中性分叶核细胞及少数单核细胞组成，过氧化酶(POX)染色98%的细胞呈阳性反应。E-CFU培养体系包括：30%的AB血浆、1%牛血清白蛋白(BSA)、5% PHA-LCM、1.5 U/ml EPO、0.9%甲基纤维素，细胞浓度及培养条件与GM-CFU相同，培养7 d计数，细胞数≥8个为一集落。E-CFU鉴定用3，3-二甲氧基联苯胺染色，细胞质呈棕黄色(提示细胞质含血红蛋白)。MK-CFU的培养体系主要包括30%的AB血浆、10% FCS、5% PHA-LCM、1 U/ml EPO、1.5 U/ml IL-11、0.9%甲基纤维素，细胞浓度及培养条件与GM-CFU相同，培养12 d计数，细胞数≥3个为一集落。取出集落后用PBS洗2次，离心涂片，瑞氏染色，可见巨核细胞细胞质呈透明状，细胞质有较高的折光性，用抗GPⅡb/Ⅲa单抗CD41免疫酶标检测呈阳性。
, 百拇医药
1.4 统计学处理：用
±s表示，均数之间用t检验。
2 结果
2.1 SLE患者骨髓造血干/祖细胞体外集落(丛落)形成：GM-CFU集落数(182±50)，丛落数(231±92)，E-CFU集落数(56±27)，MK-CFU集落数(8±5)，三系集落(丛落)数与正常对照组差异有显著性，见表1。
表1 SLE患者造血干/祖细胞集落(丛落)数
与正常对照组集落数的比较 组别
例数
GM-CFU
E-CFU
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MK-CFU
集落
丛落
对照组
12
256±80
106±42
89±32
40±16
SLE组
16
182±50
231±92
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56±27
8±5
P值
<0.001
<0.001
<0.05
<0.01
2.2 SLE患者在活动期与缓解期骨髓造血干/祖细胞体外集落(丛落)生成的比较：3例SLE患者在活动期的GM-CFU集落数为(167±40)，丛落数为(245±102)，E-CFU为(48±18)，MK-CFU为(6.2±2.4)，经治疗患者病情缓解后复查骨髓造血干/祖细胞集落(丛落)数，GM-CFU集落数为(230±90)(与活动期相比P<0.01)，丛落数为(131±77)(与活动期相比P<0.01)；E-CFU集落数为(81±33)(与活动期相比P<0.05)，MK-CFU为(8±3)(与活动期相比P>0.05)。
, 百拇医药
3 讨论
有关SLE的发病机制极为复杂，以往一般认为，SLE的发生与体内存在针对自身抗原的免疫反应相关，自身反应性淋巴细胞克隆的激活及自身隐蔽抗原的释放，自身抗体的产生是SLE发病中的主要原因。动物实验中，Lpr小鼠有Fas基因突变[2]，而gld小鼠存在Fasl(Fas配体)基因突变[3]，Fas或Fasl基因突变使B细胞发生内在变化，使B细胞在生发中心逃避程序性死亡(programmed cell death，PCD)，这种B细胞可产生自身抗体而导致自身免疫性疾病的发生。Fas和Fasl基因的异常表达也广泛存在于多种血细胞之中，从而提示这些基因的异常是来源于造血干细胞水平的。70年代以后，随着骨髓移植和外周血干细胞移植的发展，在给伴有自身免疫性疾病的恶性血液系统疾病患者进行造血干细胞移植后发现，在恶性血液系统疾病得到缓解的同时，自身免疫性疾病也得到长期缓解，这些自身免疫性疾病包括银屑病、溃疡性结肠炎、类风湿关节炎、SLE等[4，5]，供者的骨髓细胞也可将1型糖尿病、Graves病、重症肌无力等自身免疫性疾病被动转移给异基因患者；由此认为，包括SLE在内的自身免疫性疾病是在造血干细胞水平的异常。本文用细胞培养方法在排除了患者可能含有自身抗体或其他影响因素下观察了16例处于活动期的SLE患者的造血干/祖细胞的生长情况，实验结果表明，处于活动期的SLE患者造血干/祖细胞无论是粒系(GM-CFU)、红系(E-CFU)或巨核细胞系(MK-CFU)均明显低于对照组，集落的形成意味着造血干/祖细胞增生、分化功能的正常，如果造血干/祖细胞的增生、分化功能有异常，集落形成就会发生障碍，造血干/祖细胞的增生、分化则停留在丛落阶段，三系祖细胞集落形成减少而丛落不减少，说明SLE患者的造血干/祖细胞增生、分化功能有障碍，SLE患者的造血干/祖细胞本身有缺陷，支持SLE患者造血干细胞异常的论点，由于造血干细胞的异常，进而产生异常的T、B细胞及巨噬细胞，最终导致自身免疫性疾病的发生。因此，可以用异基因的方法治疗SLE患者，用正常的造血干/祖细胞代替患者的病态造血干/祖细胞，重建SLE患者的免疫和造血功能。因此，造血干细胞移植治疗包括SLE在内的自身免疫性疾病将会成为自身免疫性疾病治疗的新途径。
, 百拇医药
用激素和CTX冲击治疗获得缓解的3例SLE患者的骨髓造血干/祖细胞的集落形成在粒系、红系明显高于活动期，说明该方案作用于造血干/祖细胞水平，对SLE患者造血干/祖细胞的恢复有帮助，而在巨核细胞系则无明显改善，其原因可能是在三系中，粒系、红系恢复较快，巨核细胞系恢复较慢，这与临床上观察到伴有全血细胞减少的SLE患者经治疗后，血小板恢复落后于白细胞、红细胞的情况是相符的。
基金项目：广东省科委重点攻关基金资助项目(9827820)
参 考 文 献
1,Ikehara S,Good RA,Nakamura T,et al.Rationale for bone marrow transplantation in the treatment of autoimmune disease.Proc Natl Acad Sci USA,1985,82:2483.
, 百拇医药
2,Adachi M,Watanabe-Fukunaga R,Nagata S.Aberrant transcription caused by the insertion of an early transposbale element in an intron of the Fas antigen gene of Lpr mice.Proc Natl Acad Sci USA,1993,90:1756.
3,Takahashi T,Tanaka M,Brannan CI,et al.Generalized lymphoproliferative disease in mice,caused by a point mutation in the Fas ligand.Cell,1994,76:969.
4,Jacobs P,Vincent MD,Martell RW.Prolonged remission of severe refractory rheumatoid arthritis following allogeneic bone marrow transplantation for drug-induced aplastic anaemia.Bone Marrow Transplant,1986,1:237.
5,Yin JA,Jowitt SN.Resolution of immune-mediated disease following allogeneic bone marrow tansplantation for leukemia.Bone Marrow Transplant,1992,9:31.
(收稿日期：1999-10-27), 百拇医药
单位：李娟(510080 广州，中山医科大学附属第一医院血液科) 尹培达(风湿科)；罗绍凯(510080 广州，中山医科大学附属第一医院血液科)；彭爱华(510080 广州，中山医科大学附属第一医院血液科)
关键词：红斑狼疮，系统性；造血干细胞；集落形成单位测定
中华风湿病学杂志000304
【摘 要】 目的 比较正常人与系统性红班狼疮(SLE)患者的造血干/祖细胞生长情况及从造血干/祖细胞水平探讨SLE的发病机制。方法 用半固体甲基纤维素集落培养法观察16例活动期及其中3例经治疗缓解的SLE患者的粒-巨噬细胞集落(GM-CFU)、红系集落(E-CFU)、巨核细胞集落(MK-CFU)。结果 活动期SLE患者的GM-CFU、E-CFU、MK-CFU分别为(182±50)、(56±27)、(8±5)，均明显低于正常对照组，缓解期SLE患者的GM-CFU、E-CFU比活动期的明显增加，而MK-CFU与活动期比较无明显变化。结论 活动期SLE患者的造血干/祖细胞增生、分化功能异常，缓解后的SLE患者其巨核细胞系恢复迟于粒系、红系，SLE的发病可能与造血干/祖细胞的异常有关。
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In vitro SLE hematopoietic stem/progenitor cell growth of bone marrow and research of the pathogenesis
LI Juan,YIN Peida,LUO Shaokai
(Department of Hematology,First Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University of Medical Science,Guangzhou 510080,China)
【Abstract】 Objective To compare SLE patients′ with controls′ hematopoietic stem/progenitor cell growth of bone marrow in vitro and research on the pathogenesis of hematopoietic stem/progenitor cell.Method GM-CFU,E-CFU and MK-CFU of 16 active SLE patients and 3 remission patients were cultured in vitro with semisolid methylcellulose.Results GM-CFU,E-CFU and MK-CFU in active SLE were (182±50),(56±27) and (8±5),respectively,and their yield was lower than that in controls.The yield of GM-CFU and E-CFU in remission patients was higher than in active patients,but MK-CFU had no obvious change in two groups. Conclusion Hematopoietic stem/progenitor cells of active SLE are abnormal in the functions of proliferation and differentiation.Recovery of MK-CFU is later than that of GM-CFU and E-CFU.The abnormality of hematopoietic stem/progenitor cells may be relative to pathogenesis of SLE.
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【Key words】 Lupus erythematosus,systemic;Hematopoietic stem cell;Colony forming unit assay
系统性红斑狼疮(SLE)的病因尚未完全明了，越来越多的动物实验和临床研究证实，包括SLE在内的自身免疫性疾病存在造血干细胞的异常[1]。本研究旨在体外观察SLE患者骨髓造血干/祖细胞的生长情况，通过其结果进一步探讨SLE的发病机制。
1 资料与方法
1.1 病例来源：选择16例处于活动期及其中3例经治疗后缓解的SLE患者，所有病例诊断符合1982年美国的SLE诊断标准，其活动性采用Bombardier等提出的标准。其中男性3例，女性13例，年龄18～49.5岁，平均年龄33.5岁，16例处于活动期的SLE患者外周血象：红细胞(3.1～3.8)×1012/L，血红蛋白79～98 g/L，白细胞(3.0～4.0)×109/L，血小板(70～99)×109/L；3例经治疗后达缓解的SLE患者红细胞(3.5～4.2)×1012/L，血红蛋白110～120 g/L，白细胞(4.0～7.8)×109/L，血小板(100～300)×109/L。治疗方案：一经确诊，即用糖皮质激素和/或环磷酰胺(CTX)冲击治疗。
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1.2 标本采集：所有病例均取髂前上棘或髂后上棘，抽出骨髓10 ml，用Ficoll液离心，，取出造血干/祖细胞，RPMI-1640洗3次，调整细胞数为2×106/ml。正常对照标本取自异基因骨髓移植供者的骨髓，RPMI-1640洗3次，调整细胞数如上。
1.3 造血干/祖细胞集落培养及鉴定：粒-巨噬细胞集落(GM-CFU)、红系集落(E-CFU)、巨核细胞集落(MK-CFU)的体外培养按常规的方法进行，GM-CFU培养体系，主要包括：终浓度为30%的胎牛血清(FCS)、10%的粒-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、0.9%的甲基纤维素、细胞浓度为2×105/ml，此外， 含少许谷胺酰胺、2-巯基乙醇、双抗(104 U/ml的青霉素和104 μg/ml的链霉素)。培养条件：37 ℃、5%CO2、100%湿度，培养7 d后计数，细胞数≥40个为一集落，3～39个为一丛落。GM-CFU的形态学观察及组织化学分析：用自制的毛细吸管吸出集落细胞于经粘胶处理过的载玻片上，干燥后甲醇固定30 min，瑞氏染色，油镜下可见集落由中性中幼粒细胞、中性杆状核细胞、中性分叶核细胞及少数单核细胞组成，过氧化酶(POX)染色98%的细胞呈阳性反应。E-CFU培养体系包括：30%的AB血浆、1%牛血清白蛋白(BSA)、5% PHA-LCM、1.5 U/ml EPO、0.9%甲基纤维素，细胞浓度及培养条件与GM-CFU相同，培养7 d计数，细胞数≥8个为一集落。E-CFU鉴定用3，3-二甲氧基联苯胺染色，细胞质呈棕黄色(提示细胞质含血红蛋白)。MK-CFU的培养体系主要包括30%的AB血浆、10% FCS、5% PHA-LCM、1 U/ml EPO、1.5 U/ml IL-11、0.9%甲基纤维素，细胞浓度及培养条件与GM-CFU相同，培养12 d计数，细胞数≥3个为一集落。取出集落后用PBS洗2次，离心涂片，瑞氏染色，可见巨核细胞细胞质呈透明状，细胞质有较高的折光性，用抗GPⅡb/Ⅲa单抗CD41免疫酶标检测呈阳性。
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1.4 统计学处理：用
±s表示，均数之间用t检验。2 结果
2.1 SLE患者骨髓造血干/祖细胞体外集落(丛落)形成：GM-CFU集落数(182±50)，丛落数(231±92)，E-CFU集落数(56±27)，MK-CFU集落数(8±5)，三系集落(丛落)数与正常对照组差异有显著性，见表1。
表1 SLE患者造血干/祖细胞集落(丛落)数
与正常对照组集落数的比较 组别
例数
GM-CFU
E-CFU
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MK-CFU
集落
丛落
对照组
12
256±80
106±42
89±32
40±16
SLE组
16
182±50
231±92
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56±27
8±5
P值
<0.001
<0.001
<0.05
<0.01
2.2 SLE患者在活动期与缓解期骨髓造血干/祖细胞体外集落(丛落)生成的比较：3例SLE患者在活动期的GM-CFU集落数为(167±40)，丛落数为(245±102)，E-CFU为(48±18)，MK-CFU为(6.2±2.4)，经治疗患者病情缓解后复查骨髓造血干/祖细胞集落(丛落)数，GM-CFU集落数为(230±90)(与活动期相比P<0.01)，丛落数为(131±77)(与活动期相比P<0.01)；E-CFU集落数为(81±33)(与活动期相比P<0.05)，MK-CFU为(8±3)(与活动期相比P>0.05)。
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3 讨论
有关SLE的发病机制极为复杂，以往一般认为，SLE的发生与体内存在针对自身抗原的免疫反应相关，自身反应性淋巴细胞克隆的激活及自身隐蔽抗原的释放，自身抗体的产生是SLE发病中的主要原因。动物实验中，Lpr小鼠有Fas基因突变[2]，而gld小鼠存在Fasl(Fas配体)基因突变[3]，Fas或Fasl基因突变使B细胞发生内在变化，使B细胞在生发中心逃避程序性死亡(programmed cell death，PCD)，这种B细胞可产生自身抗体而导致自身免疫性疾病的发生。Fas和Fasl基因的异常表达也广泛存在于多种血细胞之中，从而提示这些基因的异常是来源于造血干细胞水平的。70年代以后，随着骨髓移植和外周血干细胞移植的发展，在给伴有自身免疫性疾病的恶性血液系统疾病患者进行造血干细胞移植后发现，在恶性血液系统疾病得到缓解的同时，自身免疫性疾病也得到长期缓解，这些自身免疫性疾病包括银屑病、溃疡性结肠炎、类风湿关节炎、SLE等[4，5]，供者的骨髓细胞也可将1型糖尿病、Graves病、重症肌无力等自身免疫性疾病被动转移给异基因患者；由此认为，包括SLE在内的自身免疫性疾病是在造血干细胞水平的异常。本文用细胞培养方法在排除了患者可能含有自身抗体或其他影响因素下观察了16例处于活动期的SLE患者的造血干/祖细胞的生长情况，实验结果表明，处于活动期的SLE患者造血干/祖细胞无论是粒系(GM-CFU)、红系(E-CFU)或巨核细胞系(MK-CFU)均明显低于对照组，集落的形成意味着造血干/祖细胞增生、分化功能的正常，如果造血干/祖细胞的增生、分化功能有异常，集落形成就会发生障碍，造血干/祖细胞的增生、分化则停留在丛落阶段，三系祖细胞集落形成减少而丛落不减少，说明SLE患者的造血干/祖细胞增生、分化功能有障碍，SLE患者的造血干/祖细胞本身有缺陷，支持SLE患者造血干细胞异常的论点，由于造血干细胞的异常，进而产生异常的T、B细胞及巨噬细胞，最终导致自身免疫性疾病的发生。因此，可以用异基因的方法治疗SLE患者，用正常的造血干/祖细胞代替患者的病态造血干/祖细胞，重建SLE患者的免疫和造血功能。因此，造血干细胞移植治疗包括SLE在内的自身免疫性疾病将会成为自身免疫性疾病治疗的新途径。
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用激素和CTX冲击治疗获得缓解的3例SLE患者的骨髓造血干/祖细胞的集落形成在粒系、红系明显高于活动期，说明该方案作用于造血干/祖细胞水平，对SLE患者造血干/祖细胞的恢复有帮助，而在巨核细胞系则无明显改善，其原因可能是在三系中，粒系、红系恢复较快，巨核细胞系恢复较慢，这与临床上观察到伴有全血细胞减少的SLE患者经治疗后，血小板恢复落后于白细胞、红细胞的情况是相符的。
基金项目：广东省科委重点攻关基金资助项目(9827820)
参 考 文 献
1,Ikehara S,Good RA,Nakamura T,et al.Rationale for bone marrow transplantation in the treatment of autoimmune disease.Proc Natl Acad Sci USA,1985,82:2483.
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2,Adachi M,Watanabe-Fukunaga R,Nagata S.Aberrant transcription caused by the insertion of an early transposbale element in an intron of the Fas antigen gene of Lpr mice.Proc Natl Acad Sci USA,1993,90:1756.
3,Takahashi T,Tanaka M,Brannan CI,et al.Generalized lymphoproliferative disease in mice,caused by a point mutation in the Fas ligand.Cell,1994,76:969.
4,Jacobs P,Vincent MD,Martell RW.Prolonged remission of severe refractory rheumatoid arthritis following allogeneic bone marrow transplantation for drug-induced aplastic anaemia.Bone Marrow Transplant,1986,1:237.
5,Yin JA,Jowitt SN.Resolution of immune-mediated disease following allogeneic bone marrow tansplantation for leukemia.Bone Marrow Transplant,1992,9:31.
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