蛋白酪氨酸激酶在IL-1β和TNF-α诱导类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞MAPKs活化中的作用
作者：孙铁铮 吕厚山 药立波
单位：孙铁铮(100044 北京医科大学人民医院骨关节病诊疗研究中心)；吕厚山(100044 北京医科大学人民医院骨关节病诊疗研究中心)；药立波(第四军医大学生化系(药立波)
关键词：关节炎；滑膜；成纤维细胞；蛋白质酪氨酸激酶；有丝分裂原活化蛋白激酶；白细胞介素1；肿瘤坏死因子
中华风湿病学杂志000302 【摘 要】 目的 比较类风湿关节炎(rheumatoid arthritis，RA)与骨关节炎(osteoarthritis，OA)成纤维样滑膜细胞(fibroblast-like synoviocytes，FLS)蛋白酪氨酸磷酸化状态的差异；探讨RA FLS中，蛋白酪氨酸激酶(protein tyrosine kinase，PTK)在IL-1β和TNF-α作用下有丝分裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinase,MAPKs)活化中的作用。方法 滑膜细胞原代培养，流式细胞仪鉴定滑膜细胞型别，提取蛋白进行SDS-PAGE单相电泳和ICE-PAGE双相电泳分离后，用Western blots 检测FLS蛋白磷酸化的状态。结果 滑膜细胞培养至第三代时，CD3、CD14、CD20、CD11b、von Willebrand factor阳性细胞比例小于1%；RA FLS蛋白酪氨酸磷酸化程度是OA FLS的4～6倍；IL-1β和TNF-α可以瞬时引起RA FLS蛋白酪氨酸磷酸化程度增加，并在短时间内激活MAPKs(ERK2，JNK2和p38为主)：genistein对ERK2活化抑制作用显著，而对于JNK2、p38，活化的抑制则较弱。结论 原代培养的滑膜细胞当传代至第三代时即可以获得型别均一的成纤维样滑膜细胞；RA FLS蛋白酪氨酸磷酸化状态较OA FLS明显增高；IL-1β和TNF-α可以瞬时引起RA FLS蛋白酪氨酸磷酸化程度增加，激活MAPKs通路(EPK2、JNK2、p38)，两种因子诱导MAPKs活化过程中PTK依赖途径和PTK非依赖途径并存。
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Role of protein tyrosine kinase in activation of MAPKs induced by IL-1β and TNF-α in fibroblast-like synoviocytes of rheumatoid arthritis
SUN Tiezheng,L Houshan,YAO Libo
(Arthritis Clinical and Research Center,People's Hospital,Beijing Medical University,Beijing 100044,China)
【Abstract】 Objective To evaluate the change of tyrosine phosphorylation status in rheumatoid arthritis fibroblast-like synoviocytes (RA FLS),compared with osteoarthritis (OA) FLS;and to explore the role of protein tyrosine kinase (PTK) in signaling of IL-1β and TNF-α,especially in activation of MAPKs in rheumatoid arthritis fibroblast-like synoviocytes (RA FLS) under the stimulation of IL-1β and TNF-α.Methods RA and OA FLS were primarily cultured; FLS type was defined by flow cytometry.After proteins were isolated from RA FLS and OA FLS,SDS-PAGE single-dimensional electrophoresis and ICE-PAGE two-dimensional electrophoresis were used to fractionate them,followed by Western blots to determine tyrosine phosphorylation status using specific anti-protein tyrosine phosphorylated antibodies.Results In passage 3,the positive cells′ proportion of CD3,CD14,CD11b,CD20,and von Willebrand factor less than 1% respectively.The extent of protein tyrosine phosphorylation in RA FLS is 4～6 times higher than that of OA FLS.IL-1β and TNF-α transiently increased protein tyrosine phosphorylation,and activated MAPKs cascades (mainly ERK2,JNK2,and p38) in RA FLS.The activation of ERK2 induced by the two cytokines was inhibited obviously by genistein,but the inhibitory role on that of JNK2 and p38 was relatively weak.Conclusion Synoviocytes of passage 3 are homogenous population of fibroblast-like synoviocytes;tyrosine phosphorylation status in RA FLS increases much higher than that of OA FLS.During signal transductionf IL-1β and TNF-α in RA FLS,tyrosine phosphorylation is increased transiently;MAPKs cascades are activated in a few minutes (mainly ERK2,JNK2 and p38),PTK has a role in activation of ERK,but has weak effect on that of JNK and p38.
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【Key words】 Arthritis; Synovial membrane; Fibroblasts; Protein tyrosine kinase; Mitogen activated protein kinase; Interleukin-1; Tumor necrosis factor
类风湿关节炎(rheumatoid arthritis，RA)是一种慢性系统性疾病，它的病情进展中综合体现了炎症、自身免疫、滑膜组织增生三种病理生理过程。异常增生的滑膜组织类似于局限性侵袭生长的肿瘤，对关节软骨、骨造成进行性破坏，最终导致关节畸形和不同程度的功能障碍。最近研究发现，RA成纤维样滑膜细胞(fibroblast-like synoviocyte，FLS)具有转化细胞特征，而在骨关节炎中未发现此转化现象的存在。这种转化特性可能是RA疾病发生的早期特征[1]。蛋白酪氨酸激酶在细胞转化和生物信号转导中发挥关键作用[2]。本研究通过比较RA和OA两种不同发病机制的关节病变中成纤维样滑膜细胞酪氨酸磷酸化状态的差异，探讨RA成纤维样滑膜细胞中酪氨酸激酶活性的改变；应用IL-1β、TNF-α作用于RA FLS， 观察两种细胞因子对有丝分裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinase,MAPKs)的激活情况，并应用genistein(特异性酪氨酸激酶抑制剂)，探讨酪氨酸激酶在上述因子诱导RA FLS MAPKs亚家族成员活化的信号转导过程中发挥的作用。
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1 资料与方法
1.1 滑膜细胞的培养：滑膜均取材于北京医科大学人民医院骨关节病诊疗研究中心行膝关节置换术或滑膜切除术的病人，其中RA 20例，OA 20例，所有病人均符合国际诊断标准[3]。术中取出滑膜组织，无菌条件下剪碎，1.0 mg/ml Ⅰ型胶原酶(GIBCO-BRL) 37 ℃消化4 h，离心收集细胞，加入20% FBS-DMEM (GIBCO-BRL)培养液中，置于37 ℃、5% CO2孵箱中令其贴壁生长，24 h后PBS冲洗除去悬浮细胞，待细胞贴壁生长至85%汇满时，胰蛋白酶-EDTA消化进行1∶3传代。本实验采用均为3～5代滑膜细胞。
1.2 滑膜细胞类型鉴定：分别取1～3代滑膜细胞，用0.125 mmol EDTA缓慢消化下来，PBS洗涤，台盼蓝染色计算活细胞数目，分别加入FITC标记的小鼠抗人CD3、CD14、CD20、von Willebrand factor (Serotech UK)和PE标记的小鼠抗人CD11b；4 ℃作用45 min；以含有1%马血清的PBS溶液充分混匀作用1 h，80%酒精固定。实验均按三个平行管设计，重复6次。每次均以FITC和PE标记的鼠源性抗体作为阴性对照。样品集中进行流式细胞仪测定相对荧光强度及各种表面标记阳性细胞比例。
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1.3 细胞蛋白提取和定量：将3～5代滑膜细胞以5×105种于60 mm costar平皿中，贴壁生长至85%汇满时，弃去培养液，预冷的PBS冲洗，加入100 μl细胞裂解液[20 mmol Tris/Cl(pH：7.5)，体积分数为1% NP40，150 mmol NaCl，质量浓度为0.1% NaN3，5 μg/ml aprotinin，1 mmol PMSF，1 mmol EDTA,1 mmol Na3VO4，25 μmol PNP′，1 μmol pepstatin A，1 μmol leupeptin]。刮下细胞，冰上30 min，12 000 r/min离心15 min，取上清，-70 ℃冻存或冻成干粉，采用Bio-Rad DC protein assay进行总蛋白浓度测定。细胞因子作用组(IL-1β或TNF-α)于3～5代RA滑膜细胞静息24 h后加入不同浓度梯度(1、10、100 IU/ml)作用5 min和时间梯度(1、2、5、15min)，抑制剂组在静息12 h加入10 μg/ml genistein-DMSO贮存液，另设DMSO对照组以排除有机溶剂的影响。
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1.4 SDS-PAGE电泳和Western印迹杂交：取30 μg总蛋白，加入5×上样缓冲液[50 mmol Tris/Cl (pH：6.8)，500 mmol DTT，100 mg/ml SDS，20%甘油及溴酚蓝]，进行10% SDS-PAGE电泳，半干转移至硝酸纤维素膜，封闭过夜后，1∶2 000比例分别加入小鼠抗人蛋白酪氨酸磷酸化抗体4G10(Promega)，抗活化形式ERK抗体1∶2 000 (Promega)，抗活化形式JNK抗体1∶2 000(Promega)，抗活化形式p38抗体1∶2 000 (Promega)，室温作用3 h，Tween 20-PBS洗膜5 min×3次，HRP标记相应二抗作用2 h，同上洗膜3次后，ECL (Amersham)化学增强发光，Kodak X线片曝光显像。将上述硝酸纤维素膜4 ℃湿化状态下封闭保存，1周内将膜上抗体洗脱，重新封闭，分别加入非活化形式ERK、JNK、p38抗体(Sant Cruze)，之后加入HRP标记相应二抗，ECL化学增强发光，Kodak X线片曝光显像，作为衡量蛋白上样量一致性的内参照。
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1.5 ICE-PAGE双相电泳：取10 μg干粉状RA和OA细胞裂解提取物，加入双相电泳上样缓冲液(9.7 g urea、5.5 g ampholytes、1.45 g DTT、300 μl 1%溴酚蓝、44.9 ml H2O)。采用Bicinchoninic Acid Protein Assay (Pierce)，确定总蛋白浓度，加入等量蛋白于第一相中，采用Millipore电泳仪，等电聚焦于18 000 V/h后，取下胶条，稳压下进行10% SDS-PAGE第二相电泳，稳流转移至硝酸纤维素膜，以后操作同步骤4。
1.6 图像辉度扫描及统计学处理：将上述发光显影的X片应用四星Bio-Image软件作图像辉度扫描后，进行显著性t检验。
2 结果
原代培养的滑膜细胞，PBS冲洗去除未贴壁的细胞，生长至85%汇满时，经流式细胞仪检测CD3阳性细胞为7.85%；CD14阳性细胞为7.30%；CD20阳性细胞为7.50%；von Willebrand factor阳性细胞为0.85%；CD11b阳性细胞为7.80%。当传代至第三代时，以上各种细胞表面标记阳性细胞均小于1%。所以，原代培养的滑膜细胞当传代至第三代时，即可以认为型别较为均一的成纤维样滑膜细胞，这与国外文献[4]报道相一致。
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蛋白质进行SDS-PAGE单相电泳后进行Western blots检测，结果显示，RA成纤维样滑膜细胞蛋白质酪氨酸磷酸化程度明显高于OA，其中170 000、150 000、110 000、95 000、85 000、70 000、66 000、54 000等条带差异最为显著。RA FLS灰度扫描值为(1 074 346±8 921)；OA平均灰度扫描值为(290 790±2 760)；RA FLS蛋白质酪氨酸磷酸化程度约为OA FLS的4倍(3.8～4.9)。蛋白质进行ICE-PAGE双相电泳进行检测，RA FLS蛋白酪氨酸磷酸化位点较OA FLS明显增多，其中以42 000～95 000间蛋白质酪氨酸磷酸化位点居多，这与单相SDS-PAGE电泳结果相一致。但是被检测出的酪氨酸磷酸化位点较SDS-PAGE明显增多。双相电泳结果进行灰度扫描结果显示，RA FLS灰度扫描值(4 227 672±8 947)；OA FLS的相应值为(663 480±7 962)。二者之间差异有极显著性(P<0.01)，RA FLS灰度值约为RA FLS的6.5倍。
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IL-1β可以在短时间内导致RA FLS蛋白酪氨酸残基磷酸化程度增加，在1～5 min内，110 000、75 000、65 000、54 000蛋白磷酸化逐渐增强，42 000、38 000蛋白于1～5 min磷酸化程度最高以后逐渐减弱。TNF-α也可以在短时间内导致RA FLS蛋白酪氨酸残基磷酸化程度增加。在1～15 min内，110 000、97 000、80 000、75 000、65 000、54 000、38 000蛋白磷酸化逐渐增强，42 000蛋白于5 min磷酸化程度最高，以后逐渐减弱。在genistein作用下，上述各条带密度明显减弱，但不能达到完全抑制。DMSO对于上述条带密度无明显影响。因此我们认为，酪氨酸激酶可能在IL-1β和TNF-α的信号转导中发挥直接或间接作用。
因为MAPKs三个亚家族成员的活化形式均发生Tyr-Xaa-Thr双重位点磷酸化，所以我们推测IL-1β/TNF-α导致p54、p46、p42、p38酪氨酸磷酸化极可能即为MAPKs家族中的JNK2/JNK1、ERK2、p38，为求进一步验证，我们采用抗活化形式MAPKs的抗体进行Western Blots，检测IL-1β和TNF-α刺激下MAPKs家族成员活化的浓度效应及其时相特点的异同。两种因子都可以激活ERK，但是以ERK2(p42)为主，而对于ERK1(p44)活化作用较弱；两种因子对JNK的激活以JNK2(p54)为主，对JNK1(p46)的活化较弱，二者皆可以激活p38。其中，genistein作用下对ERK2的活化明显减弱，但是不能降低到阴性对照水平；genistein对于JNK和p38的活化仅表现部分抑制作用，不如对ERK的抑制作用显著。另外，两种因子的作用具有不同的浓度效应和时相特点：不同浓度IL-1β(1、10、100 IU/ml)对于MAPKs活化无明显区别，10 IU/ml IL-1β刺激不同时间显示：5 min时ERK2活化最明显，但在1～15 min内JNK的活化逐渐增强，IL-1β对于p38在1 min时达到最大活化，以后随时间增加而逐渐减弱。不同浓度TNF-α(1、10、100 IU/ml)作用于RA FLS，10 IU/ml时对于ERK2即可达到最大活化，10 IU/ml TNF-α刺激不同的时间显示5 min时ERK2活化最明显。TNF-α对JNK的激活在10 IU/ml达活化峰值，但是在1～15 min内JNK的活化逐渐增强。TNF-α对于p38的活化在100 IU/ml时达到最大活化，且在1～15 min内逐渐增强。
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将上述硝酸纤维素膜洗脱后，以非活化形式MAPKs重新杂交显示，各条带密度无明显区别，从而证实各孔上样量的一致性。
3 讨论
RA是一种慢性系统性疾病，成纤维样滑膜细胞的转化细胞特征可能是RA疾病的始发环节，并在RA病情进展中以非T细胞依赖方式在关节的破坏过程中发挥重要作用。
在正常细胞的蛋白质中，酪氨酸磷酸化比例很小，但在肿瘤细胞中可以升高达到10～20倍。酪氨酸激酶与细胞生长、增生关系密切，很可能是正常细胞与肿瘤细胞相互转化的关键环节[5]。1992年，Williams等[6]研究发现，RA滑膜中的PTK活性远远高于OA，因此我们推测RA成纤维样滑膜细胞的异常增生和转化特性极可能伴有PTK活性的异常增高。在实验中通过SDS-PAGE单相电泳和ICE-PAGE双相电泳两种方法进一步证实了这一点，为类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞由于转化特性而呈持续活化状态提供了另一佐证。IL-1β和TNF-α在RA的病情进展中发挥着重要作用。在成纤维样滑膜细胞中，二者可以引发相似的生物学效应，例如可以作为成纤维样滑膜细胞的有丝分裂原；促进PGE2、MMPs的合成；诱导其他炎性细胞因子IL-8、IL-6的合成和增加ICAM-1、VCAM-1等黏附分子的表达等[7]。然而IL-1β和TNF-α在RA成纤维样滑膜细胞中的信号传导机制至今尚不明了。
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两种细胞因子的信号转导具有一些共同点。研究发现，IL-1R和TNFR的胞内区与其他细胞因子或生长因子不同，不具备任何激酶活性，但是两种因子却都可以在不同类型的细胞中，诱导一系列蛋白分子发生磷酸化。到目前为止，尚未发现一种特异的信号转导通路介导IL-1β或者TNF-α与相应的反应受体结合后的最早期效应[8，9]。IL-1β信号转导具有细胞特异性，对于不同来源的细胞，可以激活不同的信号分子，从而引发不同的生物学效应，TNF-α亦然[10]。另外，两种因子的信号转导还具有惊人的高效性，在大多数细胞表面，IL-1RI数目不超过100个，但仅需<5%与配体分子结合即可引发很强的生物学效应，而对于其他细胞/生长因子而言，只有达到10～100倍的结合率才能引起相应的效应[10]。TNFR共有两种亚型；55 000的TNFRⅠ、75 000的TNFRⅡ，在绝大多数哺乳动物细胞表面都有表达。虽然表达的水平很低，但与TNF-α和LT都有极高的亲和力。由此可见，IL-1β和TNF-α极可能平行活化多条信号通路，各通路之间相互协同，共同引起放大的生物学效应，这在本实验中IL-1β和TNF-α对于MAPKs通路的激活反应中得到体现。在RA原代培养的滑膜成纤维细胞中，IL-1β和TNF-α都可以同时激活MAPKs亚家族成员中的ERK、JNK、p38三条通路，其中以p42MAPK/ERK、p54JNK、p38为主。
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Graeme[11]研究表明对于正常人成纤维细胞，IL-1、TNF-α可以引起相同的63种蛋白质分子发生磷酸化状态的改变，其中53种磷酸化程度增强，10种磷酸化程度减弱，这些改变的一致性表明IL-1、TNF-α可能诱导相同的早期受体后反应，共享一个或者相似的信号转导通路，我们在实验研究中证实，IL-1β和TNF-α可以同时激活MAPKs三个亚家族成员，这为Graeme的结论提供了一个佐证。然而，IL-1β和TNF-α对于ERK、JNK、p38激活的浓度效应和时间效应明显不同：IL-1β在1、10、100 IU/ml的浓度梯度内对于MAPKs的激活无明显差异，再次说明IL-1信号转导的高效性。
有研究表明，MAPKs可能是多条信号转导通路的交汇点(PKC、RPTK、JAK-STAT、离子通道等)。它将信息整合后传至细胞核，调节转录因子的活性，调控相应基因的表达。ERK途径的经典通路为RPTK-ras-raf-MEK1/2-Erk1/2，主要功能是介导有丝分裂信号向细胞核传递，调控细胞的生长，另外还可能参与细胞分化、转化、细胞周期等生命活动的调节[12]。我们在研究中发现，IL-1β和TNF-α在一定浓度范围内(10 IU/ml)可以发挥有丝分裂原作用促进RA滑膜成纤维细胞的生长。结合本实验结果，我们推测IL-1β和TNF-α的有丝分裂原作用极可能通过ERK2途径介导。JNK、p38的激活与细胞应激性改变如紫外线辐射、渗透压改变、细胞因子作用有关[13]。ERK、JNK、p38不但可由不同的刺激因素激活，形成不同的信号转导通路，激活各不相同的转录因子，调节相应基因的表达，介导生物学效应，而且三条通路在MAPKs上游分子及下游分子都存在“cross talk”， 从而导致三条通路间相互协同作用。
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由此可见，IL-1β和TNF-α在RA滑膜成纤维细胞中激活MAPKs三条通路(ERK、JNK、p38)，三条通路既相互独立，又在不同水平上相互协同，从而可能导致两种细胞因子在RA滑膜成纤维样细胞中引起复杂的生物学效应，进而使RA FLS获得侵蚀骨/软骨的特性。IL-1β和TNF-α如何激活MAPKs通路，目前尚不清楚。蛋白酪氨酸激酶在两种因子信号转导中的作用研究还相当少。文献[14]研究发现IL-1或TNF-α作用于正常成纤维细胞可以激活至少一种PP60c-src，c-src作为细胞质内的原癌基因，具有PTK活性，参与ERK的激活。而且，IL-1或TNF-α可以引起细胞膜上EGFR Thr669发生磷酸化，极可能通过EGFR的聚合而在MAPKs激活中发挥作用[15]。TNF-α可以在FH 109胚肺成纤维细胞、U937单核白血病细胞等细胞系中激活c-raf，c-raf参与ERK经典活化通路。另外，在实验研究中发现RA滑膜成纤维细胞具有转化细胞的表现，伴有PTK活性的升高。如上因素促使我们进一步探讨酪氨酸激酶途径可能参与了IL-1β和TNF-α作用下RA FLS中MAPKs的激活。
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Genistein是从大豆中提取出的4′，5，7-三羟异黄酮，无论在离体情况下还是在细胞整体水平，都具有特异性酪氨酸激酶抑制剂作用；对RPTK和c-src家族的PTK活性抑制尤为敏感[16]。所以，我们应用genistein观察到其对于IL-1β和TNF-α作用下MAPKs的活化的影响。以往我们的研究表明，genistein可以抑制IL-1β和TNF-α对RA FLS的生长促进作用，并抑制二因子作用下FLS细胞周期改变于G1期限制点。因为，IL-1R和TNFR皆无RPTK活性，我们推测c-src等细胞质中非受体酪氨酸激酶可能参与IL-1β/TNF-α对于ERK2的激活，其引发的促进生长效应，因此可由genistein所抑制。但是，genistein对于JNK、p38的抑制作用则较弱，这与genistein对IL-1β诱导肾间质细胞JNK的活化无明显抑制作用的报道相一致[17]。从而表明，IL-1β和TNF-α对于RA成纤维样滑膜细胞MAPKs的激活通路中，既有PTK依赖途径，又有非PTK依赖途径的存在。
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综上所述，对于酪氨酸激酶在RA成纤维样滑膜细胞转化特性及其信号转导中作用的深入研究，必将对RA的疾病发生机制提出新的阐示，并为探讨RA的治疗措施开辟一条新路。
基金项目：国家自然科学基金重点资助项目(39730430)
参 考 文 献
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(收稿日期：1999-12-16), http://www.100md.com
单位：孙铁铮(100044 北京医科大学人民医院骨关节病诊疗研究中心)；吕厚山(100044 北京医科大学人民医院骨关节病诊疗研究中心)；药立波(第四军医大学生化系(药立波)
关键词：关节炎；滑膜；成纤维细胞；蛋白质酪氨酸激酶；有丝分裂原活化蛋白激酶；白细胞介素1；肿瘤坏死因子
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SUN Tiezheng,L Houshan,YAO Libo
(Arthritis Clinical and Research Center,People's Hospital,Beijing Medical University,Beijing 100044,China)
【Abstract】 Objective To evaluate the change of tyrosine phosphorylation status in rheumatoid arthritis fibroblast-like synoviocytes (RA FLS),compared with osteoarthritis (OA) FLS;and to explore the role of protein tyrosine kinase (PTK) in signaling of IL-1β and TNF-α,especially in activation of MAPKs in rheumatoid arthritis fibroblast-like synoviocytes (RA FLS) under the stimulation of IL-1β and TNF-α.Methods RA and OA FLS were primarily cultured; FLS type was defined by flow cytometry.After proteins were isolated from RA FLS and OA FLS,SDS-PAGE single-dimensional electrophoresis and ICE-PAGE two-dimensional electrophoresis were used to fractionate them,followed by Western blots to determine tyrosine phosphorylation status using specific anti-protein tyrosine phosphorylated antibodies.Results In passage 3,the positive cells′ proportion of CD3,CD14,CD11b,CD20,and von Willebrand factor less than 1% respectively.The extent of protein tyrosine phosphorylation in RA FLS is 4～6 times higher than that of OA FLS.IL-1β and TNF-α transiently increased protein tyrosine phosphorylation,and activated MAPKs cascades (mainly ERK2,JNK2,and p38) in RA FLS.The activation of ERK2 induced by the two cytokines was inhibited obviously by genistein,but the inhibitory role on that of JNK2 and p38 was relatively weak.Conclusion Synoviocytes of passage 3 are homogenous population of fibroblast-like synoviocytes;tyrosine phosphorylation status in RA FLS increases much higher than that of OA FLS.During signal transductionf IL-1β and TNF-α in RA FLS,tyrosine phosphorylation is increased transiently;MAPKs cascades are activated in a few minutes (mainly ERK2,JNK2 and p38),PTK has a role in activation of ERK,but has weak effect on that of JNK and p38.
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【Key words】 Arthritis; Synovial membrane; Fibroblasts; Protein tyrosine kinase; Mitogen activated protein kinase; Interleukin-1; Tumor necrosis factor
类风湿关节炎(rheumatoid arthritis，RA)是一种慢性系统性疾病，它的病情进展中综合体现了炎症、自身免疫、滑膜组织增生三种病理生理过程。异常增生的滑膜组织类似于局限性侵袭生长的肿瘤，对关节软骨、骨造成进行性破坏，最终导致关节畸形和不同程度的功能障碍。最近研究发现，RA成纤维样滑膜细胞(fibroblast-like synoviocyte，FLS)具有转化细胞特征，而在骨关节炎中未发现此转化现象的存在。这种转化特性可能是RA疾病发生的早期特征[1]。蛋白酪氨酸激酶在细胞转化和生物信号转导中发挥关键作用[2]。本研究通过比较RA和OA两种不同发病机制的关节病变中成纤维样滑膜细胞酪氨酸磷酸化状态的差异，探讨RA成纤维样滑膜细胞中酪氨酸激酶活性的改变；应用IL-1β、TNF-α作用于RA FLS， 观察两种细胞因子对有丝分裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinase,MAPKs)的激活情况，并应用genistein(特异性酪氨酸激酶抑制剂)，探讨酪氨酸激酶在上述因子诱导RA FLS MAPKs亚家族成员活化的信号转导过程中发挥的作用。
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1 资料与方法
1.1 滑膜细胞的培养：滑膜均取材于北京医科大学人民医院骨关节病诊疗研究中心行膝关节置换术或滑膜切除术的病人，其中RA 20例，OA 20例，所有病人均符合国际诊断标准[3]。术中取出滑膜组织，无菌条件下剪碎，1.0 mg/ml Ⅰ型胶原酶(GIBCO-BRL) 37 ℃消化4 h，离心收集细胞，加入20% FBS-DMEM (GIBCO-BRL)培养液中，置于37 ℃、5% CO2孵箱中令其贴壁生长，24 h后PBS冲洗除去悬浮细胞，待细胞贴壁生长至85%汇满时，胰蛋白酶-EDTA消化进行1∶3传代。本实验采用均为3～5代滑膜细胞。
1.2 滑膜细胞类型鉴定：分别取1～3代滑膜细胞，用0.125 mmol EDTA缓慢消化下来，PBS洗涤，台盼蓝染色计算活细胞数目，分别加入FITC标记的小鼠抗人CD3、CD14、CD20、von Willebrand factor (Serotech UK)和PE标记的小鼠抗人CD11b；4 ℃作用45 min；以含有1%马血清的PBS溶液充分混匀作用1 h，80%酒精固定。实验均按三个平行管设计，重复6次。每次均以FITC和PE标记的鼠源性抗体作为阴性对照。样品集中进行流式细胞仪测定相对荧光强度及各种表面标记阳性细胞比例。
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1.3 细胞蛋白提取和定量：将3～5代滑膜细胞以5×105种于60 mm costar平皿中，贴壁生长至85%汇满时，弃去培养液，预冷的PBS冲洗，加入100 μl细胞裂解液[20 mmol Tris/Cl(pH：7.5)，体积分数为1% NP40，150 mmol NaCl，质量浓度为0.1% NaN3，5 μg/ml aprotinin，1 mmol PMSF，1 mmol EDTA,1 mmol Na3VO4，25 μmol PNP′，1 μmol pepstatin A，1 μmol leupeptin]。刮下细胞，冰上30 min，12 000 r/min离心15 min，取上清，-70 ℃冻存或冻成干粉，采用Bio-Rad DC protein assay进行总蛋白浓度测定。细胞因子作用组(IL-1β或TNF-α)于3～5代RA滑膜细胞静息24 h后加入不同浓度梯度(1、10、100 IU/ml)作用5 min和时间梯度(1、2、5、15min)，抑制剂组在静息12 h加入10 μg/ml genistein-DMSO贮存液，另设DMSO对照组以排除有机溶剂的影响。
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1.4 SDS-PAGE电泳和Western印迹杂交：取30 μg总蛋白，加入5×上样缓冲液[50 mmol Tris/Cl (pH：6.8)，500 mmol DTT，100 mg/ml SDS，20%甘油及溴酚蓝]，进行10% SDS-PAGE电泳，半干转移至硝酸纤维素膜，封闭过夜后，1∶2 000比例分别加入小鼠抗人蛋白酪氨酸磷酸化抗体4G10(Promega)，抗活化形式ERK抗体1∶2 000 (Promega)，抗活化形式JNK抗体1∶2 000(Promega)，抗活化形式p38抗体1∶2 000 (Promega)，室温作用3 h，Tween 20-PBS洗膜5 min×3次，HRP标记相应二抗作用2 h，同上洗膜3次后，ECL (Amersham)化学增强发光，Kodak X线片曝光显像。将上述硝酸纤维素膜4 ℃湿化状态下封闭保存，1周内将膜上抗体洗脱，重新封闭，分别加入非活化形式ERK、JNK、p38抗体(Sant Cruze)，之后加入HRP标记相应二抗，ECL化学增强发光，Kodak X线片曝光显像，作为衡量蛋白上样量一致性的内参照。
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1.5 ICE-PAGE双相电泳：取10 μg干粉状RA和OA细胞裂解提取物，加入双相电泳上样缓冲液(9.7 g urea、5.5 g ampholytes、1.45 g DTT、300 μl 1%溴酚蓝、44.9 ml H2O)。采用Bicinchoninic Acid Protein Assay (Pierce)，确定总蛋白浓度，加入等量蛋白于第一相中，采用Millipore电泳仪，等电聚焦于18 000 V/h后，取下胶条，稳压下进行10% SDS-PAGE第二相电泳，稳流转移至硝酸纤维素膜，以后操作同步骤4。
1.6 图像辉度扫描及统计学处理：将上述发光显影的X片应用四星Bio-Image软件作图像辉度扫描后，进行显著性t检验。
2 结果
原代培养的滑膜细胞，PBS冲洗去除未贴壁的细胞，生长至85%汇满时，经流式细胞仪检测CD3阳性细胞为7.85%；CD14阳性细胞为7.30%；CD20阳性细胞为7.50%；von Willebrand factor阳性细胞为0.85%；CD11b阳性细胞为7.80%。当传代至第三代时，以上各种细胞表面标记阳性细胞均小于1%。所以，原代培养的滑膜细胞当传代至第三代时，即可以认为型别较为均一的成纤维样滑膜细胞，这与国外文献[4]报道相一致。
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蛋白质进行SDS-PAGE单相电泳后进行Western blots检测，结果显示，RA成纤维样滑膜细胞蛋白质酪氨酸磷酸化程度明显高于OA，其中170 000、150 000、110 000、95 000、85 000、70 000、66 000、54 000等条带差异最为显著。RA FLS灰度扫描值为(1 074 346±8 921)；OA平均灰度扫描值为(290 790±2 760)；RA FLS蛋白质酪氨酸磷酸化程度约为OA FLS的4倍(3.8～4.9)。蛋白质进行ICE-PAGE双相电泳进行检测，RA FLS蛋白酪氨酸磷酸化位点较OA FLS明显增多，其中以42 000～95 000间蛋白质酪氨酸磷酸化位点居多，这与单相SDS-PAGE电泳结果相一致。但是被检测出的酪氨酸磷酸化位点较SDS-PAGE明显增多。双相电泳结果进行灰度扫描结果显示，RA FLS灰度扫描值(4 227 672±8 947)；OA FLS的相应值为(663 480±7 962)。二者之间差异有极显著性(P<0.01)，RA FLS灰度值约为RA FLS的6.5倍。
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IL-1β可以在短时间内导致RA FLS蛋白酪氨酸残基磷酸化程度增加，在1～5 min内，110 000、75 000、65 000、54 000蛋白磷酸化逐渐增强，42 000、38 000蛋白于1～5 min磷酸化程度最高以后逐渐减弱。TNF-α也可以在短时间内导致RA FLS蛋白酪氨酸残基磷酸化程度增加。在1～15 min内，110 000、97 000、80 000、75 000、65 000、54 000、38 000蛋白磷酸化逐渐增强，42 000蛋白于5 min磷酸化程度最高，以后逐渐减弱。在genistein作用下，上述各条带密度明显减弱，但不能达到完全抑制。DMSO对于上述条带密度无明显影响。因此我们认为，酪氨酸激酶可能在IL-1β和TNF-α的信号转导中发挥直接或间接作用。
因为MAPKs三个亚家族成员的活化形式均发生Tyr-Xaa-Thr双重位点磷酸化，所以我们推测IL-1β/TNF-α导致p54、p46、p42、p38酪氨酸磷酸化极可能即为MAPKs家族中的JNK2/JNK1、ERK2、p38，为求进一步验证，我们采用抗活化形式MAPKs的抗体进行Western Blots，检测IL-1β和TNF-α刺激下MAPKs家族成员活化的浓度效应及其时相特点的异同。两种因子都可以激活ERK，但是以ERK2(p42)为主，而对于ERK1(p44)活化作用较弱；两种因子对JNK的激活以JNK2(p54)为主，对JNK1(p46)的活化较弱，二者皆可以激活p38。其中，genistein作用下对ERK2的活化明显减弱，但是不能降低到阴性对照水平；genistein对于JNK和p38的活化仅表现部分抑制作用，不如对ERK的抑制作用显著。另外，两种因子的作用具有不同的浓度效应和时相特点：不同浓度IL-1β(1、10、100 IU/ml)对于MAPKs活化无明显区别，10 IU/ml IL-1β刺激不同时间显示：5 min时ERK2活化最明显，但在1～15 min内JNK的活化逐渐增强，IL-1β对于p38在1 min时达到最大活化，以后随时间增加而逐渐减弱。不同浓度TNF-α(1、10、100 IU/ml)作用于RA FLS，10 IU/ml时对于ERK2即可达到最大活化，10 IU/ml TNF-α刺激不同的时间显示5 min时ERK2活化最明显。TNF-α对JNK的激活在10 IU/ml达活化峰值，但是在1～15 min内JNK的活化逐渐增强。TNF-α对于p38的活化在100 IU/ml时达到最大活化，且在1～15 min内逐渐增强。
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将上述硝酸纤维素膜洗脱后，以非活化形式MAPKs重新杂交显示，各条带密度无明显区别，从而证实各孔上样量的一致性。
3 讨论
RA是一种慢性系统性疾病，成纤维样滑膜细胞的转化细胞特征可能是RA疾病的始发环节，并在RA病情进展中以非T细胞依赖方式在关节的破坏过程中发挥重要作用。
在正常细胞的蛋白质中，酪氨酸磷酸化比例很小，但在肿瘤细胞中可以升高达到10～20倍。酪氨酸激酶与细胞生长、增生关系密切，很可能是正常细胞与肿瘤细胞相互转化的关键环节[5]。1992年，Williams等[6]研究发现，RA滑膜中的PTK活性远远高于OA，因此我们推测RA成纤维样滑膜细胞的异常增生和转化特性极可能伴有PTK活性的异常增高。在实验中通过SDS-PAGE单相电泳和ICE-PAGE双相电泳两种方法进一步证实了这一点，为类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞由于转化特性而呈持续活化状态提供了另一佐证。IL-1β和TNF-α在RA的病情进展中发挥着重要作用。在成纤维样滑膜细胞中，二者可以引发相似的生物学效应，例如可以作为成纤维样滑膜细胞的有丝分裂原；促进PGE2、MMPs的合成；诱导其他炎性细胞因子IL-8、IL-6的合成和增加ICAM-1、VCAM-1等黏附分子的表达等[7]。然而IL-1β和TNF-α在RA成纤维样滑膜细胞中的信号传导机制至今尚不明了。
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两种细胞因子的信号转导具有一些共同点。研究发现，IL-1R和TNFR的胞内区与其他细胞因子或生长因子不同，不具备任何激酶活性，但是两种因子却都可以在不同类型的细胞中，诱导一系列蛋白分子发生磷酸化。到目前为止，尚未发现一种特异的信号转导通路介导IL-1β或者TNF-α与相应的反应受体结合后的最早期效应[8，9]。IL-1β信号转导具有细胞特异性，对于不同来源的细胞，可以激活不同的信号分子，从而引发不同的生物学效应，TNF-α亦然[10]。另外，两种因子的信号转导还具有惊人的高效性，在大多数细胞表面，IL-1RI数目不超过100个，但仅需<5%与配体分子结合即可引发很强的生物学效应，而对于其他细胞/生长因子而言，只有达到10～100倍的结合率才能引起相应的效应[10]。TNFR共有两种亚型；55 000的TNFRⅠ、75 000的TNFRⅡ，在绝大多数哺乳动物细胞表面都有表达。虽然表达的水平很低，但与TNF-α和LT都有极高的亲和力。由此可见，IL-1β和TNF-α极可能平行活化多条信号通路，各通路之间相互协同，共同引起放大的生物学效应，这在本实验中IL-1β和TNF-α对于MAPKs通路的激活反应中得到体现。在RA原代培养的滑膜成纤维细胞中，IL-1β和TNF-α都可以同时激活MAPKs亚家族成员中的ERK、JNK、p38三条通路，其中以p42MAPK/ERK、p54JNK、p38为主。
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Graeme[11]研究表明对于正常人成纤维细胞，IL-1、TNF-α可以引起相同的63种蛋白质分子发生磷酸化状态的改变，其中53种磷酸化程度增强，10种磷酸化程度减弱，这些改变的一致性表明IL-1、TNF-α可能诱导相同的早期受体后反应，共享一个或者相似的信号转导通路，我们在实验研究中证实，IL-1β和TNF-α可以同时激活MAPKs三个亚家族成员，这为Graeme的结论提供了一个佐证。然而，IL-1β和TNF-α对于ERK、JNK、p38激活的浓度效应和时间效应明显不同：IL-1β在1、10、100 IU/ml的浓度梯度内对于MAPKs的激活无明显差异，再次说明IL-1信号转导的高效性。
有研究表明，MAPKs可能是多条信号转导通路的交汇点(PKC、RPTK、JAK-STAT、离子通道等)。它将信息整合后传至细胞核，调节转录因子的活性，调控相应基因的表达。ERK途径的经典通路为RPTK-ras-raf-MEK1/2-Erk1/2，主要功能是介导有丝分裂信号向细胞核传递，调控细胞的生长，另外还可能参与细胞分化、转化、细胞周期等生命活动的调节[12]。我们在研究中发现，IL-1β和TNF-α在一定浓度范围内(10 IU/ml)可以发挥有丝分裂原作用促进RA滑膜成纤维细胞的生长。结合本实验结果，我们推测IL-1β和TNF-α的有丝分裂原作用极可能通过ERK2途径介导。JNK、p38的激活与细胞应激性改变如紫外线辐射、渗透压改变、细胞因子作用有关[13]。ERK、JNK、p38不但可由不同的刺激因素激活，形成不同的信号转导通路，激活各不相同的转录因子，调节相应基因的表达，介导生物学效应，而且三条通路在MAPKs上游分子及下游分子都存在“cross talk”， 从而导致三条通路间相互协同作用。
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由此可见，IL-1β和TNF-α在RA滑膜成纤维细胞中激活MAPKs三条通路(ERK、JNK、p38)，三条通路既相互独立，又在不同水平上相互协同，从而可能导致两种细胞因子在RA滑膜成纤维样细胞中引起复杂的生物学效应，进而使RA FLS获得侵蚀骨/软骨的特性。IL-1β和TNF-α如何激活MAPKs通路，目前尚不清楚。蛋白酪氨酸激酶在两种因子信号转导中的作用研究还相当少。文献[14]研究发现IL-1或TNF-α作用于正常成纤维细胞可以激活至少一种PP60c-src，c-src作为细胞质内的原癌基因，具有PTK活性，参与ERK的激活。而且，IL-1或TNF-α可以引起细胞膜上EGFR Thr669发生磷酸化，极可能通过EGFR的聚合而在MAPKs激活中发挥作用[15]。TNF-α可以在FH 109胚肺成纤维细胞、U937单核白血病细胞等细胞系中激活c-raf，c-raf参与ERK经典活化通路。另外，在实验研究中发现RA滑膜成纤维细胞具有转化细胞的表现，伴有PTK活性的升高。如上因素促使我们进一步探讨酪氨酸激酶途径可能参与了IL-1β和TNF-α作用下RA FLS中MAPKs的激活。
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Genistein是从大豆中提取出的4′，5，7-三羟异黄酮，无论在离体情况下还是在细胞整体水平，都具有特异性酪氨酸激酶抑制剂作用；对RPTK和c-src家族的PTK活性抑制尤为敏感[16]。所以，我们应用genistein观察到其对于IL-1β和TNF-α作用下MAPKs的活化的影响。以往我们的研究表明，genistein可以抑制IL-1β和TNF-α对RA FLS的生长促进作用，并抑制二因子作用下FLS细胞周期改变于G1期限制点。因为，IL-1R和TNFR皆无RPTK活性，我们推测c-src等细胞质中非受体酪氨酸激酶可能参与IL-1β/TNF-α对于ERK2的激活，其引发的促进生长效应，因此可由genistein所抑制。但是，genistein对于JNK、p38的抑制作用则较弱，这与genistein对IL-1β诱导肾间质细胞JNK的活化无明显抑制作用的报道相一致[17]。从而表明，IL-1β和TNF-α对于RA成纤维样滑膜细胞MAPKs的激活通路中，既有PTK依赖途径，又有非PTK依赖途径的存在。
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综上所述，对于酪氨酸激酶在RA成纤维样滑膜细胞转化特性及其信号转导中作用的深入研究，必将对RA的疾病发生机制提出新的阐示，并为探讨RA的治疗措施开辟一条新路。
基金项目：国家自然科学基金重点资助项目(39730430)
参 考 文 献
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