云南汉族系统性红斑狼疮与HLA-DR DQ相关性的研究
作者：李峰 冒长峙 邵剑春 李学平 安肇璋 邓丹琪 胡大春 周晓鸿
单位：李峰(第一作者现在上海医科大学华山医院 皮肤科，200040)；冒长峙(650101 昆明医学院附属第二医院皮肤科)；邵剑春(昆明市第一人民医院检验科)；李学平(650101 昆明医学院附属第二医院皮肤科)；安肇璋(昆明市第一人民医院检验科)；邓丹琪(650101 昆明医学院附属第二医院皮肤科)
关键词：
中华风湿病学杂志000317 近年来研究表明，遗传因素在系统性红斑狼疮(SLE)的发病中起着重要的作用。SLE在某些种 族人群中的发病率明显高于其他种族，狼疮发病具有家庭聚集倾向，10%～12%的有1位或1位 以上的一级亲属发病，同卵双生子SLE发病的一致率(25%～70%)明显高于异卵双生子(2%～9% )。HLA是迄今发现的最具多态性的遗传系统，它具有地区、种族、民族等的差异，其中HLA-DQ、DR等位基因的多态性与SLE易感性是近几年研究 的热点。本文运用单克隆抗体微量淋巴毒试验(monoclonal antibodies microcytotoxicity assay)，探讨云南汉族SLE的HLA-DR、DQ的多态性。
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1 资料与方法
1.1 一般资料
云南汉族SLE病人40例，其中男6例，女34例，年龄15～53岁，平均32岁。所有SLE病人符合 美国风湿病(1982)诊断标准。健康云南汉族人对照46名，其中男9名，女37名，年龄18～57 岁，平均34岁。汉族SLE病人和汉族正常健康人对照均为云南籍贯。SLE患者及正常健康人对 照之间均无血缘关系。
1.2 单克隆抗体-微量淋巴毒试验
1.2.1 单克隆抗体Ⅱ类干板(lambda monoclonal dry traysTM)，产品编号MDR172 ，美国莱姆德公司产品，HLA-DR特异性单抗54个，可确定的亚型有DR1、DR103、DR2、DR16 、DR17、DR3、DR18、DR4、DR402、DR404、DR11、DR12、DR1301、DR1302、DR1303、DR1304 、DR1305、DR1401～1410、DR7、DR8、DR9、DR10；DR51、DR52、DR53；DQ特异性单抗有14 个，可确定DQ1、DQ6、DQ5、DQ7、DQ8、DQ9、DQ2、DQ4。
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1.2.2 实验步骤：静脉血10 ml，加肝素100 U抗凝→分离淋巴细胞→尼龙棉方法分离B淋 巴细胞→10×106/ml细胞悬液→加入HLA-Ⅱ类单克隆干板→加入补体、甲醛封板→读板 及描述反应。
1.3 抗ds-DNA抗体和ENA抗体
抗ds-DNA抗体用间接免疫荧光法，ENA抗体用Western Blot法检测(恒佳生物制品公司产品) 。
1.4 统计学处理
抗原频率(Af)为阳性抗原数除以检测例数，计算基因频率(Gf)，
。Fisher精确概率法计算χ2值和P值，采用Bonferroni法[1]校正 P值(Pc)即：P值乘以试验系统所检测的抗原阳性数。显著性检验水平为α＝0.05。
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2 结果
2.1 SLE患者HLA-DR、DQ多态性：40例SLE患者DR18的抗原频率、基因频率(Af 52.5%，G f 31.1%)与46名正常对照(Af 4.3%，Gf 2.2%)比较差异有显著性(Pc<0.001)；SLE 患者DR12的抗原频率、基因频率(Af 2.5%，Gf 1.3%)明显低于正常汉族人(Af 41.3%，Gf 23.4%)(Pc<0.001)；SLE患者的DQ6的抗原频率、基因频率(Af 42.5%，Gf 24.1%) 与正常人的(Af 21.7%，Gf 11.5%)比较差异有显著性(P＝0.038)，但校正后无统计 学差异(Pc>0.05)；DQ7的抗原频率、基因频率(Af 40%，Gf 22.5%)与正常人的(Af 6 9.6%，Gf 44.8%)比较差异有显著性(P＝0.005 9)，但校正后无统计学差异(Pc >0.05)。
2.2 SLE患者的易感单体型和保护单体型：根据对30例SLE患者的单体型的检测和对35名正 常人的单体型的估计，结果显示：汉族SLE患者的DR52-DR18-DQ4检出频率(42.5%)明显高 于对照组(4.3%)(Pc<0.001)；而DR52-DR12-DQ7单体型检出频率(1.0%)明显低于 对照组(24.8%)(Pc<0.001)。
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2.3 SLE患者的自身抗体和临床资料与HLA-DR、DQ多态性的相关性：汉族抗ds-DNA抗体 与DR15(P＝0.024)、DR18(P＝0.01)、DQ4(P＝0.001)及单体型DR18-DQ4( P＝0.001)，抗SSA抗体与DQ4(P＝0.011)呈正相关。汉族的SLE患者血液系统受损 与单体型DR15-DQ6有关(χ2＝7.38，P<0.01)；皮损与DR18-DQ4相关(χ2＝6 .55，P＝0.011)。
3 讨论
国内外许多学者研究表明，SLE与HLA-DR、DQ的相关性存在着种族和人群的差异。由于血清 学微量淋巴毒试验特异性差，容易发生错检或漏检。近10年来，应用分子生物学方法检测HL A特异性发展很快，通过对抗原分子水平的研究，大部分HLA抗原血清学检测结果得到证实。 HLA单克隆抗体与血清板比较具有对抗原决定簇的识别特异、单价特异性、滴度高和无抗补 体活性等优点，它克服了血清特异性、效价以及来源方面的不足，并可识别大部分HLA抗原 亚型，其结果与DNA结果一致。
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Reveille等[2]用血清学方法报道西欧白种人SLE与DR3相关，而中欧白种人、中国 人、日本人及美国黑人与DR2相关。Arnertt等报道西欧白人SLE患者DR2和DR3位点频率增高 。Hawkins等[3]报道100例中国狼疮患者DR2位点频率显著增高。杨颖等报道中国 湖北汉族SLE患者的DRB1*0301等位基因频率增高。本文报道了云南汉族SLE与HLA-DR18、DQ 6呈正相关，与DR12、DQ7呈负相关。文献[4]报道云南白族SLE与DR15、DQ6呈正相关，而 与DR12、DQ7呈负相关。潘星华等[5]报道沪籍汉族的易感基因为DQA10102、*040 1，DQB1*0601，保护基因为DQA1*0501、*0601，DQB1*0301，推测易感单体型为DQA1*0102- DQB1*0602-DRB1*1501-DRB5*0101、DQA1*0401-DQB1*0402-DRB1*0802，抵抗单体型为DQ A1*0501-DQB1*0301-DRB1*1101(DR5)或*1201(DR5)-DRB3*0202(DR52)或*0101(DR51)、DQ A1*0501-DQB1*0201-DRB1*0301-DRB3*0202。国内迄今为止还没有关于SLE群体调查DR-D Q单体型的报告，云南白族SLE的易感单体型DR51-DR15-DQ6，保护单体型DR52-DR11-DQ7 与Dong等[6]报道的单体型和国内潘星华等推测的单体型结果一致，汉族SLE的 保护单体型DR52-DR12-DQ7与潘星华等报告的一致，而云南汉族SLE的易感单体型DR52- DR18-DQ4与潘星华等报道的单体型不一致。综合国外部分资料白种人与DQA1*0501、DQA1*0 201(英国)、DQA1*0401(美国)正相关，黑人与DQA10401、0501正相关。白人和黑人的易感 基因在华人中为抵抗基因，可能是由于白人和黑人DR3与DQA1*0501连锁，且其SLE的DR3基因 频率升高。国内外众多研究资料表明DR、DQ与SLE的相关性有其种族和地区的差异，原因可 能为DR与DQ的连锁关系不同所致(DR2与DQA1*0102-DQB1*0601或*0602连锁，DR3与DQA1*050 1或DQ2或DQ4连锁)。同时我国不同地区的汉族SLE与DR的相关性不同，可能存在着DR与DQ或 其他等位基因不同的连锁性。
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DQA、DQB链的某些氨基酸序列与特定的自身抗体产生有关。如Khanduja等[7]报道 某些HLA-DQB1*0602、*0201、*0302三个等位基因编码的抗原分子外测第14位氨基酸都是甲 硫氨酸，第26位都是亮氨酸，它们与抗dsDNA抗体有很强的相关性，另外抗dsDNA抗体的患者 96%有DQB1*0201(与DR3或DR7连锁)或DQB1*0602(与DR2或DRW6连锁)或DQB1*0302(与DR4连锁) ；抗Ro/La抗体产生与DQA1链的第34位谷氨酸和/或DQB1链的26位亮氨酸相关；抗Sm抗体与DR 2、DQA1*0102(DQ6)、DQB1*0602有关。本文汉族SLE的抗Sm抗体与DQ6及单体型DR2-DQ6，与 上述结果部分一致，而汉族SLE的抗dsDNA抗体与DR18相关国内未见报道，可能是云南汉族SL E的DR18频率显著升高所致。
以前有学者报道了DR2与狼疮肾炎及神经系统受损相关，我们研究发现SLE血液系统的受损 与DR18-DQ4相关，皮损与DR15-DQ6相关，这说明DQ等位基因的多态性不但与自身抗体有关 而且与临床表现也有一定的联系，表明DQ等位基因及其连锁群与自身抗体及临床表现的关联 基本相同。
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作者单位：胡大春(昆明市第一人民医院检验科)
周晓鸿(650101 昆明医学院附属第二医院皮肤科)
参 考 文 献
1,赵桐茂，主编.HLA的分型原理和运用.上海：上海科学出版社，1982.209.
2,Reveille JD,Moulds JM,Arnett C.Major hisrocompatibility complex class Ⅱ and C4 alleles in Mexican Amricans with systemic lupus erythematosus.Tissue A ntigen,1995,45:91-97.
3,Hawkins BR,Wong RW.Strong association between the major hisocompatibil ity complex and systemic lupus eythematosus in southern chinese.J Rheumatol,1987 ,14:1128-1130.
, 百拇医药
4,李峰，冒长峙，邵剑春，等.云南白族系统性红斑狼疮与HLA-DR、DQ相关性的研究.中华皮肤科杂志，2000，33：33.
5,潘星华，陆建荣，猪子英俊.中国汉人HLA-DQA1基因对系统性红斑狼疮的遗传 易感性研究.中华免疫学杂志，1995，11：19-22.
6,Dong RP,Kimura A,Hasimoto H,et al.Difference in HLA linked genetic bac kgroud between mixed connetive disease and systemic lupus erythematosus.Tissue A ntigens,1993,41:19-21.
7,Khanduja JA,Arnett FC,Reveille AD,et al.HLA-DQ beta genes encode and epitope for lupus specific DNA antibodies(Abstr).Clin Res,1991,38:975A.
(收稿日期：1999-03-22)
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单位：李峰(第一作者现在上海医科大学华山医院 皮肤科，200040)；冒长峙(650101 昆明医学院附属第二医院皮肤科)；邵剑春(昆明市第一人民医院检验科)；李学平(650101 昆明医学院附属第二医院皮肤科)；安肇璋(昆明市第一人民医院检验科)；邓丹琪(650101 昆明医学院附属第二医院皮肤科)
关键词：
中华风湿病学杂志000317 近年来研究表明，遗传因素在系统性红斑狼疮(SLE)的发病中起着重要的作用。SLE在某些种 族人群中的发病率明显高于其他种族，狼疮发病具有家庭聚集倾向，10%～12%的有1位或1位 以上的一级亲属发病，同卵双生子SLE发病的一致率(25%～70%)明显高于异卵双生子(2%～9% )。HLA是迄今发现的最具多态性的遗传系统，它具有地区、种族、民族等的差异，其中HLA-DQ、DR等位基因的多态性与SLE易感性是近几年研究 的热点。本文运用单克隆抗体微量淋巴毒试验(monoclonal antibodies microcytotoxicity assay)，探讨云南汉族SLE的HLA-DR、DQ的多态性。
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1 资料与方法
1.1 一般资料
云南汉族SLE病人40例，其中男6例，女34例，年龄15～53岁，平均32岁。所有SLE病人符合 美国风湿病(1982)诊断标准。健康云南汉族人对照46名，其中男9名，女37名，年龄18～57 岁，平均34岁。汉族SLE病人和汉族正常健康人对照均为云南籍贯。SLE患者及正常健康人对 照之间均无血缘关系。
1.2 单克隆抗体-微量淋巴毒试验
1.2.1 单克隆抗体Ⅱ类干板(lambda monoclonal dry traysTM)，产品编号MDR172 ，美国莱姆德公司产品，HLA-DR特异性单抗54个，可确定的亚型有DR1、DR103、DR2、DR16 、DR17、DR3、DR18、DR4、DR402、DR404、DR11、DR12、DR1301、DR1302、DR1303、DR1304 、DR1305、DR1401～1410、DR7、DR8、DR9、DR10；DR51、DR52、DR53；DQ特异性单抗有14 个，可确定DQ1、DQ6、DQ5、DQ7、DQ8、DQ9、DQ2、DQ4。
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1.2.2 实验步骤：静脉血10 ml，加肝素100 U抗凝→分离淋巴细胞→尼龙棉方法分离B淋 巴细胞→10×106/ml细胞悬液→加入HLA-Ⅱ类单克隆干板→加入补体、甲醛封板→读板 及描述反应。
1.3 抗ds-DNA抗体和ENA抗体
抗ds-DNA抗体用间接免疫荧光法，ENA抗体用Western Blot法检测(恒佳生物制品公司产品) 。
1.4 统计学处理
抗原频率(Af)为阳性抗原数除以检测例数，计算基因频率(Gf)，
。Fisher精确概率法计算χ2值和P值，采用Bonferroni法[1]校正 P值(Pc)即：P值乘以试验系统所检测的抗原阳性数。显著性检验水平为α＝0.05。, 百拇医药
2 结果
2.1 SLE患者HLA-DR、DQ多态性：40例SLE患者DR18的抗原频率、基因频率(Af 52.5%，G f 31.1%)与46名正常对照(Af 4.3%，Gf 2.2%)比较差异有显著性(Pc<0.001)；SLE 患者DR12的抗原频率、基因频率(Af 2.5%，Gf 1.3%)明显低于正常汉族人(Af 41.3%，Gf 23.4%)(Pc<0.001)；SLE患者的DQ6的抗原频率、基因频率(Af 42.5%，Gf 24.1%) 与正常人的(Af 21.7%，Gf 11.5%)比较差异有显著性(P＝0.038)，但校正后无统计 学差异(Pc>0.05)；DQ7的抗原频率、基因频率(Af 40%，Gf 22.5%)与正常人的(Af 6 9.6%，Gf 44.8%)比较差异有显著性(P＝0.005 9)，但校正后无统计学差异(Pc >0.05)。
2.2 SLE患者的易感单体型和保护单体型：根据对30例SLE患者的单体型的检测和对35名正 常人的单体型的估计，结果显示：汉族SLE患者的DR52-DR18-DQ4检出频率(42.5%)明显高 于对照组(4.3%)(Pc<0.001)；而DR52-DR12-DQ7单体型检出频率(1.0%)明显低于 对照组(24.8%)(Pc<0.001)。
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2.3 SLE患者的自身抗体和临床资料与HLA-DR、DQ多态性的相关性：汉族抗ds-DNA抗体 与DR15(P＝0.024)、DR18(P＝0.01)、DQ4(P＝0.001)及单体型DR18-DQ4( P＝0.001)，抗SSA抗体与DQ4(P＝0.011)呈正相关。汉族的SLE患者血液系统受损 与单体型DR15-DQ6有关(χ2＝7.38，P<0.01)；皮损与DR18-DQ4相关(χ2＝6 .55，P＝0.011)。
3 讨论
国内外许多学者研究表明，SLE与HLA-DR、DQ的相关性存在着种族和人群的差异。由于血清 学微量淋巴毒试验特异性差，容易发生错检或漏检。近10年来，应用分子生物学方法检测HL A特异性发展很快，通过对抗原分子水平的研究，大部分HLA抗原血清学检测结果得到证实。 HLA单克隆抗体与血清板比较具有对抗原决定簇的识别特异、单价特异性、滴度高和无抗补 体活性等优点，它克服了血清特异性、效价以及来源方面的不足，并可识别大部分HLA抗原 亚型，其结果与DNA结果一致。
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Reveille等[2]用血清学方法报道西欧白种人SLE与DR3相关，而中欧白种人、中国 人、日本人及美国黑人与DR2相关。Arnertt等报道西欧白人SLE患者DR2和DR3位点频率增高 。Hawkins等[3]报道100例中国狼疮患者DR2位点频率显著增高。杨颖等报道中国 湖北汉族SLE患者的DRB1*0301等位基因频率增高。本文报道了云南汉族SLE与HLA-DR18、DQ 6呈正相关，与DR12、DQ7呈负相关。文献[4]报道云南白族SLE与DR15、DQ6呈正相关，而 与DR12、DQ7呈负相关。潘星华等[5]报道沪籍汉族的易感基因为DQA10102、*040 1，DQB1*0601，保护基因为DQA1*0501、*0601，DQB1*0301，推测易感单体型为DQA1*0102- DQB1*0602-DRB1*1501-DRB5*0101、DQA1*0401-DQB1*0402-DRB1*0802，抵抗单体型为DQ A1*0501-DQB1*0301-DRB1*1101(DR5)或*1201(DR5)-DRB3*0202(DR52)或*0101(DR51)、DQ A1*0501-DQB1*0201-DRB1*0301-DRB3*0202。国内迄今为止还没有关于SLE群体调查DR-D Q单体型的报告，云南白族SLE的易感单体型DR51-DR15-DQ6，保护单体型DR52-DR11-DQ7 与Dong等[6]报道的单体型和国内潘星华等推测的单体型结果一致，汉族SLE的 保护单体型DR52-DR12-DQ7与潘星华等报告的一致，而云南汉族SLE的易感单体型DR52- DR18-DQ4与潘星华等报道的单体型不一致。综合国外部分资料白种人与DQA1*0501、DQA1*0 201(英国)、DQA1*0401(美国)正相关，黑人与DQA10401、0501正相关。白人和黑人的易感 基因在华人中为抵抗基因，可能是由于白人和黑人DR3与DQA1*0501连锁，且其SLE的DR3基因 频率升高。国内外众多研究资料表明DR、DQ与SLE的相关性有其种族和地区的差异，原因可 能为DR与DQ的连锁关系不同所致(DR2与DQA1*0102-DQB1*0601或*0602连锁，DR3与DQA1*050 1或DQ2或DQ4连锁)。同时我国不同地区的汉族SLE与DR的相关性不同，可能存在着DR与DQ或 其他等位基因不同的连锁性。
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DQA、DQB链的某些氨基酸序列与特定的自身抗体产生有关。如Khanduja等[7]报道 某些HLA-DQB1*0602、*0201、*0302三个等位基因编码的抗原分子外测第14位氨基酸都是甲 硫氨酸，第26位都是亮氨酸，它们与抗dsDNA抗体有很强的相关性，另外抗dsDNA抗体的患者 96%有DQB1*0201(与DR3或DR7连锁)或DQB1*0602(与DR2或DRW6连锁)或DQB1*0302(与DR4连锁) ；抗Ro/La抗体产生与DQA1链的第34位谷氨酸和/或DQB1链的26位亮氨酸相关；抗Sm抗体与DR 2、DQA1*0102(DQ6)、DQB1*0602有关。本文汉族SLE的抗Sm抗体与DQ6及单体型DR2-DQ6，与 上述结果部分一致，而汉族SLE的抗dsDNA抗体与DR18相关国内未见报道，可能是云南汉族SL E的DR18频率显著升高所致。
以前有学者报道了DR2与狼疮肾炎及神经系统受损相关，我们研究发现SLE血液系统的受损 与DR18-DQ4相关，皮损与DR15-DQ6相关，这说明DQ等位基因的多态性不但与自身抗体有关 而且与临床表现也有一定的联系，表明DQ等位基因及其连锁群与自身抗体及临床表现的关联 基本相同。
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作者单位：胡大春(昆明市第一人民医院检验科)
周晓鸿(650101 昆明医学院附属第二医院皮肤科)
参 考 文 献
1,赵桐茂，主编.HLA的分型原理和运用.上海：上海科学出版社，1982.209.
2,Reveille JD,Moulds JM,Arnett C.Major hisrocompatibility complex class Ⅱ and C4 alleles in Mexican Amricans with systemic lupus erythematosus.Tissue A ntigen,1995,45:91-97.
3,Hawkins BR,Wong RW.Strong association between the major hisocompatibil ity complex and systemic lupus eythematosus in southern chinese.J Rheumatol,1987 ,14:1128-1130.
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4,李峰，冒长峙，邵剑春，等.云南白族系统性红斑狼疮与HLA-DR、DQ相关性的研究.中华皮肤科杂志，2000，33：33.
5,潘星华，陆建荣，猪子英俊.中国汉人HLA-DQA1基因对系统性红斑狼疮的遗传 易感性研究.中华免疫学杂志，1995，11：19-22.
6,Dong RP,Kimura A,Hasimoto H,et al.Difference in HLA linked genetic bac kgroud between mixed connetive disease and systemic lupus erythematosus.Tissue A ntigens,1993,41:19-21.
7,Khanduja JA,Arnett FC,Reveille AD,et al.HLA-DQ beta genes encode and epitope for lupus specific DNA antibodies(Abstr).Clin Res,1991,38:975A.
(收稿日期：1999-03-22)
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