两种微囊化成猪胰岛的体外培养比较
作者：缪珩 徐家蓉 游娜 汪晓农
单位：缪珩(南京医科大学第二附属医院 210011)； 徐家蓉(南京医科大学第二附属医院 210011)； 游娜(南京医科大学第二附属医院 210011)； 汪晓农(南京医科大学第二附属医院 210011)
关键词：胰岛；微囊化；细胞培养
两种微囊化成猪胰岛的体外培养比较 摘要：目的 通过体外培养比较两种不同微囊化成猪胰岛的功能。方法 将分离的成猪胰岛分成三组：对照组、琼脂糖微囊组和海藻酸钠微囊组,并置于CO2培养箱中培养6天。结果 三组胰岛细胞培养液中胰岛素水平在培养第2天和第4天时没有显著差异,第6天时对照组与两组微囊化组比较有显著差异,而后两组间无明显差异。胰岛素刺激释放试验结果三组间无显著差异。结论 两种不同包膜的微囊化成猪胰岛具有相似的活性,能稳定分泌胰岛素,两组间无显著差异。
, 百拇医药
Comparison of two types of microencapsulated adult pig pancreatic islets in vitro
MIAO Heng,XU Jiarong,YOU Na,et al
(The Second Affiliated Hospital of Nanjing Medical University,Nanjing 210011)
Abstract：Objective To compare the functions of two types of microencapsulated adult pig pancreatic islets in vitro.Methods Isolated adult pig islets were divided into three groups：control group,encapsulated plus agarose group and encapsulated plus alginate group,and then cultured six days at 37℃ and 5% CO2.Meantime the insulin levels of the culture media were determined.Results (1)At the second and fourth days of culture,there was no significant difference in the levels of insulin of the three groups.At the sixth day,significant difference was observed between the control and two encapsulate groups (P<0.05),but no difference between the two encapsulated groups；(2) There was not any significant difference in the results of insulin stimulating releasing test among the three groups.Conclusion The two types of microencapsulated adult pig islets with different immuno-isolation membrane had similar bioactivity.Both could secrete insulin steadily.And there was no significant difference among the groups.
, 百拇医药
Key words：Islet Microencapsulate Cell culture▲
免疫排斥是胰岛组织移植中的最大障碍,近年来发展的免疫隔离膜技术可能是解决同种异体和异种胰岛移植免疫排斥的有效方法之一。目前有数种不同的免疫隔离膜,其中较常用的有海藻酸钠-聚赖氨酸膜和琼脂糖膜,均在动物实验中取得一定疗效,但这两种方法哪一种效果更佳尚无一致的结论。本文对同一来源移植物分别采用海藻酸钠-聚赖氨酸和琼脂糖制备的微囊化胰岛进行体外培养,并加以比较。
材料和方法
一、移植物的制备
从成猪体内取出胰腺(热缺血时间<20分钟),立即置于冷Hanks液中,去除脂肪及结缔组织,用蚊式剪将胰腺剪成1 mm3左右小块,冲洗数次后,离心去上清液,加至V型胶原酶溶液(1g/L)中,在40℃恒温水浴振荡器中消化8分钟,连续两次,振荡频率140次/分,用含10%小牛血清的冷Hanks液终止消化,进一步剔去结缔组织后,分成三份,离心去上清液,一份直接转入盛有培养基RPMI 1640的培养瓶中培养,另二份分别制备成海藻酸钠-聚赖氨酸微囊和琼脂糖微囊后转入盛有RPMI 1640的培养瓶中培养。
, http://www.100md.com
二、海藻酸钠-聚赖氨酸微囊的制备
主要材料有多聚赖氨酸、CHES(Sigma产品),海藻酸钠(上海生物试剂厂产品),参照文献[1]将成猪胰岛经海藻酸钙和多聚赖氨酸包裹成囊后培养。
三、琼脂糖微囊的制备
主要材料为琼脂糖(上海生物试剂厂出品),参照文献[4]将成猪胰岛经琼脂糖包裹成囊后培养。
四、细胞培养及胰岛素刺激释放试验
将三种胰岛分别加入含20%胎牛血清,链霉素100 μg/ml,青霉素100 μg/ml的RPMI 1640培养液中,置于恒温37℃,含5%CO2,95%空气的CO2培养箱中培养,48小时更换一次培养液,并测定其胰岛素水平,共培养144小时。
, 百拇医药
用Hanks液配制16.5 mmol/L葡萄糖溶液,于培养的第6天末进行胰岛素刺激释放试验,做静态孵育下研究,孵育时间90分钟,分别于30分钟、60分钟和90分钟时采样测定胰岛素含量。
五、统计学处理
各组数值均以
表示,组间比较采用t检验。
结果
一、三组胰岛细胞的培养结果(见表1)
表1 三组胰岛细胞体外培养比较
组 别
, 百拇医药 培养液胰岛素浓度μU/ml
48小时
96小时
144小时
未微囊化组
187.7±63.7
101.0±48.7
45.3±18.0
海藻酸钠组
208.1±63.7
111.8±31.0
87.8±15.0
, 百拇医药
琼脂糖组
180.8±65.1
161.5±46.2
89.4±16.1
与未微囊化组比较P<0.05
二、三组胰岛细胞胰岛素刺激释放试验结果(见表2)
表2 三组胰岛素刺激释放试验结果
组 别
Hanks液胰岛素浓度μU/ml
30分钟
60分钟
, 百拇医药
90分钟
未微囊化组
17.8±4.1
19.6±3.9
22.4±4.0
海藻酸钠组
18.9±6.4
27.1±10.0
37.2±18.2
琼脂糖组
22.7±8.8
28.0±10.0
, 百拇医药
32.2±12.7
讨论 大多数微囊化胰岛移植的研究方法是来自Lim[1]和Sun[2]首先发表的方法,使用海藻酸盐,它能与多聚赖氨酸以离子形式交叉连接成免疫保护膜,应用此膜进行同种及异种胰岛移植,可在不同程度上控制糖尿病动物模型的血糖浓度,延长移植物存活时间。然而有报道这种微囊化胰岛移植后囊周纤维化,并导致囊内胰岛营养障碍,细胞坏死[3]。1989年,Iwata等[4]首次应用琼脂糖微囊化异种胰岛作为人工生物胰,认为其简单、无毒可作为包被胰岛的理想基本材料,且比海藻酸盐和多聚赖氨酸形成的复合物更稳定。但以这两种方法进行的研究结果均很不一致,究竟何种物质作为微囊化胰岛移植最理想的材料尚难确定。
本文采用同一来源在成猪胰岛分别制备成海藻酸钠-多聚赖氨酸微囊和琼脂糖微囊,进行体外培养和胰岛素刺激释放试验,以排除因移植物种类不同、来源不同、制备方法不同、实验室条件不同造成的差异,比较两者间的优劣。结果显示三组胰岛细胞培养液中胰岛素水平在培养第2天、第4天时没有显著差异,第6天时,未微囊化组较海藻酸钠组和琼脂糖组胰岛素水平明显下降,说明包膜胰岛细胞培养过程中,其分泌胰岛素量比未包膜者稳定,而后者在培养过程中胰岛素分泌逐渐下降,可能与组织块融合有关,因组织块太大,营养液不易进入,易产生中心坏死而影响胰岛素分泌量。而两组微囊化细胞间则无明显差异。此外,胰岛素刺激释放试验结果显示两组微囊化胰岛细胞的胰岛释放量较未微囊化胰岛细胞大,但无显著差异。结果提示两种包膜材料制备的微囊化成猪胰岛在体外培养中具有相似的活性,能分泌胰岛素且分泌量较稳定,为进一步进行活体内移植研究,明确两种方法的优劣奠定了基础。■
, 百拇医药
基金项目：本课题为江苏省教委自然科学基金资助项目(95055)
参考文献：
[1]Lim F,Sun AM.Microencapsulated islets as bioartificial endocrine pancreas.Science,1980,21：908-910.
[2]Sun AM,Oshea GM.Injectable microencapsulated islet cells as a bioartificial pancreas.Appl Biochem Biotech,1984,10：87-89.
[3]Soon-Shiong P,Feldman E,Nelson R,et al.Successful reversal of spontaneous diabetes in dogs by intraperitoneal microencapsulated islets.Transplantation,1992,54：769-711.
[4]Iwata H,Amcmiya H,Matsuda T,et al.Evaluation of microcncapsulatcd islets in agarose gel as bioartificial pancreas by studies of hormone secretion in culture and by xenotransplantation.Diabetes,1989,38(Suppl 1)：224-225.
收稿日期：1999-03-03
修稿日期：1999-07-15, http://www.100md.com
单位：缪珩(南京医科大学第二附属医院 210011)； 徐家蓉(南京医科大学第二附属医院 210011)； 游娜(南京医科大学第二附属医院 210011)； 汪晓农(南京医科大学第二附属医院 210011)
关键词：胰岛；微囊化；细胞培养
两种微囊化成猪胰岛的体外培养比较 摘要：目的 通过体外培养比较两种不同微囊化成猪胰岛的功能。方法 将分离的成猪胰岛分成三组：对照组、琼脂糖微囊组和海藻酸钠微囊组,并置于CO2培养箱中培养6天。结果 三组胰岛细胞培养液中胰岛素水平在培养第2天和第4天时没有显著差异,第6天时对照组与两组微囊化组比较有显著差异,而后两组间无明显差异。胰岛素刺激释放试验结果三组间无显著差异。结论 两种不同包膜的微囊化成猪胰岛具有相似的活性,能稳定分泌胰岛素,两组间无显著差异。
, 百拇医药
Comparison of two types of microencapsulated adult pig pancreatic islets in vitro
MIAO Heng,XU Jiarong,YOU Na,et al
(The Second Affiliated Hospital of Nanjing Medical University,Nanjing 210011)
Abstract：Objective To compare the functions of two types of microencapsulated adult pig pancreatic islets in vitro.Methods Isolated adult pig islets were divided into three groups：control group,encapsulated plus agarose group and encapsulated plus alginate group,and then cultured six days at 37℃ and 5% CO2.Meantime the insulin levels of the culture media were determined.Results (1)At the second and fourth days of culture,there was no significant difference in the levels of insulin of the three groups.At the sixth day,significant difference was observed between the control and two encapsulate groups (P<0.05),but no difference between the two encapsulated groups；(2) There was not any significant difference in the results of insulin stimulating releasing test among the three groups.Conclusion The two types of microencapsulated adult pig islets with different immuno-isolation membrane had similar bioactivity.Both could secrete insulin steadily.And there was no significant difference among the groups.
, 百拇医药
Key words：Islet Microencapsulate Cell culture▲
免疫排斥是胰岛组织移植中的最大障碍,近年来发展的免疫隔离膜技术可能是解决同种异体和异种胰岛移植免疫排斥的有效方法之一。目前有数种不同的免疫隔离膜,其中较常用的有海藻酸钠-聚赖氨酸膜和琼脂糖膜,均在动物实验中取得一定疗效,但这两种方法哪一种效果更佳尚无一致的结论。本文对同一来源移植物分别采用海藻酸钠-聚赖氨酸和琼脂糖制备的微囊化胰岛进行体外培养,并加以比较。
材料和方法
一、移植物的制备
从成猪体内取出胰腺(热缺血时间<20分钟),立即置于冷Hanks液中,去除脂肪及结缔组织,用蚊式剪将胰腺剪成1 mm3左右小块,冲洗数次后,离心去上清液,加至V型胶原酶溶液(1g/L)中,在40℃恒温水浴振荡器中消化8分钟,连续两次,振荡频率140次/分,用含10%小牛血清的冷Hanks液终止消化,进一步剔去结缔组织后,分成三份,离心去上清液,一份直接转入盛有培养基RPMI 1640的培养瓶中培养,另二份分别制备成海藻酸钠-聚赖氨酸微囊和琼脂糖微囊后转入盛有RPMI 1640的培养瓶中培养。
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二、海藻酸钠-聚赖氨酸微囊的制备
主要材料有多聚赖氨酸、CHES(Sigma产品),海藻酸钠(上海生物试剂厂产品),参照文献[1]将成猪胰岛经海藻酸钙和多聚赖氨酸包裹成囊后培养。
三、琼脂糖微囊的制备
主要材料为琼脂糖(上海生物试剂厂出品),参照文献[4]将成猪胰岛经琼脂糖包裹成囊后培养。
四、细胞培养及胰岛素刺激释放试验
将三种胰岛分别加入含20%胎牛血清,链霉素100 μg/ml,青霉素100 μg/ml的RPMI 1640培养液中,置于恒温37℃,含5%CO2,95%空气的CO2培养箱中培养,48小时更换一次培养液,并测定其胰岛素水平,共培养144小时。
, 百拇医药
用Hanks液配制16.5 mmol/L葡萄糖溶液,于培养的第6天末进行胰岛素刺激释放试验,做静态孵育下研究,孵育时间90分钟,分别于30分钟、60分钟和90分钟时采样测定胰岛素含量。
五、统计学处理
各组数值均以
表示,组间比较采用t检验。结果
一、三组胰岛细胞的培养结果(见表1)
表1 三组胰岛细胞体外培养比较
组 别
, 百拇医药 培养液胰岛素浓度μU/ml
48小时
96小时
144小时
未微囊化组
187.7±63.7
101.0±48.7
45.3±18.0
海藻酸钠组
208.1±63.7
111.8±31.0
87.8±15.0
, 百拇医药
琼脂糖组
180.8±65.1
161.5±46.2
89.4±16.1
与未微囊化组比较P<0.05
二、三组胰岛细胞胰岛素刺激释放试验结果(见表2)
表2 三组胰岛素刺激释放试验结果
组 别
Hanks液胰岛素浓度μU/ml
30分钟
60分钟
, 百拇医药
90分钟
未微囊化组
17.8±4.1
19.6±3.9
22.4±4.0
海藻酸钠组
18.9±6.4
27.1±10.0
37.2±18.2
琼脂糖组
22.7±8.8
28.0±10.0
, 百拇医药
32.2±12.7
讨论 大多数微囊化胰岛移植的研究方法是来自Lim[1]和Sun[2]首先发表的方法,使用海藻酸盐,它能与多聚赖氨酸以离子形式交叉连接成免疫保护膜,应用此膜进行同种及异种胰岛移植,可在不同程度上控制糖尿病动物模型的血糖浓度,延长移植物存活时间。然而有报道这种微囊化胰岛移植后囊周纤维化,并导致囊内胰岛营养障碍,细胞坏死[3]。1989年,Iwata等[4]首次应用琼脂糖微囊化异种胰岛作为人工生物胰,认为其简单、无毒可作为包被胰岛的理想基本材料,且比海藻酸盐和多聚赖氨酸形成的复合物更稳定。但以这两种方法进行的研究结果均很不一致,究竟何种物质作为微囊化胰岛移植最理想的材料尚难确定。
本文采用同一来源在成猪胰岛分别制备成海藻酸钠-多聚赖氨酸微囊和琼脂糖微囊,进行体外培养和胰岛素刺激释放试验,以排除因移植物种类不同、来源不同、制备方法不同、实验室条件不同造成的差异,比较两者间的优劣。结果显示三组胰岛细胞培养液中胰岛素水平在培养第2天、第4天时没有显著差异,第6天时,未微囊化组较海藻酸钠组和琼脂糖组胰岛素水平明显下降,说明包膜胰岛细胞培养过程中,其分泌胰岛素量比未包膜者稳定,而后者在培养过程中胰岛素分泌逐渐下降,可能与组织块融合有关,因组织块太大,营养液不易进入,易产生中心坏死而影响胰岛素分泌量。而两组微囊化细胞间则无明显差异。此外,胰岛素刺激释放试验结果显示两组微囊化胰岛细胞的胰岛释放量较未微囊化胰岛细胞大,但无显著差异。结果提示两种包膜材料制备的微囊化成猪胰岛在体外培养中具有相似的活性,能分泌胰岛素且分泌量较稳定,为进一步进行活体内移植研究,明确两种方法的优劣奠定了基础。■
, 百拇医药
基金项目：本课题为江苏省教委自然科学基金资助项目(95055)
参考文献：
[1]Lim F,Sun AM.Microencapsulated islets as bioartificial endocrine pancreas.Science,1980,21：908-910.
[2]Sun AM,Oshea GM.Injectable microencapsulated islet cells as a bioartificial pancreas.Appl Biochem Biotech,1984,10：87-89.
[3]Soon-Shiong P,Feldman E,Nelson R,et al.Successful reversal of spontaneous diabetes in dogs by intraperitoneal microencapsulated islets.Transplantation,1992,54：769-711.
[4]Iwata H,Amcmiya H,Matsuda T,et al.Evaluation of microcncapsulatcd islets in agarose gel as bioartificial pancreas by studies of hormone secretion in culture and by xenotransplantation.Diabetes,1989,38(Suppl 1)：224-225.
收稿日期：1999-03-03
修稿日期：1999-07-15, http://www.100md.com