STR和性别位点PCR产物的荧光自动检测
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法医学杂志 2000年第3期第16卷 论著
作者：江斌 梁赏猷 郭景元
单位：江斌(衡阳医学院法医物证鉴定中心，湖南 421001)；梁赏猷(广州市刑事科学技术研究所，广东 510030)；郭景元(中山医科大学法医系，广东广州 510089)
关键词：荧光DNA自动测序仪；STR分型；性别预选；人工假象
法医学杂志000307
[摘要]运用荧光染料标记引物、变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(denaturing polyacrylamide gel electrophoresis,denaturing PAGE)结合荧光法检测6个STR位点(vWA31A、TH01、F13A1、FES、TPOX、CSF1PO)及1个性别鉴定位点(Amelogenin)，就荧光自动检测的重复性、准确性、分辩力等方面进行了研究，建立了6个STR位点等位基因判定视窗及用荧光DNA测序仪进行STR分析的方法，实现电脑自动判读结果。结果表明，本文所述STR和性别鉴定的自动检测方法可靠、分辨力高(可达1bp)，所得数据有助于荧光自动DNA分型软件系统的数据积累。
, 百拇医药
[中图分类号]DF795.2 [文献标识码]A
[文章编号]1004-5619(2000)03-0143-03
Automated fluorescent analysis of STR profiling and sex determination
Jiang Bin, et al.
(Legal Medical Expertise Center of Hengyang Medical College, Hengyang 421001, PRC)
Denaturing PAGE coupled with the ABI377 fluorescent automated DNA sequencer was used to test the performance and reproducibility of the automated DNA profiling systems at vWA31A, TH01, F13A01, FES, TPOX, CSF1PO and Amelogenin gene.The allele designation windows at the 7 genetic markers were established and implemented into the genotype reading software.Alleles differing in just 1bp in length could easily be discriminated.Furthermore, the interpretation guidelines were outlined for the 7 genetic systems by investigating the relative peak areas of heterozygote peaks and relative stutter peak areas in various monoplex systems.Our results indicate that if the ratio between two peaks is equal to or higher than 0.404, a herozygote could be determined, otherwise the homozygote be made.
, 百拇医药
Key words: Automated fluorescent DNA sequencer;STR profiling;sex preselection; stutter bands
荧光技术与Gene ScannerABI系列软件检测等位基因最先是1992年由Sullivan等人[1]开发的。经数代改进后现该仪器可一机多用，即可进行DNA碱基序列测定，又可进行DNA片段长度的定质定量，故PCR-STR自动分型技术是未来法医物证检验的一个重要趋势之一。本文在建立了等位基因判定视窗的基础上，利用荧光检测的峰面积(Peak area,PA)作为定量指标，进一步在量方面探讨了定义等位基因的标准，这对实现DNA分型的自动化是十分重要的。
1 材料与方法
1.1 实验仪器
ABI Prism 377 DNA自动测序仪(Perkin-Elmer Corp.,Norwalk,CT,USA)及所附GeneScan数据分析软件、GenetyperTM基因分型软件。
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1.2 样本来源
无关个体血样132份、陈旧骨骼及血斑99份、家系血样26份来源于广州市血站、中山医科大学、广州市刑科所。
1.3 实验方法
1.3.1 PCR扩增
参见文献[2]。
1.3.2 电泳及荧光自动检测方法
4%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(尿素6mol/L，4%丙烯酰胺，混合床交换树脂0.001g/ml，1×TBE，TEMED35μl/50ml，10%APS250μl/50ml)，电泳缓冲液：1×TBE，预电泳：980V恒压电泳30～60min，至凝胶温度升至51℃；取PCR扩增产物0.2～2μl与3.0μlEDTA-Blue、Formamide及泳道内部分子量对照(internal-lane Size Standard)GS-350-ROX(8nmol/L，p/n401735)三者组成的加样缓冲液混匀，93℃变性3～5分钟，置冰上5～10min，每孔加样1.0μl～1.6μl；36cm WTR(Well-to-read)电泳板，电泳制式：GS36A-1200-18Run module，温度51℃，功率150W，电流50.0mA，激光强度40.0mA，电压1680V，恒压电泳2～4min。用GeneScan672对电泳结果进行分析。GeneScan的分析参数为:Peak Detection Threshold—50；Peak Detection Minimum Half-width—3；Sizing Method—Local Southern；Std.Peak Detection Threshold—50；Filter Set—A。
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1.3.3 等位基因的命名
按照国际法医血液遗传学会DNA委员会(ISFH DNA Commission)的方法对各位点等位基因进行命名[3],即以核心序列重复的次数来命名各位点的等位基因。
2 结果
2.1 荧光自动检测片段长度准确性及重复性的研究
将同一个体的各位点扩增产物在同一块凝胶的17个泳道中电泳，其等位基因及实际长度(allele and length in bp)、最大测量长度(maximum length estimated bp)、最小测量长度(minimum length estimated)、标准差(Standard Deviation，SD)及百分精确度(Precision of Sizing)等数据见表1，测定的长度相差最大者有0.14bp，最小者0.02bp，说明泳道间存在一定误差，不容忽视。所得的SD值最大者0.046，较国外报道略小[4]。
, 百拇医药
表1 等位基因长度测量值的差异
Loci
allele and
length in bp
maximum length
estimated (bp)
Minimum length
estimated (bp)
SD
Precision of
Sizing(%)*
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vWA31A
16(147)
148.37
148.24
0.030
99.80
18(156)
156.42
156.31
0.030
99.98
TH01
, http://www.100md.com 9(170)
170.71
170.63
0.046
99.97
F13A1
6(191)
191.98
191.84
0.038
99.98
FES
9(214)
, http://www.100md.com
215.62
215.48
0.040
99.98
12(226)
228.71
227.69
0.035
99.98
TH01/11
9(195)
195.67
, 百拇医药 195.46
0.038
99.98
TPOX
9(236)
237.84
237.73
0.041
99.98
10(240)
241.98
241.86
0.038
, http://www.100md.com
99.98
CSF1PO
11(311)
312.53
312.42
0.038
99.99
*等位基因检测长度的精确度按以下公式计算[1,5]，其中SD为某等位基因检测长度的标准差,exp为该等位基因的理论长度。Precision%=1-SD/exp×100
6个STR位点的扩增产物在同一胶及不同胶上所检测的最大长度范围(Maximum size range observed)、标准差及百分精确度见表2。
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表2 等位基因长度范围跨度的最大值、精确度及最大SD
Loci
Maximum size range
observed(bp)
Precision of
Sizing(%)*
Maximum SD
VWA31A
1.64
99.42
0.95
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TH01
1.19
99.92
0.13
F13A1
1.33
99.88
0.22
FES/FPS
2.76
99.66
0.74
TPOX
, 百拇医药
1.05
99.92
0.19
CSF1PO
1.24
99.89
0.32
Amel.106bp
0.29
99.94
0.32
Amel.112bp
0.19
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99.96
0.04
*参照表1所注公式计算
2.2 等位基因的判定及判定视窗
通过40块凝胶309份标本(包括无关个体、现场检材、家系血样)的检测，编制各位点等位基因自动判别电脑程序，用于自动译读DNA分型结果。
2.3 等位基因的定量判定
对309份标本中的杂合子两等位基因峰面积比值以及“结巴泳带”与真正等位基因峰面积比值的调查结果显示：两等位基因峰面积之比最小时也有0.404，最大者可达1.00。而结巴泳带PA与真正的等位基因PA之比最大未见有超过0.307，以这个标准作为衡量真正等位基因和非特异性扩增产物的标准是基本可行的。若有第三或第四个波峰面积与最大的波峰面积之比大于0.404，可考虑样本中混有第二者或第二者以上个体的DNA成份；但若小于该值，也不能排除混有其它个体DNA成份的可能性，因为不同比例的混合样本、同一比例但DNA绝对含量不同时，其等位基因峰面积的比值亦不同，所以要摸清不同情况的混合样本的峰面积比值及其它特征，才能进一步制定更为详细的判断准则。
, 百拇医药
3 讨论
用GS-ROX-350ISS作为分子量参照物时，各位点的最大标准差为0.95，说明重复性很好，所测片段长度的精确百分度在99.42%～99.96%之间，分辩力可达1bp，与其它报道相吻合[6,7]。6个STR位点的重复单位为4bp，测量误差为“±2bp”时才能容括所有的等位基因而不至于与大小相邻的等位基因有重叠，本文等位基因判定窗口的最大测量误差值为1.9bp(0.95×2)，低于测量误差值；对于一些相差1～2bp的等位基因(如本文的TH01位点的9.3与10、F13A1位点的3.2与4)，窗口设置的测量值应为“均值±0.5bp”(相差1bp)、“均值±1bp”(相差2bp)，而在这两处的等位基因SD分别为0.13bp和0.22bp(见表3)，均小于上述值，各等位基因间无重叠，进一步说明本文所建立的等位基因判定窗口可靠，分辩力已达1bp，完全能分辩所有等位基因，而不会出现错判。
表3 等位基因长度定义窗口
, 百拇医药
Loci
Size window for designation(bp)
Allele
Range
Minimum
Maximum
vWA31A
13
0.27
135.26
135.53
14
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0.29
139.28
139.57
15
0.21
143.85
144.06
16
0.36
148.15
148.51
17
0.37
, 百拇医药
152.21
152.58
18
0.48
156.11
156.59
19
0.36
160.00
160.36
20
1.64
162.68
, 百拇医药
164.32
TH01
5
0.54
156.00
156.54
6
0.32
158.74
159.06
7
1.19
161.65
, 百拇医药
162.84
8
0.16
166.61
166.77
9
0.26
170.50
170.76
9.3
0.15
173.57
173.72
, 百拇医药
10
0.23
174.54
174.77
F13A01
3.2
0.44
181.51
181.95
4
0.37
183.54
183.91
, 百拇医药
5
1.06
187.68
188.74
6
1.33
191.65
192.98
7
1.01
195.00
196.01
8
, 百拇医药
0.21
199.91
200.12
FES
9
0.14
215.48
215.62
10
2.76
217.08
219.84
11
, 百拇医药
0.54
223.47
224.01
12
2.63
225.39
228.02
13
0.45
231.60
232.05
14
0.02
, 百拇医药
236.02
236.04
TPOX
7
0.48
227.32
227.80
8
0.51
233.56
234.07
9
1.05
, 百拇医药
237.65
238.70
10
0.32
241.72
242.04
11
0.31
245.78
246.09
12
0.11
250.00
, 百拇医药
250.11
CSF1PO
7
0.58
295.61
296.19
8
0.00
300.11
300.11
9
1.24
303.31
, 百拇医药
304.55
10
0.46
308.21
308.67
11
1.18
311.49
312.67
12
0.50
316.30
316.80
, 百拇医药
13
0.31
320.48
320.79
14
0.17
324.62
324.79
实验结果也从另一角度说明：对于相邻等位基因之间相差4bp的简单型STR位点，运用GS系列ISS进行等位基因长度测定虽然与实际长度有一定偏差，但这种偏差是相对稳定的，观察6个STR位点共48个等位基因，发现“测定长度”与真正长度之差在某一位点内部是恒定的，经一定的运算之后可间接地得出该等位基因的真正长度。如FES、TPOX和CSF1PO位点的等位基因，将其测量值减去1后的整数即为该等位基因的真正长度，所以认为在简单型STR位点中可使用ISS进行检测。造成这种比实际长度多1bp的现象，可用TaqDNA聚合酶的不完全催化作用来解释，在链延长过程中有时会在延伸链的3′末端加上一个额外的腺苷酸(A)残基[8]。推测额外A残基的出现与所选STR位点有关，而似乎与引物无关，这个推测成立与否尚需进一步证实。
, 百拇医药
实际情况中会遇到“结巴泳带”等人工假象，故还要就量方面对等位基因进行规定，本文系统地调查了杂合子两等位基因峰面积的比值及“结巴泳带”与真正等位基因峰面积的比值，初步得出了0.404这个定量判断等位基因有无的界值，较其它文献报道的要小[9]。但是，该值不适用于混合检材，由于混合样品中各组份所占比例不同或比例相同而绝对含量不同时，均会引起峰面积比例的失常。当两峰面积比值大于该值，可判断为杂合子；两峰面积比值小于该值，可认为是纯合子；当有三个或三个以上波峰出现时，认为是异常的，应重新实验验证。
几乎所有的电泳和PCR系统(包括单位点PCR扩增)都不可避免会出现人工假象，这是阻碍基因型译读以及复合扩增在法医学中应用的主要困难，国外已有一些这方面的报道[10]，正确区分人工假象将对混合样本的识别及其DNA分型结果的解读具有实际意义。
参考文献：
, 百拇医药 [1] Sullivan KM, Pope S, Gill P, et al. Automated DNA profiling by fluorescent labeling of PCR products[J]. PCR Methods Appl， 1992， 2:34- 40.
[2]江斌，郭景元，梁赏猷.运用PAGE和荧光检测技术对广州汉族人群六个STR位点的研究[J].法医学杂志,1999,15(3)：141-143.
[3] DNA Commission of the International Society for Forensic Haemogenetics.DNA recommendations- 1992 report concerning recommendations of the DNA Commission of the InternationalSociety for Forensic Haemogenetics relating to the use of PCR- based polymorphisms[J]. Int J Leg Med, 1992,105:63- 64.
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[4] Holgersson S, Karlsson JAA, Kihlgren A, et al. Fluorescent- based typing of the two short tandem repeat loci HumTH01 and HumACTBP2:reproducibility of size measurements and genetic variation in the Swedish population[J]. Electrophoresis,1994,5:890- 895.
[5] Andersen JF,Greenhalgh MJ, Butler HR, et al. Further validation of a multiples STR system for use in routine forensic identity testing[J].Forensic Science International,1996,78(1):47- 64.
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[6] Dupuy BM,Olaisen B.A dedicated internal standard in fragment length andlysis of hyperpolymorphic short tandem repeats[J].Forensic Sci Int,1997,86(3):207- 227.
[7] Kimpton CR,Gill P,Watson A,et al.Automated DNA profiling employing multiplex amplification of STR loci[J].PCR Methods Appl,1993,3:13- 22.
[8] Clark JM.Novel,non- template nucleotide addition reacton catalysed by procaryotic and eucaryotic DNA polymerases[J].Nuc leic Acids Res,1988,16:9677- 9686.
, 百拇医药
[9] Gill P,Sparkes R,Kimpton C.Development of guidelines to designate alleles using an STR multiplex system[J].Forensic Sci Int,1997,89:185- 197.
[10] Gill P,Urquhart AJ,Millican M,et al.A new method of STR interpretation using inferential logic- development of a criminal intelligence database[J].Int J Legal Med,1996,109:14- 22.
(收稿日期：1999-04-23修回日期：2000-04-30), 百拇医药
单位：江斌(衡阳医学院法医物证鉴定中心，湖南 421001)；梁赏猷(广州市刑事科学技术研究所，广东 510030)；郭景元(中山医科大学法医系，广东广州 510089)
关键词：荧光DNA自动测序仪；STR分型；性别预选；人工假象
法医学杂志000307
[摘要]运用荧光染料标记引物、变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(denaturing polyacrylamide gel electrophoresis,denaturing PAGE)结合荧光法检测6个STR位点(vWA31A、TH01、F13A1、FES、TPOX、CSF1PO)及1个性别鉴定位点(Amelogenin)，就荧光自动检测的重复性、准确性、分辩力等方面进行了研究，建立了6个STR位点等位基因判定视窗及用荧光DNA测序仪进行STR分析的方法，实现电脑自动判读结果。结果表明，本文所述STR和性别鉴定的自动检测方法可靠、分辨力高(可达1bp)，所得数据有助于荧光自动DNA分型软件系统的数据积累。
, 百拇医药
[中图分类号]DF795.2 [文献标识码]A
[文章编号]1004-5619(2000)03-0143-03
Automated fluorescent analysis of STR profiling and sex determination
Jiang Bin, et al.
(Legal Medical Expertise Center of Hengyang Medical College, Hengyang 421001, PRC)
Denaturing PAGE coupled with the ABI377 fluorescent automated DNA sequencer was used to test the performance and reproducibility of the automated DNA profiling systems at vWA31A, TH01, F13A01, FES, TPOX, CSF1PO and Amelogenin gene.The allele designation windows at the 7 genetic markers were established and implemented into the genotype reading software.Alleles differing in just 1bp in length could easily be discriminated.Furthermore, the interpretation guidelines were outlined for the 7 genetic systems by investigating the relative peak areas of heterozygote peaks and relative stutter peak areas in various monoplex systems.Our results indicate that if the ratio between two peaks is equal to or higher than 0.404, a herozygote could be determined, otherwise the homozygote be made.
, 百拇医药
Key words: Automated fluorescent DNA sequencer;STR profiling;sex preselection; stutter bands
荧光技术与Gene ScannerABI系列软件检测等位基因最先是1992年由Sullivan等人[1]开发的。经数代改进后现该仪器可一机多用，即可进行DNA碱基序列测定，又可进行DNA片段长度的定质定量，故PCR-STR自动分型技术是未来法医物证检验的一个重要趋势之一。本文在建立了等位基因判定视窗的基础上，利用荧光检测的峰面积(Peak area,PA)作为定量指标，进一步在量方面探讨了定义等位基因的标准，这对实现DNA分型的自动化是十分重要的。
1 材料与方法
1.1 实验仪器
ABI Prism 377 DNA自动测序仪(Perkin-Elmer Corp.,Norwalk,CT,USA)及所附GeneScan数据分析软件、GenetyperTM基因分型软件。
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1.2 样本来源
无关个体血样132份、陈旧骨骼及血斑99份、家系血样26份来源于广州市血站、中山医科大学、广州市刑科所。
1.3 实验方法
1.3.1 PCR扩增
参见文献[2]。
1.3.2 电泳及荧光自动检测方法
4%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(尿素6mol/L，4%丙烯酰胺，混合床交换树脂0.001g/ml，1×TBE，TEMED35μl/50ml，10%APS250μl/50ml)，电泳缓冲液：1×TBE，预电泳：980V恒压电泳30～60min，至凝胶温度升至51℃；取PCR扩增产物0.2～2μl与3.0μlEDTA-Blue、Formamide及泳道内部分子量对照(internal-lane Size Standard)GS-350-ROX(8nmol/L，p/n401735)三者组成的加样缓冲液混匀，93℃变性3～5分钟，置冰上5～10min，每孔加样1.0μl～1.6μl；36cm WTR(Well-to-read)电泳板，电泳制式：GS36A-1200-18Run module，温度51℃，功率150W，电流50.0mA，激光强度40.0mA，电压1680V，恒压电泳2～4min。用GeneScan672对电泳结果进行分析。GeneScan的分析参数为:Peak Detection Threshold—50；Peak Detection Minimum Half-width—3；Sizing Method—Local Southern；Std.Peak Detection Threshold—50；Filter Set—A。
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1.3.3 等位基因的命名
按照国际法医血液遗传学会DNA委员会(ISFH DNA Commission)的方法对各位点等位基因进行命名[3],即以核心序列重复的次数来命名各位点的等位基因。
2 结果
2.1 荧光自动检测片段长度准确性及重复性的研究
将同一个体的各位点扩增产物在同一块凝胶的17个泳道中电泳，其等位基因及实际长度(allele and length in bp)、最大测量长度(maximum length estimated bp)、最小测量长度(minimum length estimated)、标准差(Standard Deviation，SD)及百分精确度(Precision of Sizing)等数据见表1，测定的长度相差最大者有0.14bp，最小者0.02bp，说明泳道间存在一定误差，不容忽视。所得的SD值最大者0.046，较国外报道略小[4]。
, 百拇医药
表1 等位基因长度测量值的差异
Loci
allele and
length in bp
maximum length
estimated (bp)
Minimum length
estimated (bp)
SD
Precision of
Sizing(%)*
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vWA31A
16(147)
148.37
148.24
0.030
99.80
18(156)
156.42
156.31
0.030
99.98
TH01
, http://www.100md.com 9(170)
170.71
170.63
0.046
99.97
F13A1
6(191)
191.98
191.84
0.038
99.98
FES
9(214)
, http://www.100md.com
215.62
215.48
0.040
99.98
12(226)
228.71
227.69
0.035
99.98
TH01/11
9(195)
195.67
, 百拇医药 195.46
0.038
99.98
TPOX
9(236)
237.84
237.73
0.041
99.98
10(240)
241.98
241.86
0.038
, http://www.100md.com
99.98
CSF1PO
11(311)
312.53
312.42
0.038
99.99
*等位基因检测长度的精确度按以下公式计算[1,5]，其中SD为某等位基因检测长度的标准差,exp为该等位基因的理论长度。Precision%=1-SD/exp×100
6个STR位点的扩增产物在同一胶及不同胶上所检测的最大长度范围(Maximum size range observed)、标准差及百分精确度见表2。
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表2 等位基因长度范围跨度的最大值、精确度及最大SD
Loci
Maximum size range
observed(bp)
Precision of
Sizing(%)*
Maximum SD
VWA31A
1.64
99.42
0.95
, http://www.100md.com
TH01
1.19
99.92
0.13
F13A1
1.33
99.88
0.22
FES/FPS
2.76
99.66
0.74
TPOX
, 百拇医药
1.05
99.92
0.19
CSF1PO
1.24
99.89
0.32
Amel.106bp
0.29
99.94
0.32
Amel.112bp
0.19
, http://www.100md.com
99.96
0.04
*参照表1所注公式计算
2.2 等位基因的判定及判定视窗
通过40块凝胶309份标本(包括无关个体、现场检材、家系血样)的检测，编制各位点等位基因自动判别电脑程序，用于自动译读DNA分型结果。
2.3 等位基因的定量判定
对309份标本中的杂合子两等位基因峰面积比值以及“结巴泳带”与真正等位基因峰面积比值的调查结果显示：两等位基因峰面积之比最小时也有0.404，最大者可达1.00。而结巴泳带PA与真正的等位基因PA之比最大未见有超过0.307，以这个标准作为衡量真正等位基因和非特异性扩增产物的标准是基本可行的。若有第三或第四个波峰面积与最大的波峰面积之比大于0.404，可考虑样本中混有第二者或第二者以上个体的DNA成份；但若小于该值，也不能排除混有其它个体DNA成份的可能性，因为不同比例的混合样本、同一比例但DNA绝对含量不同时，其等位基因峰面积的比值亦不同，所以要摸清不同情况的混合样本的峰面积比值及其它特征，才能进一步制定更为详细的判断准则。
, 百拇医药
3 讨论
用GS-ROX-350ISS作为分子量参照物时，各位点的最大标准差为0.95，说明重复性很好，所测片段长度的精确百分度在99.42%～99.96%之间，分辩力可达1bp，与其它报道相吻合[6,7]。6个STR位点的重复单位为4bp，测量误差为“±2bp”时才能容括所有的等位基因而不至于与大小相邻的等位基因有重叠，本文等位基因判定窗口的最大测量误差值为1.9bp(0.95×2)，低于测量误差值；对于一些相差1～2bp的等位基因(如本文的TH01位点的9.3与10、F13A1位点的3.2与4)，窗口设置的测量值应为“均值±0.5bp”(相差1bp)、“均值±1bp”(相差2bp)，而在这两处的等位基因SD分别为0.13bp和0.22bp(见表3)，均小于上述值，各等位基因间无重叠，进一步说明本文所建立的等位基因判定窗口可靠，分辩力已达1bp，完全能分辩所有等位基因，而不会出现错判。
表3 等位基因长度定义窗口
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Loci
Size window for designation(bp)
Allele
Range
Minimum
Maximum
vWA31A
13
0.27
135.26
135.53
14
, http://www.100md.com
0.29
139.28
139.57
15
0.21
143.85
144.06
16
0.36
148.15
148.51
17
0.37
, 百拇医药
152.21
152.58
18
0.48
156.11
156.59
19
0.36
160.00
160.36
20
1.64
162.68
, 百拇医药
164.32
TH01
5
0.54
156.00
156.54
6
0.32
158.74
159.06
7
1.19
161.65
, 百拇医药
162.84
8
0.16
166.61
166.77
9
0.26
170.50
170.76
9.3
0.15
173.57
173.72
, 百拇医药
10
0.23
174.54
174.77
F13A01
3.2
0.44
181.51
181.95
4
0.37
183.54
183.91
, 百拇医药
5
1.06
187.68
188.74
6
1.33
191.65
192.98
7
1.01
195.00
196.01
8
, 百拇医药
0.21
199.91
200.12
FES
9
0.14
215.48
215.62
10
2.76
217.08
219.84
11
, 百拇医药
0.54
223.47
224.01
12
2.63
225.39
228.02
13
0.45
231.60
232.05
14
0.02
, 百拇医药
236.02
236.04
TPOX
7
0.48
227.32
227.80
8
0.51
233.56
234.07
9
1.05
, 百拇医药
237.65
238.70
10
0.32
241.72
242.04
11
0.31
245.78
246.09
12
0.11
250.00
, 百拇医药
250.11
CSF1PO
7
0.58
295.61
296.19
8
0.00
300.11
300.11
9
1.24
303.31
, 百拇医药
304.55
10
0.46
308.21
308.67
11
1.18
311.49
312.67
12
0.50
316.30
316.80
, 百拇医药
13
0.31
320.48
320.79
14
0.17
324.62
324.79
实验结果也从另一角度说明：对于相邻等位基因之间相差4bp的简单型STR位点，运用GS系列ISS进行等位基因长度测定虽然与实际长度有一定偏差，但这种偏差是相对稳定的，观察6个STR位点共48个等位基因，发现“测定长度”与真正长度之差在某一位点内部是恒定的，经一定的运算之后可间接地得出该等位基因的真正长度。如FES、TPOX和CSF1PO位点的等位基因，将其测量值减去1后的整数即为该等位基因的真正长度，所以认为在简单型STR位点中可使用ISS进行检测。造成这种比实际长度多1bp的现象，可用TaqDNA聚合酶的不完全催化作用来解释，在链延长过程中有时会在延伸链的3′末端加上一个额外的腺苷酸(A)残基[8]。推测额外A残基的出现与所选STR位点有关，而似乎与引物无关，这个推测成立与否尚需进一步证实。
, 百拇医药
实际情况中会遇到“结巴泳带”等人工假象，故还要就量方面对等位基因进行规定，本文系统地调查了杂合子两等位基因峰面积的比值及“结巴泳带”与真正等位基因峰面积的比值，初步得出了0.404这个定量判断等位基因有无的界值，较其它文献报道的要小[9]。但是，该值不适用于混合检材，由于混合样品中各组份所占比例不同或比例相同而绝对含量不同时，均会引起峰面积比例的失常。当两峰面积比值大于该值，可判断为杂合子；两峰面积比值小于该值，可认为是纯合子；当有三个或三个以上波峰出现时，认为是异常的，应重新实验验证。
几乎所有的电泳和PCR系统(包括单位点PCR扩增)都不可避免会出现人工假象，这是阻碍基因型译读以及复合扩增在法医学中应用的主要困难，国外已有一些这方面的报道[10]，正确区分人工假象将对混合样本的识别及其DNA分型结果的解读具有实际意义。
参考文献：
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(收稿日期：1999-04-23修回日期：2000-04-30), 百拇医药