纤粘连蛋白介导的平滑肌细胞粘附迁移与粘着斑激酶的磷酸化
作者：尹航 汪丽蕙 彭旭 霍勇 唐朝枢 周柔丽
单位：尹航 汪丽蕙 彭旭 霍勇 唐朝枢(北京大学第一医院心脏科 100034)；周柔丽(北京大学医学部细胞生物学教研室)
关键词：血管平滑肌细胞；细胞外基质；粘着斑激酶；粘附；迁移
中国介入心脏病学杂志000314 【摘要】 目的 探讨纤粘连蛋白介导的血管平滑肌细胞粘附和迁移与粘着斑激酶(focal adhesion kinase,FAK)的磷酸化的关系。方法 不同浓度的纤粘连蛋白(fibronectin,FN)刺激培养的血管平滑肌细胞(smooth muscle cells,SMCs)，观察细胞粘附反应，统计铺展比率。免疫沉淀和Wstern blot分别检测FAK及FAK磷酸化的表达量。利用改良的Boyden Chamber测SMCs迁移。结果 FN有效地促进了SMC粘附，其铺展比率、迁移细胞数均显著高于对照(P<0.05),且随FN浓度递增而增加。其中20、40、60 μg/ml组分别为(75.6±6.5)%、(80.9±5.4)%和(82.4±7.9)%，无组间差异，但均高于5 μg/ml的(20.8±3.2)%和10 μg/ml组的(32.8±4.7)%,各组迁移细胞数也从16.8±3.6/HFP 200×增加到48.9±6.1/HFP 200×。不同浓度FN作用后均有FAK的表达，FN10 μg/ml即可致FAK磷酸化。表明FN介导SMCs粘附和迁移时伴有显著的FAK活化。结论 FN诱导平滑肌细胞粘附和迁移可能是通过FAK介导的，对其活性进行调控将有助于抑制血管损伤后内膜平滑肌细胞的迁移。
, 百拇医药
Role of focal adhesion kinase phosphorylation in smooth muscle cells adhesion and migration mediated by fibronectin
Yin Hang, Peng Xu, Wang Lihui, et al.
(Department of Cardiology, The First Hospital of Beijing University, Beijing 100034)
【Abstract】 Objective To investigate the role of focal adhesion kinase (FAK) phosphorylation in smooth muscle cells (SMCs) adhesion and migration mediated by fibronectin (FN). Methods Cultured rat aortic SMCs were stimulated by FN. Cell adhesion and spreading were enumerated by light microscope. Content of FAK and tyrosine kinase were investigated by immunoprecipitation and immunoblot. Cell counting for migration were enumerated in modified Boyden Chamber. Results We observed SMCs adhesion and spreading stimulated by FN significantly than the control. Cell migration were also enhanced significantly. In the mean time, expression of FAK were detected and tyrosine phosphorylation of FAK stimulated by at least 10 μg/ml FN were also observed. It showed that tyrosine kinase activity was associated with SMCs adhesion and migration mediated by FN. Conclusion SMCs adhesion and migration induced by FN maybe mediated by FAK. To modulate tyrosine kinase activity of FAK may contribute to inhibit SMCs migration in injured arteries.
, 百拇医药
【Key words】 Vascular smooth muscle cells; Extracellular matrix; Focal adhesion kinase; Adhesion; Migration
FN是构成血管壁细胞外基质(extracellular matrix,ECM)的主要成分之一，在血管损伤后内膜增殖过程中起重要作用。已有的研究发现FN在体内可以刺激SMCs的迁移和增殖，但其确切机制以及所涉及的信号转导尚不清楚。FAK是一种非受体型酪氨酸激酶，在细胞信号转导中占重要地位，与细胞迁移和增殖密切相关[1，2]。本实验拟在体外培养的SMCs上，探讨FN介导细胞粘附和迁移对FAK磷酸化的影响。
材料和方法
1.细胞培养：取SD大鼠主动脉中膜，采用组织块贴片法，以含15%胎牛血清的M199培养液(GIBCO)培养，传至第5代用于实验，用兔抗SMC-myosin抗体(SIGMA)进行SMCs免疫细胞化学鉴定。
, http://www.100md.com
2.细胞粘附铺展：将FN(购于北京医科大学细胞生物学教研室)5、10、20、40、60 μg/ml覆盖于96孔培养板孔底，4℃静置过夜，将SMCs(2×103)接种于培养孔，孵箱内(5%CO2,37℃)静置60 min后观察粘附反应，凡圆形透亮的细胞为非贴壁细胞。镜下计数，统计细胞粘附铺展比率(%)，另设无FN处理的对照。
3.免疫沉淀和Western blot将SMCs(5×105)接种于直接35 mm已覆盖有FN的细胞培养皿，孵箱内(5%CO2,37℃)静置4 h,弃去培养液，用D-Hank′s液清洗细胞3遍，甩干，加入预冷的0.25 ml RIPA细胞裂解缓冲液，冰置20 min后用刮起细胞，连同裂解液移至EP管中，12?000 g离心20 min(4℃),保留上清进行蛋白定量。取10 μg蛋白，加入上样缓冲液，100℃变性3 min后进行SDS-PAGE,转膜，用1∶1?000的抗FAK多抗(Santa Cruz)进行杂交，二抗为1∶2?000辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG(中山公司)，最后用增强的化学发光试剂(Santa Cruz)显色。
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免疫沉淀用于检测磷酸化FAK的表达量。另取100 μg总蛋白，加入10 μg FAK抗体(Santa Cruz),4℃反应1 h,随后加入50 μl A蛋白-Sepharose珠进行沉淀，用裂解缓冲液洗3次，加入上样缓冲液，100℃变性3 min,进行SDS-PAGE,转膜，1∶1?000的PY99抗体杂交，二抗为1∶2?000,用增强的化学发光试剂显色。
4.细胞迁移：先将Boyden Chamber(国产)两室间隔的硝膜(直径6.5 mm,8 μm孔径，Costar)两侧均覆盖FN，浓度同上，37℃下放置60 min。上室加入细胞悬液(6×104),下室为完全培养液，孵箱内(5%CO2,37℃)静置6 hr,取出滤膜，将上室面细胞刮除，经固定染色后，在200×光镜下细胞计数(个/HFP200×)。每组3张膜，随机6个视野/膜。
5.统计学处理：统计变量以均数±标准差表示，多重对比采用方差分析，α值取双侧0.05,P<0.05为差异具有显著性。
, 百拇医药
结 果
1.SMCs粘附铺展：在经FN预处理的培养板中，20 min即可见部分细胞贴壁粘附，在未经FN处理的对照组中，SMC始终处于圆形的悬浮状态。统计60 min的铺展比率，FN作用后各组均显著高于对照(P<0.05),20、40、60 μg/ml组分别为(75.6±6.5)%、(80.9±5.4)%和(82.4±7.9)%，无组间差异，但均高于5 μg/ml的(20.8±3.2)%和10 μg/ml组的(32.8±4.7)%,P<0.05。
2.细胞迁移：随FN浓度的递增各组迁移细胞数也逐渐增加，从16.8±3.6/HFP200×到48.9±6.1/HFP200×,(P<0.05)。
3.FAK及其磷酸化表达量：Western blot结果表明，经FN作用后各浓度组SMC中FAK均有表达，免疫沉淀后测其磷酸化表达量可见在10 μg/ml FN作用后就处于高表达量，见图3。
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讨 论
细胞粘附迁移和增殖在多种血管损伤性疾病的病理生理过程中起重要作用。本实验结果表明，FN作为ECM非胶原糖蛋白的主要成分有效地诱导了VSMCs的粘附铺展和迁移，体现出ECM在VSMCs转型和内膜增殖过程中的重要作用。从细胞生物学相关研究结果来看，这一病理生理过程是受复杂且尚未完全阐明的细胞内信号转导通路所调控。而FN与细胞膜表面相关受体相结合正是整合素介导信号转导的起始环节。本实验可见，FAK作为整合素与FN结合的下游信号分子，在SMCs粘附铺展的同时也被磷酸化而活化。
FAK是细胞内多条信号转导通路的交汇点，与多种信号转导有关，占有重要地位。它主要参与由整合素介导的信号系统[3]。在肿瘤细胞侵袭转移中起主导作用，但它与VSMCs增殖和迁移的关系尚不清楚。结合本研究提示，FAK活化是VSMCs一系列反应的重要环节，可能是受损动脉内膜增殖过程中的重要信号分子。我们通过反义FAK寡核苷酸有效抑制其活性，发现可以显著减少SMCs的迁移和粘附。
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从FAK的分子结构分析，当其活化以后，第397位的酪氨酸发生自身磷酸化，成为Src家族激酶具有高亲和力的结合位点，二者相结合，形成FAK/Src复合体，进一步促进其自身磷酸化，接着通过复杂的信号传递，激活Ras蛋白，后者活化丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)[4]，MAPK是一类广泛存在于真核细胞中具有丝氨酸和酪氨酸双重磷酸化能力的蛋白激酶，经被活化后可显著增强c-fos和c-jun基因的表达，可见FAK作为MAPK上游的关键信号分子对细胞粘附增殖和迁移起着重要作用。磷脂酰肌醇-3(PI-3)激酶作为FAK磷酸化的条件其作用尚有争议[5]，Cospedal等[6]通过血小板衍生生长因子-BB(PDGF-BB)激活FAK并在促进SMC迁移时，发现其效应不依赖于PI-3激酶。
本研究结果提示，ECM诱导SMCs的粘附和迁移可能是通过FAK介导的。FAK介导的信号转导通路在这一过程中发现了重要的作用，对其活性进行调节，将有助于抑制动脉损伤后增生内膜中SMCs的迁移。
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参 考 文 献
1，Akiyama SK. Integrins in cell adhesion and signalling. Hum Cell, 1996,9:181-186.
2，Xu LH, Owens LV, Sturge GC. Attenuation of the expression of the focal adhesion kinase induces apoptosis in tomor cells. Cell Growth Differ, 1996,7:413-418.
3，Clark EA, Brugge JS. Integrins and signal transduction pathways: the road taken. Science, 1995,268:233-239.
, 百拇医药 4，Bogoyevich MA. Signalling via stress-activated MAPK in the cardiovascular system. Cardiovasc Res,2000,45:826-842.
5，Reiske HR, Kao SC, Cary LA, et al. Requirement of PI-3 kinase in focal adhesion kinase-promoted cell migration. J Bio Chem, 1999,274:12361-12366.
6，Cospedal R, Abedi H, Zachary I: PDGF-BB regulation of migration and FAK phosphorylation in rat aortic smooth muscle cells: role of phosphatidylinositol 3-kinase and MAPK. Cardiolvasc Res, 1999,41:708-721.
(收稿:2000-01-12), http://www.100md.com
单位：尹航 汪丽蕙 彭旭 霍勇 唐朝枢(北京大学第一医院心脏科 100034)；周柔丽(北京大学医学部细胞生物学教研室)
关键词：血管平滑肌细胞；细胞外基质；粘着斑激酶；粘附；迁移
中国介入心脏病学杂志000314 【摘要】 目的 探讨纤粘连蛋白介导的血管平滑肌细胞粘附和迁移与粘着斑激酶(focal adhesion kinase,FAK)的磷酸化的关系。方法 不同浓度的纤粘连蛋白(fibronectin,FN)刺激培养的血管平滑肌细胞(smooth muscle cells,SMCs)，观察细胞粘附反应，统计铺展比率。免疫沉淀和Wstern blot分别检测FAK及FAK磷酸化的表达量。利用改良的Boyden Chamber测SMCs迁移。结果 FN有效地促进了SMC粘附，其铺展比率、迁移细胞数均显著高于对照(P<0.05),且随FN浓度递增而增加。其中20、40、60 μg/ml组分别为(75.6±6.5)%、(80.9±5.4)%和(82.4±7.9)%，无组间差异，但均高于5 μg/ml的(20.8±3.2)%和10 μg/ml组的(32.8±4.7)%,各组迁移细胞数也从16.8±3.6/HFP 200×增加到48.9±6.1/HFP 200×。不同浓度FN作用后均有FAK的表达，FN10 μg/ml即可致FAK磷酸化。表明FN介导SMCs粘附和迁移时伴有显著的FAK活化。结论 FN诱导平滑肌细胞粘附和迁移可能是通过FAK介导的，对其活性进行调控将有助于抑制血管损伤后内膜平滑肌细胞的迁移。
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Role of focal adhesion kinase phosphorylation in smooth muscle cells adhesion and migration mediated by fibronectin
Yin Hang, Peng Xu, Wang Lihui, et al.
(Department of Cardiology, The First Hospital of Beijing University, Beijing 100034)
【Abstract】 Objective To investigate the role of focal adhesion kinase (FAK) phosphorylation in smooth muscle cells (SMCs) adhesion and migration mediated by fibronectin (FN). Methods Cultured rat aortic SMCs were stimulated by FN. Cell adhesion and spreading were enumerated by light microscope. Content of FAK and tyrosine kinase were investigated by immunoprecipitation and immunoblot. Cell counting for migration were enumerated in modified Boyden Chamber. Results We observed SMCs adhesion and spreading stimulated by FN significantly than the control. Cell migration were also enhanced significantly. In the mean time, expression of FAK were detected and tyrosine phosphorylation of FAK stimulated by at least 10 μg/ml FN were also observed. It showed that tyrosine kinase activity was associated with SMCs adhesion and migration mediated by FN. Conclusion SMCs adhesion and migration induced by FN maybe mediated by FAK. To modulate tyrosine kinase activity of FAK may contribute to inhibit SMCs migration in injured arteries.
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【Key words】 Vascular smooth muscle cells; Extracellular matrix; Focal adhesion kinase; Adhesion; Migration
FN是构成血管壁细胞外基质(extracellular matrix,ECM)的主要成分之一，在血管损伤后内膜增殖过程中起重要作用。已有的研究发现FN在体内可以刺激SMCs的迁移和增殖，但其确切机制以及所涉及的信号转导尚不清楚。FAK是一种非受体型酪氨酸激酶，在细胞信号转导中占重要地位，与细胞迁移和增殖密切相关[1，2]。本实验拟在体外培养的SMCs上，探讨FN介导细胞粘附和迁移对FAK磷酸化的影响。
材料和方法
1.细胞培养：取SD大鼠主动脉中膜，采用组织块贴片法，以含15%胎牛血清的M199培养液(GIBCO)培养，传至第5代用于实验，用兔抗SMC-myosin抗体(SIGMA)进行SMCs免疫细胞化学鉴定。
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2.细胞粘附铺展：将FN(购于北京医科大学细胞生物学教研室)5、10、20、40、60 μg/ml覆盖于96孔培养板孔底，4℃静置过夜，将SMCs(2×103)接种于培养孔，孵箱内(5%CO2,37℃)静置60 min后观察粘附反应，凡圆形透亮的细胞为非贴壁细胞。镜下计数，统计细胞粘附铺展比率(%)，另设无FN处理的对照。
3.免疫沉淀和Western blot将SMCs(5×105)接种于直接35 mm已覆盖有FN的细胞培养皿，孵箱内(5%CO2,37℃)静置4 h,弃去培养液，用D-Hank′s液清洗细胞3遍，甩干，加入预冷的0.25 ml RIPA细胞裂解缓冲液，冰置20 min后用刮起细胞，连同裂解液移至EP管中，12?000 g离心20 min(4℃),保留上清进行蛋白定量。取10 μg蛋白，加入上样缓冲液，100℃变性3 min后进行SDS-PAGE,转膜，用1∶1?000的抗FAK多抗(Santa Cruz)进行杂交，二抗为1∶2?000辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG(中山公司)，最后用增强的化学发光试剂(Santa Cruz)显色。
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免疫沉淀用于检测磷酸化FAK的表达量。另取100 μg总蛋白，加入10 μg FAK抗体(Santa Cruz),4℃反应1 h,随后加入50 μl A蛋白-Sepharose珠进行沉淀，用裂解缓冲液洗3次，加入上样缓冲液，100℃变性3 min,进行SDS-PAGE,转膜，1∶1?000的PY99抗体杂交，二抗为1∶2?000,用增强的化学发光试剂显色。
4.细胞迁移：先将Boyden Chamber(国产)两室间隔的硝膜(直径6.5 mm,8 μm孔径，Costar)两侧均覆盖FN，浓度同上，37℃下放置60 min。上室加入细胞悬液(6×104),下室为完全培养液，孵箱内(5%CO2,37℃)静置6 hr,取出滤膜，将上室面细胞刮除，经固定染色后，在200×光镜下细胞计数(个/HFP200×)。每组3张膜，随机6个视野/膜。
5.统计学处理：统计变量以均数±标准差表示，多重对比采用方差分析，α值取双侧0.05,P<0.05为差异具有显著性。
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结 果
1.SMCs粘附铺展：在经FN预处理的培养板中，20 min即可见部分细胞贴壁粘附，在未经FN处理的对照组中，SMC始终处于圆形的悬浮状态。统计60 min的铺展比率，FN作用后各组均显著高于对照(P<0.05),20、40、60 μg/ml组分别为(75.6±6.5)%、(80.9±5.4)%和(82.4±7.9)%，无组间差异，但均高于5 μg/ml的(20.8±3.2)%和10 μg/ml组的(32.8±4.7)%,P<0.05。
2.细胞迁移：随FN浓度的递增各组迁移细胞数也逐渐增加，从16.8±3.6/HFP200×到48.9±6.1/HFP200×,(P<0.05)。
3.FAK及其磷酸化表达量：Western blot结果表明，经FN作用后各浓度组SMC中FAK均有表达，免疫沉淀后测其磷酸化表达量可见在10 μg/ml FN作用后就处于高表达量，见图3。
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细胞粘附迁移和增殖在多种血管损伤性疾病的病理生理过程中起重要作用。本实验结果表明，FN作为ECM非胶原糖蛋白的主要成分有效地诱导了VSMCs的粘附铺展和迁移，体现出ECM在VSMCs转型和内膜增殖过程中的重要作用。从细胞生物学相关研究结果来看，这一病理生理过程是受复杂且尚未完全阐明的细胞内信号转导通路所调控。而FN与细胞膜表面相关受体相结合正是整合素介导信号转导的起始环节。本实验可见，FAK作为整合素与FN结合的下游信号分子，在SMCs粘附铺展的同时也被磷酸化而活化。
FAK是细胞内多条信号转导通路的交汇点，与多种信号转导有关，占有重要地位。它主要参与由整合素介导的信号系统[3]。在肿瘤细胞侵袭转移中起主导作用，但它与VSMCs增殖和迁移的关系尚不清楚。结合本研究提示，FAK活化是VSMCs一系列反应的重要环节，可能是受损动脉内膜增殖过程中的重要信号分子。我们通过反义FAK寡核苷酸有效抑制其活性，发现可以显著减少SMCs的迁移和粘附。
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从FAK的分子结构分析，当其活化以后，第397位的酪氨酸发生自身磷酸化，成为Src家族激酶具有高亲和力的结合位点，二者相结合，形成FAK/Src复合体，进一步促进其自身磷酸化，接着通过复杂的信号传递，激活Ras蛋白，后者活化丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)[4]，MAPK是一类广泛存在于真核细胞中具有丝氨酸和酪氨酸双重磷酸化能力的蛋白激酶，经被活化后可显著增强c-fos和c-jun基因的表达，可见FAK作为MAPK上游的关键信号分子对细胞粘附增殖和迁移起着重要作用。磷脂酰肌醇-3(PI-3)激酶作为FAK磷酸化的条件其作用尚有争议[5]，Cospedal等[6]通过血小板衍生生长因子-BB(PDGF-BB)激活FAK并在促进SMC迁移时，发现其效应不依赖于PI-3激酶。
本研究结果提示，ECM诱导SMCs的粘附和迁移可能是通过FAK介导的。FAK介导的信号转导通路在这一过程中发现了重要的作用，对其活性进行调节，将有助于抑制动脉损伤后增生内膜中SMCs的迁移。
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参 考 文 献
1，Akiyama SK. Integrins in cell adhesion and signalling. Hum Cell, 1996,9:181-186.
2，Xu LH, Owens LV, Sturge GC. Attenuation of the expression of the focal adhesion kinase induces apoptosis in tomor cells. Cell Growth Differ, 1996,7:413-418.
3，Clark EA, Brugge JS. Integrins and signal transduction pathways: the road taken. Science, 1995,268:233-239.
, 百拇医药 4，Bogoyevich MA. Signalling via stress-activated MAPK in the cardiovascular system. Cardiovasc Res,2000,45:826-842.
5，Reiske HR, Kao SC, Cary LA, et al. Requirement of PI-3 kinase in focal adhesion kinase-promoted cell migration. J Bio Chem, 1999,274:12361-12366.
6，Cospedal R, Abedi H, Zachary I: PDGF-BB regulation of migration and FAK phosphorylation in rat aortic smooth muscle cells: role of phosphatidylinositol 3-kinase and MAPK. Cardiolvasc Res, 1999,41:708-721.
(收稿:2000-01-12), http://www.100md.com