高效毛细管电泳法测定利多卡因代谢产物单乙基甘氨酰二甲苯胺
作者：崔贞福 贺平 吴孟超 李琳芳 郭亚军
单位：上海 200438 第二军医大学 东方肝胆外科研究所肿瘤免疫基因治疗中心
关键词：高效毛细管电泳；单乙基甘胺酰二 甲苯胺；利多卡因
摘要 目的摘要 目的：建立一种测定利多卡因代谢产物单乙基甘氨酰二甲苯胺(ME GX)含量的高效毛细管电泳法。方法：用50mmol/L硼酸缓冲液(pH=8.8)为 电泳电解液，电压12kV,运行电流18.8～23.2μA,检测波长214nm,有效毛细管长度50cm,管径 50μm,氨茶碱为内标，展开12min。8只昆明种小白鼠腹腔注射0.2%利多卡因40mg/kg,用本法 测定其5h尿液中MEGX累积排泄量。结果：MEGX迁移时间7.8min,氨茶碱迁 移时间10.7min。MEGX含量为0.062～1.0mg/ml时，其浓度与色谱峰面积线性关系良好,[ WTBX]r=0.9991,日内、日间变异系数均小于7.8%,回收率为98.4%～101.6%,常用3 0种药物对其无干扰。8只小鼠MEGX累积排泄量为(295.2±55.2)μg,其中游离型MEGX为44. 7%,结合型为55.3%。结论：该方法简单、快速、灵敏，特异性和重现 性良好，具有较强实用价值。
, http://www.100md.com
Determination of monethylglycinexylidide,a metabolite of lidocaine,with high
performance capillary electrophoresis
Cui Zhenfu
(Tumor Immunology and Gene Therapy Center,Eastern Institute of Hepatobiliary Surgery,Second Military Medical University,Shanghai 200438)
He Ping
(Tumor Immunology and Gene Therapy Center,Eastern Institute of Hepatobiliary Surgery,Second Military Medical University,Shanghai 200438)
, 百拇医药
Wu Mengchao
(Tumor Immunology and Gene Therapy Center,Eastern Institute of Hepatobiliary Surgery,Second Military Medical University,Shanghai 200438)
ABSTRACT OBJECTIVE：To develope a method for the determination of monoethylglycinexylidide(MEGX),a metabolite of lidocaine by high performance capi llary electrophoresis.METHODS:50mmol/L obrate buffer,pH 8.8,was used as the electrophoresis solution.Electrophoresis was carried out with a constant voltage of 15kV and a current of 18.8～23.2μA and aminophylline as internal st andard.The length of effective capillary was 50cm(DI 50μm).The detecting wavele ngth was 214nm,8 mice were administered 0.2% lidocaine 40mg/kg,ip.The content of MEGX in the urine collected for 5h was measured.RESULTS:The migrati on time of MEGX was 7.8min and that of aminophylline was 10.7min.The linear rang e was 62～1000μg/ml(r=0.9991) with relative standard deviations les s than 7.8%.The total content of MEGX in the urine collected for 5h in mice was (295.2±55.2)μg,among which free MEGX was 44.7% and conjugated MEGX was 55.3%. CONCLUSION: The method was fast,convenient and sensitive.It was applie d to assay MEGX in mouse urine and got satisfactory results.
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KEY WORDS high performance capillary electrophoresis,MEGX,lidocaine
单乙基甘氨酰二甲苯胺(MEGX)是利多卡因的代谢产物。在体内，利多卡 因经肝P-450 3A酶代谢，氧位去乙基，生成MEGX。其一部分以游离形式直接从尿液中排出 体外，另一部分在肝脏中进行Ⅱ相代谢反应，与硫酸或葡萄糖醛酸结合后，经尿液排出体外 [1]。近年来，大量研究表明，MEGX的生成速率及含量变化与肝脏贮备功能密切相 关。所以，MEGX试验(MEGX test)目前被广泛用于临床和药理学实验，评估肝移植时供肝的 贮备功能，以及各种因素对肝脏生物转化功能的影响[2，3]。测定MEGX含量的方法 有多种，通常采用荧光偏振免疫法和高效液相色谱法。但是，这2种方法不仅价格昂贵，前 者还受多种干扰因素影响，有时实验误差较大。后者需要复杂的样品预处理，不能满足实时分析的要求。高效毛细管电泳技术是 近10年迅速发展起来的一种新型分离分析方法，具有快速、简便、高效、应用范围广泛等优 点[4]。本文采用硼酸缓冲液为电解液，氨茶碱为内标，建立了一种测定MEGX含量 的高效毛细管电泳法。
, 百拇医药
1 实验材料
1.1 仪器与试剂 Beckman高效毛细管电泳系统(P/ACE 5000型主机,IBM 446D XZ型电脑,Epson LQ-300型打印机,GOLD软件)；石英毛细管57cm×50μm(美国Beckman公司) ，有效长度50cm。MEGX(第二军医大学药学院李克教授提供)。氨茶碱(上海信谊药厂，批号: 951003)。β-葡萄糖醛酸酶/硫酸酶(Sigma公司)。硼砂、硼酸、氢氧化钠、 盐酸等试剂均为国产分析纯或优级纯，水为自制双蒸去离子水。
1.2 实验动物 昆明种小白鼠，雄性,18～22g(中科院上海实验动物中心 ，清洁级，证书号005。所有小鼠8:00am～8:00pm照光,8:00pm～8:00am避光,10:00am～ 3:00pm喂食，自由饮水，实验前12h开始禁食。
2 方法与结果
, http://www.100md.com 2.1 测定条件 每次开机后用0.1 mol/L盐酸,0.1mol/L氢氧化钠,50mmol/L硼酸缓冲液(pH=8.8)和水各冲洗5min,2次进样 之间用电泳缓冲液和水各冲洗2min。高压进样10s,恒定电压12kV,运行电流18.8～23.3μA, 柱温21℃,检测波长214nm,设定运行时间12min,氨茶碱为内标。用Beckman黄金系统软件分析 处理所得资料。在此条件下，MEGX迁移时间为7.8min,氨茶碱迁移时间为10.7min。
2.2 样品处理 取含MEGX的小鼠尿液0.2ml,加0.1mol/L醋酸钠缓冲 液(pH5.5)0.2ml及0.5%氨茶碱20μl,混匀。加甲醇0.4ml,旋涡震荡1min,10000r/min离心15m in,取上清，按《测定条件》分析测定。用空白小鼠尿液同法操作，发现对样品测定无干扰 ，结果见图1。
2.3 标准曲线 将MEGX配制成62.5,125,250,500和1000 μg/ml的标准液，分别取0.2ml,按“样品处理”项下操作，每个浓度均为3复管。将MEGX与 氨茶碱峰面积比对MEGX浓度进行线性回归，其理论方程为：Y=379.79x+6.87,r =0.9991。当信噪比为2∶1时，最低检测限为2.5μg/ml。
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2.4 干扰试验 在本试验条件下，测定了临床上常用的30种药物：利血 平、肝太乐、氨甲苯酸、谷氨酸钠、葡萄糖酸钙、精氨酸、氢化可的松、5-Fu、维生素C、 肌苷、甲氧氯普胺、地塞米松、氯丙嗪、麻黄碱、维生素B6、辅酶A、ATP、酚磺乙胺、呋 塞米、阿托品、川芎、丹参、维生素B12、维生素K3、维生素K1、庆大霉素、氨 苄青霉素、链霉素、卡那霉素、氯霉素，结果表明，它们对MEGX及内标氨茶碱的色谱峰均无 干扰。
图1 MEGX的高效毛细管电泳图
a-空白小鼠尿液；b-小鼠尿液中MEGX的色谱图
2.5 回收率及精密度 用空白小鼠尿液加MEGX配制成表1所示的 3种不同浓度，按“样品处理”项下操作，计算回收率及日内、日间精密度，结果见表1。
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表1 MEGX回收率和精密度/
±s,n =3
样品
加入量
/μg.ml-1
测得量
/μg.ml-1
回收率
/%
日 内
, http://www.100md.com
RSD/%
日间
RSD/%
1
62.5
61.5±3.0
98.4± 4.8
5.3
7.8
2
250
254.0±9.8
101.6±3.8
, 百拇医药
4.6
5.7
3
1000
1012.1±35.3
101.2±3.4
4.1
5.3
2.6 高效毛细管电泳法测定小鼠尿液中MEGX含量 8只小鼠，适应1周后 ，腹腔注射0.2%利多卡因40mg/kg,分别置于代谢笼中，收集5h尿液。测定体积后，各取0.2m l×2。一份按“样品处理”项下操作，测定游离MEGX含量，另一份加2100μ/ml β-葡萄糖醛酸酶/硫酸酶0.2ml,37℃恒温孵育20h后，加甲醇0.4ml,10000r/min离心15mi n,测定结合型与游离型MEGX总量。结合型MEGX含量=(MEGX总量-游离型MEGX含量)×尿量。结 果见表2。
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3 讨 论
本文采用自由溶液电泳，以氨 茶碱为内标，使被测样品获得良好分离效果。MEGX及内标出峰快，迁移时间短于11min。尤 其是用甲醇沉淀尿液中蛋白质后，直接用上清液进样分析，避免了HPLC法的复杂处理过程， 具有较强的实用价值。最低检测限为2.5μg/ml，临床常用的30种药物对其色谱峰无干扰， 回收率，日内、日间RSD均在允许范围之内，说明该方法简单、快速、灵 敏、稳定，专一性强。给小鼠腹腔注射0.2%利多卡因40mg/kg后，其5h尿液中MEGX累积排泄 量为(295.2±55.2)μg,其中游离型MEGX占44.7%,结合型占55.3%，该结果与人体实 验资料基本是一致的。
表2 小鼠尿液中结合型及游离型MEGX累积排 泄量/μg
编号
结合型MEGX
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含量
游离型MEGX
含量
MEGX累积
排泄量
1
142.7
155.2
297.9
2
140.4
217.0
357.4
, 百拇医药
3
138.3
220.2
358.5
4
161.9
167.2
329.1
5
146.4
165.9
312.3
6
, 百拇医药
110.2
145.1
255.3
7
96.1
110.3
206.4
8
121.6
123.1
244.7
x±s
132.2±21.3
, 百拇医药
163.0±39.5
295.2±55.2
参考文献
1，Tam YK,Ke J,Coutts TR,et al.Quantific ation of three lidocaine metabolites and their conjugates.Pharm Res,1990,7(5)∶5 04.
2，陈世耀，王吉耀.利多卡因试验在肝移植中的应用及其在 慢性肝病诊断及预后评价中的应用前景.临床肝胆病杂志，1996，12(3)∶128.
3，Von SJ,Erhard J,Beste M,et al.Convent ional and quantitative liver function tests after hepatic transplantation prospe ctive long-term follow-up.Transpl Int,1997,10(3)∶212.
4，王杰，丁洁.高效毛细管电泳技术.中国医药工业杂志，1 997，28(7)∶327.
收稿日期：1999-04-01, 百拇医药
单位：上海 200438 第二军医大学 东方肝胆外科研究所肿瘤免疫基因治疗中心
关键词：高效毛细管电泳；单乙基甘胺酰二 甲苯胺；利多卡因
摘要 目的摘要 目的：建立一种测定利多卡因代谢产物单乙基甘氨酰二甲苯胺(ME GX)含量的高效毛细管电泳法。方法：用50mmol/L硼酸缓冲液(pH=8.8)为 电泳电解液，电压12kV,运行电流18.8～23.2μA,检测波长214nm,有效毛细管长度50cm,管径 50μm,氨茶碱为内标，展开12min。8只昆明种小白鼠腹腔注射0.2%利多卡因40mg/kg,用本法 测定其5h尿液中MEGX累积排泄量。结果：MEGX迁移时间7.8min,氨茶碱迁 移时间10.7min。MEGX含量为0.062～1.0mg/ml时，其浓度与色谱峰面积线性关系良好,[ WTBX]r=0.9991,日内、日间变异系数均小于7.8%,回收率为98.4%～101.6%,常用3 0种药物对其无干扰。8只小鼠MEGX累积排泄量为(295.2±55.2)μg,其中游离型MEGX为44. 7%,结合型为55.3%。结论：该方法简单、快速、灵敏，特异性和重现 性良好，具有较强实用价值。
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Determination of monethylglycinexylidide,a metabolite of lidocaine,with high
performance capillary electrophoresis
Cui Zhenfu
(Tumor Immunology and Gene Therapy Center,Eastern Institute of Hepatobiliary Surgery,Second Military Medical University,Shanghai 200438)
He Ping
(Tumor Immunology and Gene Therapy Center,Eastern Institute of Hepatobiliary Surgery,Second Military Medical University,Shanghai 200438)
, 百拇医药
Wu Mengchao
(Tumor Immunology and Gene Therapy Center,Eastern Institute of Hepatobiliary Surgery,Second Military Medical University,Shanghai 200438)
ABSTRACT OBJECTIVE：To develope a method for the determination of monoethylglycinexylidide(MEGX),a metabolite of lidocaine by high performance capi llary electrophoresis.METHODS:50mmol/L obrate buffer,pH 8.8,was used as the electrophoresis solution.Electrophoresis was carried out with a constant voltage of 15kV and a current of 18.8～23.2μA and aminophylline as internal st andard.The length of effective capillary was 50cm(DI 50μm).The detecting wavele ngth was 214nm,8 mice were administered 0.2% lidocaine 40mg/kg,ip.The content of MEGX in the urine collected for 5h was measured.RESULTS:The migrati on time of MEGX was 7.8min and that of aminophylline was 10.7min.The linear rang e was 62～1000μg/ml(r=0.9991) with relative standard deviations les s than 7.8%.The total content of MEGX in the urine collected for 5h in mice was (295.2±55.2)μg,among which free MEGX was 44.7% and conjugated MEGX was 55.3%. CONCLUSION: The method was fast,convenient and sensitive.It was applie d to assay MEGX in mouse urine and got satisfactory results.
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KEY WORDS high performance capillary electrophoresis,MEGX,lidocaine
单乙基甘氨酰二甲苯胺(MEGX)是利多卡因的代谢产物。在体内，利多卡 因经肝P-450 3A酶代谢，氧位去乙基，生成MEGX。其一部分以游离形式直接从尿液中排出 体外，另一部分在肝脏中进行Ⅱ相代谢反应，与硫酸或葡萄糖醛酸结合后，经尿液排出体外 [1]。近年来，大量研究表明，MEGX的生成速率及含量变化与肝脏贮备功能密切相 关。所以，MEGX试验(MEGX test)目前被广泛用于临床和药理学实验，评估肝移植时供肝的 贮备功能，以及各种因素对肝脏生物转化功能的影响[2，3]。测定MEGX含量的方法 有多种，通常采用荧光偏振免疫法和高效液相色谱法。但是，这2种方法不仅价格昂贵，前 者还受多种干扰因素影响，有时实验误差较大。后者需要复杂的样品预处理，不能满足实时分析的要求。高效毛细管电泳技术是 近10年迅速发展起来的一种新型分离分析方法，具有快速、简便、高效、应用范围广泛等优 点[4]。本文采用硼酸缓冲液为电解液，氨茶碱为内标，建立了一种测定MEGX含量 的高效毛细管电泳法。
, 百拇医药
1 实验材料
1.1 仪器与试剂 Beckman高效毛细管电泳系统(P/ACE 5000型主机,IBM 446D XZ型电脑,Epson LQ-300型打印机,GOLD软件)；石英毛细管57cm×50μm(美国Beckman公司) ，有效长度50cm。MEGX(第二军医大学药学院李克教授提供)。氨茶碱(上海信谊药厂，批号: 951003)。β-葡萄糖醛酸酶/硫酸酶(Sigma公司)。硼砂、硼酸、氢氧化钠、 盐酸等试剂均为国产分析纯或优级纯，水为自制双蒸去离子水。
1.2 实验动物 昆明种小白鼠，雄性,18～22g(中科院上海实验动物中心 ，清洁级，证书号005。所有小鼠8:00am～8:00pm照光,8:00pm～8:00am避光,10:00am～ 3:00pm喂食，自由饮水，实验前12h开始禁食。
2 方法与结果
, http://www.100md.com 2.1 测定条件 每次开机后用0.1 mol/L盐酸,0.1mol/L氢氧化钠,50mmol/L硼酸缓冲液(pH=8.8)和水各冲洗5min,2次进样 之间用电泳缓冲液和水各冲洗2min。高压进样10s,恒定电压12kV,运行电流18.8～23.3μA, 柱温21℃,检测波长214nm,设定运行时间12min,氨茶碱为内标。用Beckman黄金系统软件分析 处理所得资料。在此条件下，MEGX迁移时间为7.8min,氨茶碱迁移时间为10.7min。
2.2 样品处理 取含MEGX的小鼠尿液0.2ml,加0.1mol/L醋酸钠缓冲 液(pH5.5)0.2ml及0.5%氨茶碱20μl,混匀。加甲醇0.4ml,旋涡震荡1min,10000r/min离心15m in,取上清，按《测定条件》分析测定。用空白小鼠尿液同法操作，发现对样品测定无干扰 ，结果见图1。
2.3 标准曲线 将MEGX配制成62.5,125,250,500和1000 μg/ml的标准液，分别取0.2ml,按“样品处理”项下操作，每个浓度均为3复管。将MEGX与 氨茶碱峰面积比对MEGX浓度进行线性回归，其理论方程为：Y=379.79x+6.87,r =0.9991。当信噪比为2∶1时，最低检测限为2.5μg/ml。
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2.4 干扰试验 在本试验条件下，测定了临床上常用的30种药物：利血 平、肝太乐、氨甲苯酸、谷氨酸钠、葡萄糖酸钙、精氨酸、氢化可的松、5-Fu、维生素C、 肌苷、甲氧氯普胺、地塞米松、氯丙嗪、麻黄碱、维生素B6、辅酶A、ATP、酚磺乙胺、呋 塞米、阿托品、川芎、丹参、维生素B12、维生素K3、维生素K1、庆大霉素、氨 苄青霉素、链霉素、卡那霉素、氯霉素，结果表明，它们对MEGX及内标氨茶碱的色谱峰均无 干扰。
图1 MEGX的高效毛细管电泳图
a-空白小鼠尿液；b-小鼠尿液中MEGX的色谱图
2.5 回收率及精密度 用空白小鼠尿液加MEGX配制成表1所示的 3种不同浓度，按“样品处理”项下操作，计算回收率及日内、日间精密度，结果见表1。
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表1 MEGX回收率和精密度/
±s,n =3样品
加入量
/μg.ml-1
测得量
/μg.ml-1
回收率
/%
日 内
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RSD/%
日间
RSD/%
1
62.5
61.5±3.0
98.4± 4.8
5.3
7.8
2
250
254.0±9.8
101.6±3.8
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4.6
5.7
3
1000
1012.1±35.3
101.2±3.4
4.1
5.3
2.6 高效毛细管电泳法测定小鼠尿液中MEGX含量 8只小鼠，适应1周后 ，腹腔注射0.2%利多卡因40mg/kg,分别置于代谢笼中，收集5h尿液。测定体积后，各取0.2m l×2。一份按“样品处理”项下操作，测定游离MEGX含量，另一份加2100μ/ml β-葡萄糖醛酸酶/硫酸酶0.2ml,37℃恒温孵育20h后，加甲醇0.4ml,10000r/min离心15mi n,测定结合型与游离型MEGX总量。结合型MEGX含量=(MEGX总量-游离型MEGX含量)×尿量。结 果见表2。
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3 讨 论
本文采用自由溶液电泳，以氨 茶碱为内标，使被测样品获得良好分离效果。MEGX及内标出峰快，迁移时间短于11min。尤 其是用甲醇沉淀尿液中蛋白质后，直接用上清液进样分析，避免了HPLC法的复杂处理过程， 具有较强的实用价值。最低检测限为2.5μg/ml，临床常用的30种药物对其色谱峰无干扰， 回收率，日内、日间RSD均在允许范围之内，说明该方法简单、快速、灵 敏、稳定，专一性强。给小鼠腹腔注射0.2%利多卡因40mg/kg后，其5h尿液中MEGX累积排泄 量为(295.2±55.2)μg,其中游离型MEGX占44.7%,结合型占55.3%，该结果与人体实 验资料基本是一致的。
表2 小鼠尿液中结合型及游离型MEGX累积排 泄量/μg
编号
结合型MEGX
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含量
游离型MEGX
含量
MEGX累积
排泄量
1
142.7
155.2
297.9
2
140.4
217.0
357.4
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3
138.3
220.2
358.5
4
161.9
167.2
329.1
5
146.4
165.9
312.3
6
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110.2
145.1
255.3
7
96.1
110.3
206.4
8
121.6
123.1
244.7
x±s
132.2±21.3
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163.0±39.5
295.2±55.2
参考文献
1，Tam YK,Ke J,Coutts TR,et al.Quantific ation of three lidocaine metabolites and their conjugates.Pharm Res,1990,7(5)∶5 04.
2，陈世耀，王吉耀.利多卡因试验在肝移植中的应用及其在 慢性肝病诊断及预后评价中的应用前景.临床肝胆病杂志，1996，12(3)∶128.
3，Von SJ,Erhard J,Beste M,et al.Convent ional and quantitative liver function tests after hepatic transplantation prospe ctive long-term follow-up.Transpl Int,1997,10(3)∶212.
4，王杰，丁洁.高效毛细管电泳技术.中国医药工业杂志，1 997，28(7)∶327.
收稿日期：1999-04-01, 百拇医药