检测人巨细胞病毒抗原的原位免疫PCR技术
作者：郝好杰 谷志远 宋海静 李琦 赵亚力
单位：解放军总医院分子生物学研究室，北京 100853
关键词：人巨细胞病毒；原位免疫PCR；抗原
军医进修学院学报000315 [摘要]目的：建立用于诊断HCMV活动性感染的原位免疫PCR方法。方法：HCMV AD169 株感染的人胚肺成纤维细胞或先天畸形胎儿肾组织石蜡切片，依次加入抗HCMV单抗、生物素化二抗、链霉亲合素以及作为指示元件的生物素化DNA，随后进行原位PCR扩增，经酶显色反应判断结果。结果：应用本法检测HCMV感染的细胞可于感染后 8 h 清晰检出阳性信号；检测先天畸形胎儿肾组织HCMV感染，阳性率显著高于免疫组化法。结论：本方法具有敏感性高、特异性好及精确组织定位等特点，可用于HCMV活动性感染诊断。
中图号：R373.9 文献标识码：A
, 百拇医药
文章编号：1005-1139(2000)03-0205-03
Detection of human cytomegalovirus antigen with immuno-in situ PCR assay
HAO Hao-jie, GU Zhi-yuan, SONG Hai-jing, LI qi, ZHAO Ya-li
(Molecular Biology Laboratory, PLA General Hospital, Beijing 100853, China)
Objective:This study was to establish a immuno-in situ PCR method for the diagnosis of HCMV active infection. Methods:The cells infected with HCMV or renal tissues sections of paraffin-embedded were used. A mouse monoclonal anti-HCMV primary antibody and biotinylated secondary antibody are stepwise immobilized. After that, free streptavidin and a marker biotinylated pBV220 DNA are immunobilized consecutively. A segment of the immunobilized DNA are amplified by in situ PCR with the appropriate primers. Antigens induced by HCMV were visualised with a purple blue precipitate obtained. Results:The strong positive signals can be detected as early as 8 h postinfection by immuno-in situ PCR, the positive signal was much more intensive with infection time. 6 of 23 case renal tissues of congenital malformed foetus were shown to be positive. Conclusion:This immuno-in situ PCR assay was sensitive, specific and exact location and can be used in diagnostic laboratories to detect active infection caused by HCMV.
, 百拇医药
Key words:human cytomegalovirus; immuno-in situ PCR; antigen
Sano等[1]把抗原抗体的免疫测定技术与PCR结合起来，创立了称为免疫PCR的极为敏感的抗原分子测定技术。张波等[2]依据免疫PCR技术原理发展了一种原位免疫PCR技术，用以增强免疫组化的敏感性。笔者应用原位免疫PCR技术检测了人巨细胞病毒(human cytomegalovirus, HCMV)感染，显著提高了检测敏感性。现将结果报告如下。
1 材料和方法
1.1 HCMV感染细胞制备 用 100 TCID50 剂量的HCMV AD169 株感染生长在组织培养室/玻片(购自Lab-Tek)上的人胚肺成纤维细胞，37 ℃ 培养，间隔不同时间收获，经PBS洗涤、丙酮固定，制成HCMV感染的细胞。
, http://www.100md.com
1.2 标本 解放军总医院病理科保存的尸检常规甲醛固定、石蜡包埋先天性畸形胎儿肾组织。
1.3 试剂 抗HCMV单克隆抗体(抗早期抗原抗体)购自CASTRA，免疫组化检测试剂盒采用华美公司ABC(SP)试剂盒，Bio-26-dUTP系Biotech公司产品，PCR反应系统购于华美公司。
1.4 生物素化DNA的制备及PCR引物 选取pBV220 质粒DNA，HindⅢ酶切、纯化 870 bp 的片段，作为原位免疫PCR中放大信号的DNA片段，经光敏生物素标记，成为指示元件。扩增该DNA片段的PCR引物，根据其序列，应用“oligo5.0”软件设计并合成：P1 5′-TAGATTTCTCTGGCGATTGA-3′；P2 5′-GGGCATTGTTTGGTAGGT-3′，扩增产物长为 447 bp。
1.5 免疫组化ABC(SP)法 HCMV AD169 株感染的人胚肺成纤维细胞固定或先天性畸形胎儿石蜡包埋组织切片常规脱蜡后，依次做好下处理：3% H2O2-甲醇处理 20 min，1% 胰蛋白酶消化处理 20 min， 10% 正常羊血清封闭 37 ℃ 30 min，抗HCMV单抗 4 ℃ 湿盒过夜孵育，生物素化羊抗鼠 IgG 37 ℃ 45 min，亲和素-碱性磷酸酶 37 ℃ 45 min，NBT/BCIP避光显色，镜检。
, 百拇医药
1.6 原位免疫PCR HCMV感染细胞或先天畸形胎儿肾组织石蜡切片按照上述免疫组化ABC(SP)法处理至生物素化羊抗鼠IgG反应后，参照文献[3]依次做如下处理：加链霉亲和素 37 ℃ 45 min，生物素化DNA 37 ℃ 45 min，经双蒸水充分漂洗后加 25 μl 原位PCR反应系统(含示踪的Bio-26-dUTP)，滴加石蜡油，盖玻片封片，置原位PCR扩增仪(美国基因公司PTL-100 型)上进行扩增。循环参数：94 ℃ 60 s、50 ℃ 60 s、72 ℃ 90 s，共 30 个循环，最后一个循环 72 ℃ 延伸 5min。扩增结束后，经严格漂洗，加亲和素-碱性磷酸酶 37 ℃ 45 min，NBT/BCIP避光显色，镜检。
受检组织或细胞出现紫蓝色沉积物为阳性。实验同时设立阴性对照：①正常人胚肺成纤维细胞；②不加抗HCMV单抗。
2 结 果
, 百拇医药 2.1 原位免疫PCR检测HCMV感染细胞 用 100TCID50 剂量HCMV AD169 株感染的人胚肺成纤维细胞分别在感染后 8 h、 16 h、 24 h、 48 和 72 h 收获，用原位免疫PCR方法检测。结果显示感染后 8 h，即可检出明显的阳性信号，阳性染色主要在细胞核内，随着感染时间延长，阳性信号增强，阳性细胞数增多。平行用免疫组化检测，感染后 8 h 可见较弱阳性信号，阳性细胞数很少。
2.2 23 例先天性畸形胎儿肾组织检测结果 分别应用原位免疫PCR及免疫组化方法，检测了 23 例先天性畸形胎儿肾组织中的HCMV抗原。用原位免疫PCR法检测，其中 6 例 (26.1%) 呈HCMV抗原阳性；而用免疫组化法检测只有 2 例 (8.7%) 呈HCMV抗原阳性。免疫组化法检出的阳性标本，原位免疫PCR也为阳性。原位免疫PCR法的阳性染色信号较强，阳性染色的细胞数明显多于免疫组化法。阳性信号主要决定于肾小管上皮细胞细胞核，少数间质细胞也呈阳性反应(图 1，图 2)。
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图1 原位免疫PCR法检测先天性畸形胎儿肾组织中HCMV抗原
图2 ABC(SP)法检测先天性畸形胎儿肾组织中HCMV抗原
3 讨 论
诊断HCMV感染主要依靠实验室检查。利用特异抗HCMV单克隆抗体的免疫组化技术，从病毒分离培养、病变组织、脱落细胞及外周血中直接检测到HCMV抗原，提示存在活动性HCMV感染，是诊断HCMV感染可靠的依据。因受灵敏度限制，检测HCMV抗原的免疫组化技术尚难于检出微量存在的病毒抗原，不能满足临床诊断要求，提高其灵敏度亟待解决[4]。原位免疫PCR技术[2]，可用于检测微量存在的抗原，极大地提高了免疫组化检测的敏感性，我们利用其基本原理，建立了检测HCMV抗原的原位免疫PCR方法，用于诊断活动性HCMV感染。
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研究结果表明，本法检测HCMV感染的人胚肺成纤维细胞，可在感染后 8 h 清晰地检出阳性信号，与常规免疫组化相比阳性信号强，阳性细胞数多，显示高敏感度。HCMV感染细胞后可在细胞核内表达即刻早期、早期和晚期蛋白，即刻早期、早期蛋白通常在病毒复制前即可产生，其存在提示病毒呈活动状态[5]。本法采用的单克隆抗体系抗早期蛋白抗原抗体，本文所获结果提示，对于培养生长缓慢的HCMV，将本法与病毒分离培养相结合，可以快速、敏感地诊断HCMV感染。采用本法检测先天性畸形胎儿肾组织HCMV感染，其敏感性也显著高于免疫组化法，并表现精确的组织定位，表明本法扩增放大组织上的HCMV抗原-抗体反应信号是完全可行的，可用于诊断活动性HCMV感染。
本法采用pBV220 质粒DNA片段作为指示元件DNA，它是与人基因组无关的DNA片段，与HCMV DNA序列也无同源性。在检测中平行设置的阴性对照(正常人胚肺成纤维细胞、不加抗HCMV单抗)，无阳性信号出现。同时我们用本法检测了收集到的 10 例因吸入窒息或其它原因无畸形死婴肾组织标本，也呈阴性染色。显示本法有较强特异性。
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本研究成功地将原位免疫PCR技术应用于HCMV感染诊断，显著提高了HCMV感染诊断敏感性。我们相信，经过适当改进，原位免疫PCR技术也可用于多种病毒感染诊断，增强其敏感性。
基金项目：国家计划生育委员会科研基金资助项目(1996-15)
作者简介：郝好杰(1966-)，男，河南省新乡市人，1993年军医进修学院夜大学毕业，解放军总医院基础医学研究所分子生物学研究室实验师；发表论文10篇。电话：(010)66937516；
E-mail:hhjie@public.bta.net.cn
[参考文献]
[1] Sano T, Smith CL, Cantor CR, et al. Immuno-PCR:Very sensitive antigen detection by means of specific antibody-DNA conjugates [J].Science, 1992,258(2):120-122.
, http://www.100md.com
[2] 张 波，董 荷，陆哲明,等.提高免疫组织化学敏感性的原位免疫聚合酶链反应技术[J].中华病理学杂志，1995,24(3):182-183.
[3] 宋海静，谷志远，卢彦平.原位PCR技术检测石蜡包埋脑组织中人巨细胞病毒DNA [J].中华微生物学和免疫学杂志，1997，17(6)：475-477.
[4] 董永绥.继续深入进行巨细胞病毒感染的研究[J].中华儿科杂志，1995，33(1)：3-4.
[5] Gaeta A, Nazzari C, Angeletti S, et al. Monitoring for cytomegalovirus infection in organ transplant recipients: analysis of pp65 antigen, DNA and late mRNA in peripheral blood leukocyles
收稿日期：1999-12-22； 修回日期：2000-01-17, 百拇医药
单位：解放军总医院分子生物学研究室，北京 100853
关键词：人巨细胞病毒；原位免疫PCR；抗原
军医进修学院学报000315 [摘要]目的：建立用于诊断HCMV活动性感染的原位免疫PCR方法。方法：HCMV AD169 株感染的人胚肺成纤维细胞或先天畸形胎儿肾组织石蜡切片，依次加入抗HCMV单抗、生物素化二抗、链霉亲合素以及作为指示元件的生物素化DNA，随后进行原位PCR扩增，经酶显色反应判断结果。结果：应用本法检测HCMV感染的细胞可于感染后 8 h 清晰检出阳性信号；检测先天畸形胎儿肾组织HCMV感染，阳性率显著高于免疫组化法。结论：本方法具有敏感性高、特异性好及精确组织定位等特点，可用于HCMV活动性感染诊断。
中图号：R373.9 文献标识码：A
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文章编号：1005-1139(2000)03-0205-03
Detection of human cytomegalovirus antigen with immuno-in situ PCR assay
HAO Hao-jie, GU Zhi-yuan, SONG Hai-jing, LI qi, ZHAO Ya-li
(Molecular Biology Laboratory, PLA General Hospital, Beijing 100853, China)
Objective:This study was to establish a immuno-in situ PCR method for the diagnosis of HCMV active infection. Methods:The cells infected with HCMV or renal tissues sections of paraffin-embedded were used. A mouse monoclonal anti-HCMV primary antibody and biotinylated secondary antibody are stepwise immobilized. After that, free streptavidin and a marker biotinylated pBV220 DNA are immunobilized consecutively. A segment of the immunobilized DNA are amplified by in situ PCR with the appropriate primers. Antigens induced by HCMV were visualised with a purple blue precipitate obtained. Results:The strong positive signals can be detected as early as 8 h postinfection by immuno-in situ PCR, the positive signal was much more intensive with infection time. 6 of 23 case renal tissues of congenital malformed foetus were shown to be positive. Conclusion:This immuno-in situ PCR assay was sensitive, specific and exact location and can be used in diagnostic laboratories to detect active infection caused by HCMV.
, 百拇医药
Key words:human cytomegalovirus; immuno-in situ PCR; antigen
Sano等[1]把抗原抗体的免疫测定技术与PCR结合起来，创立了称为免疫PCR的极为敏感的抗原分子测定技术。张波等[2]依据免疫PCR技术原理发展了一种原位免疫PCR技术，用以增强免疫组化的敏感性。笔者应用原位免疫PCR技术检测了人巨细胞病毒(human cytomegalovirus, HCMV)感染，显著提高了检测敏感性。现将结果报告如下。
1 材料和方法
1.1 HCMV感染细胞制备 用 100 TCID50 剂量的HCMV AD169 株感染生长在组织培养室/玻片(购自Lab-Tek)上的人胚肺成纤维细胞，37 ℃ 培养，间隔不同时间收获，经PBS洗涤、丙酮固定，制成HCMV感染的细胞。
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1.2 标本 解放军总医院病理科保存的尸检常规甲醛固定、石蜡包埋先天性畸形胎儿肾组织。
1.3 试剂 抗HCMV单克隆抗体(抗早期抗原抗体)购自CASTRA，免疫组化检测试剂盒采用华美公司ABC(SP)试剂盒，Bio-26-dUTP系Biotech公司产品，PCR反应系统购于华美公司。
1.4 生物素化DNA的制备及PCR引物 选取pBV220 质粒DNA，HindⅢ酶切、纯化 870 bp 的片段，作为原位免疫PCR中放大信号的DNA片段，经光敏生物素标记，成为指示元件。扩增该DNA片段的PCR引物，根据其序列，应用“oligo5.0”软件设计并合成：P1 5′-TAGATTTCTCTGGCGATTGA-3′；P2 5′-GGGCATTGTTTGGTAGGT-3′，扩增产物长为 447 bp。
1.5 免疫组化ABC(SP)法 HCMV AD169 株感染的人胚肺成纤维细胞固定或先天性畸形胎儿石蜡包埋组织切片常规脱蜡后，依次做好下处理：3% H2O2-甲醇处理 20 min，1% 胰蛋白酶消化处理 20 min， 10% 正常羊血清封闭 37 ℃ 30 min，抗HCMV单抗 4 ℃ 湿盒过夜孵育，生物素化羊抗鼠 IgG 37 ℃ 45 min，亲和素-碱性磷酸酶 37 ℃ 45 min，NBT/BCIP避光显色，镜检。
, 百拇医药
1.6 原位免疫PCR HCMV感染细胞或先天畸形胎儿肾组织石蜡切片按照上述免疫组化ABC(SP)法处理至生物素化羊抗鼠IgG反应后，参照文献[3]依次做如下处理：加链霉亲和素 37 ℃ 45 min，生物素化DNA 37 ℃ 45 min，经双蒸水充分漂洗后加 25 μl 原位PCR反应系统(含示踪的Bio-26-dUTP)，滴加石蜡油，盖玻片封片，置原位PCR扩增仪(美国基因公司PTL-100 型)上进行扩增。循环参数：94 ℃ 60 s、50 ℃ 60 s、72 ℃ 90 s，共 30 个循环，最后一个循环 72 ℃ 延伸 5min。扩增结束后，经严格漂洗，加亲和素-碱性磷酸酶 37 ℃ 45 min，NBT/BCIP避光显色，镜检。
受检组织或细胞出现紫蓝色沉积物为阳性。实验同时设立阴性对照：①正常人胚肺成纤维细胞；②不加抗HCMV单抗。
2 结 果
, 百拇医药 2.1 原位免疫PCR检测HCMV感染细胞 用 100TCID50 剂量HCMV AD169 株感染的人胚肺成纤维细胞分别在感染后 8 h、 16 h、 24 h、 48 和 72 h 收获，用原位免疫PCR方法检测。结果显示感染后 8 h，即可检出明显的阳性信号，阳性染色主要在细胞核内，随着感染时间延长，阳性信号增强，阳性细胞数增多。平行用免疫组化检测，感染后 8 h 可见较弱阳性信号，阳性细胞数很少。
2.2 23 例先天性畸形胎儿肾组织检测结果 分别应用原位免疫PCR及免疫组化方法，检测了 23 例先天性畸形胎儿肾组织中的HCMV抗原。用原位免疫PCR法检测，其中 6 例 (26.1%) 呈HCMV抗原阳性；而用免疫组化法检测只有 2 例 (8.7%) 呈HCMV抗原阳性。免疫组化法检出的阳性标本，原位免疫PCR也为阳性。原位免疫PCR法的阳性染色信号较强，阳性染色的细胞数明显多于免疫组化法。阳性信号主要决定于肾小管上皮细胞细胞核，少数间质细胞也呈阳性反应(图 1，图 2)。
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图1 原位免疫PCR法检测先天性畸形胎儿肾组织中HCMV抗原
图2 ABC(SP)法检测先天性畸形胎儿肾组织中HCMV抗原
3 讨 论
诊断HCMV感染主要依靠实验室检查。利用特异抗HCMV单克隆抗体的免疫组化技术，从病毒分离培养、病变组织、脱落细胞及外周血中直接检测到HCMV抗原，提示存在活动性HCMV感染，是诊断HCMV感染可靠的依据。因受灵敏度限制，检测HCMV抗原的免疫组化技术尚难于检出微量存在的病毒抗原，不能满足临床诊断要求，提高其灵敏度亟待解决[4]。原位免疫PCR技术[2]，可用于检测微量存在的抗原，极大地提高了免疫组化检测的敏感性，我们利用其基本原理，建立了检测HCMV抗原的原位免疫PCR方法，用于诊断活动性HCMV感染。
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研究结果表明，本法检测HCMV感染的人胚肺成纤维细胞，可在感染后 8 h 清晰地检出阳性信号，与常规免疫组化相比阳性信号强，阳性细胞数多，显示高敏感度。HCMV感染细胞后可在细胞核内表达即刻早期、早期和晚期蛋白，即刻早期、早期蛋白通常在病毒复制前即可产生，其存在提示病毒呈活动状态[5]。本法采用的单克隆抗体系抗早期蛋白抗原抗体，本文所获结果提示，对于培养生长缓慢的HCMV，将本法与病毒分离培养相结合，可以快速、敏感地诊断HCMV感染。采用本法检测先天性畸形胎儿肾组织HCMV感染，其敏感性也显著高于免疫组化法，并表现精确的组织定位，表明本法扩增放大组织上的HCMV抗原-抗体反应信号是完全可行的，可用于诊断活动性HCMV感染。
本法采用pBV220 质粒DNA片段作为指示元件DNA，它是与人基因组无关的DNA片段，与HCMV DNA序列也无同源性。在检测中平行设置的阴性对照(正常人胚肺成纤维细胞、不加抗HCMV单抗)，无阳性信号出现。同时我们用本法检测了收集到的 10 例因吸入窒息或其它原因无畸形死婴肾组织标本，也呈阴性染色。显示本法有较强特异性。
, http://www.100md.com
本研究成功地将原位免疫PCR技术应用于HCMV感染诊断，显著提高了HCMV感染诊断敏感性。我们相信，经过适当改进，原位免疫PCR技术也可用于多种病毒感染诊断，增强其敏感性。
基金项目：国家计划生育委员会科研基金资助项目(1996-15)
作者简介：郝好杰(1966-)，男，河南省新乡市人，1993年军医进修学院夜大学毕业，解放军总医院基础医学研究所分子生物学研究室实验师；发表论文10篇。电话：(010)66937516；
E-mail:hhjie@public.bta.net.cn
[参考文献]
[1] Sano T, Smith CL, Cantor CR, et al. Immuno-PCR:Very sensitive antigen detection by means of specific antibody-DNA conjugates [J].Science, 1992,258(2):120-122.
, http://www.100md.com
[2] 张 波，董 荷，陆哲明,等.提高免疫组织化学敏感性的原位免疫聚合酶链反应技术[J].中华病理学杂志，1995,24(3):182-183.
[3] 宋海静，谷志远，卢彦平.原位PCR技术检测石蜡包埋脑组织中人巨细胞病毒DNA [J].中华微生物学和免疫学杂志，1997，17(6)：475-477.
[4] 董永绥.继续深入进行巨细胞病毒感染的研究[J].中华儿科杂志，1995，33(1)：3-4.
[5] Gaeta A, Nazzari C, Angeletti S, et al. Monitoring for cytomegalovirus infection in organ transplant recipients: analysis of pp65 antigen, DNA and late mRNA in peripheral blood leukocyles
收稿日期：1999-12-22； 修回日期：2000-01-17, 百拇医药