豚鼠去大脑僵直后畸变产物耳声发射变化的实验观察
作者：王洪田 钟乃川
单位：王洪田(解放军总医院耳鼻咽喉科，北京 100853)；钟乃川(同济医科大学附属协和医院耳鼻咽喉科，武汉 430022)
关键词：豚鼠；听皮层；外毛细胞；畸变产物耳声发射；内侧橄榄耳蜗系统
军医进修学院学报000312 [摘要]目的：进一步确定皮层高级中枢是否对耳蜗主动微机制有调控作用。方法：观察 17 只豚鼠在去大脑僵直前、后的畸变产物耳声发射(DPOAEs)变化情况。结果：在避免体温和颅温下降、缺氧等情况下，豚鼠去大脑僵直后 2 min、 5 min、 10 min 的DPOAEs幅值显著下降， 30 min 开始逐渐恢复， 60 min 基本恢复到术前水平。结论：结果提示大脑皮层高级中枢对耳蜗主动微机制有下行调控作用。文中对可能的机制进行了讨论。
中图号：R764 文献标识码：A
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文章编号：1005-1139(2000)03-0196-03
DPOAEs amplitude decline after decerebration in guinea pigs
WANG Hong-tian, ZHONG Nai-chuan
(Institute of Otolaryngology, PLA General Hospital, Beijing 100853, China)
Objective:To further prove whether auditory cortex topdown efferent exists and observe its effect on outer hair cells (OHCs). Methods:Distortion product otoacoustic emissions (DPOAEs) were measured before and after decerebration in 17 guinea pigs. Results:DPOAEs amplitude decreased significantly and rapidly after decerebration and remained at the lowest levels for 2,5,10 min. DPOAEs gradually recovered to the previous levels with time delay. Conclusion:It was further demonstrated that auditory cortex efferent really exists and controls OHCs and DPOAEs via medial olivocochlear system (MOCS). The possible mechanism was discussed in the paper.
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Key words:guinea pig; auditory cortex; outer hair cells; distortion product otoacoustic emissions; medial olivocochlear system
耳蜗接受传出神经系统支配，传出神经系统分为两个亚系统：内侧橄榄耳蜗系统(MOCS)和外侧橄榄耳蜗系统(LOCS)。利用对侧声刺激对耳声发射的抑制作用可研究MOCS对外毛细胞的调控作用，这方面已经有较多文献[1,2]。然而，皮层高级中枢是否对耳蜗外毛细胞的主动运动机制存在影响或调控作用？这一直是耳科学最前沿课题之一。在人类进行的选择注意实验已经证实[3~5]，选择注意任务使耳声发射幅值下降。表明选择注意所致的皮层兴奋灶的转移可引起耳蜗功能的改变，即人类皮层高级中枢对耳蜗外毛细胞功能有下行影响或控制。为进一步验证这种皮层高级中枢的调控作用，我们观察了豚鼠去大脑僵直后畸变产物耳声发射(distortion product otoacoustic emissions, DPOAEs)的变化情况。
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1 材料和方法
1.1 动物 选择耳廓反射灵敏的成年健康杂色豚鼠 17 只，体重 300～500 g，雌雄不拘。用 2% 戊巴比妥钠 40 mg/kg 腹腔注射麻醉，测试听性脑干反应(ABR)阈值，结果均在本室正常范围内。将动物固定于试验台上，剪除耳屏，暴露外耳道并清除耵聍。将动物随机分为两组。
1.1.1 开颅组 豚鼠 4 只 8 耳，单纯开颅而不作上下叠体切断，动物不发生僵直。按文献[6]报告的方式开颅：置豚鼠于腹位固定，从眉间至枕骨粗隆正中线切开皮肤，钝性分离颅顶骨膜。先在一侧颅骨开一小骨窗。为避免损伤脑组织，尽可能调节骨钻深度与颅骨厚度大致相当。用咬骨钳扩大创口，明胶海绵止血。待一侧大脑半球完全暴露后，同法暴露另一侧。
1.1.2 去大脑僵直组 豚鼠 13 只 21 耳，因外耳道血液流入或耵聍栓塞剔除 5 耳。按相同方法开颅后，纵向剪开硬脑暴露大脑皮层，向前翻开两侧枕叶，在四叠体的上下丘之间完全切断脑干与大脑间的联系。置豚鼠于侧卧，其躯干和四肢即刻变僵伸直，前肢僵直比后肢明显。为避免因缺氧、体温和脑温下降而影响DPOAEs，对以上两组动物均采取如下保护措施： 40 ℃ 热水袋保温，肛表监测体温，持续低流量吸氧，开颅后于大脑皮层表面滴 37 ℃ 液体石蜡以保持颅温。
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1.2 测试方法 用ILO92 耳动态分析仪测试 DPOAEs图(DP-gram)，测试在隔音室内进行。用本室已建立的方法固定动物[7]置豚鼠于侧卧位固定，将小儿探头置于外耳道内，并用自制可调外固定架固定探头使之与外耳道口耦合良好。作探头位置试验(checkfit)，当刺激信号平稳后开始测试。初始音f2/f1 频比关系为 1.22。初始音强度为L1＝60 dBSPL, L2=55 dBSPL。测试率为每倍频程 2 点，叠加 48 次以上，以 2f1-f2 反应幅值高出本底噪声 3 dB 作为DPOAEs出现的判定标准。分别于开颅前、开颅后和去大脑僵直前、去大脑僵直后测试 2 min、 5 min、10 min、 30 min 和 60 min 的DPOAEs幅值。将实验数据输入计算机用SAS统计软件包进行统计分析(ANOVA，即方差分析)。
2 结 果
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2.1 开颅组 开颅前豚鼠的DPOAEs幅值大而稳定，各频率点的出现率均为 100%。开颅后DPOAEs幅值与开颅前基本相同，出现率亦为 100%。经统计分析，开颅前与开颅后各个时间测试的DPOAEs幅值差异无统计学意义(P>0.05)，见图 1。
图1 开颅前后DPOAEs幅值变化
2.2 去大脑僵直组 在僵直后 2 min 即可见DPOAEs幅值下降，且见于各个频率处。于 5 min、 10 min 时DPOAEs保持低水平， 30 min 和 60 min 时DPOAEs逐渐恢复至开颅前水平。对不同时间测试结果的统计分析显示，以 2 min、 5 min、 10 min 的DPOAEs幅值与僵直前相比明显下降(P<0.05)。而到 60 min 时，其幅值回升，与僵直前比较差异无显著性意义(P>0.05)，见图 2。
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图2 去大脑僵直后DPOAEs幅值变化 (*P<0.05)
3 讨 论
目前知道，耳蜗存在两种反馈机制：一是外毛细胞的正反馈机制，它使基底膜运动增加、耳蜗灵敏度和频率选择特性升高；另一为耳蜗传出神经-橄榄耳蜗系统的负反馈调节机制，它的内侧部分-MOCS对外毛细胞的正反馈机制进行负反馈调节。外毛细胞→内毛细胞→感受声信号→听神经传入→耳蜗核→上传到上橄榄复合体→经MOCS传出→外毛细胞。这是一个完整的反馈环路，它构成了耳蜗微机制的基础。正常情况 下，上述的正负反馈处于动态平衡。现在，我们对MOCS通路、功能、递质、受体已经有较多的研究和了解，而对皮层高级中枢对耳蜗的调控情况却知之甚少。
皮层到耳蜗的下行纤维的起源及通路至今仍不甚清楚。文献报告[8]，下行纤维可能起源于听皮层并与上行传入纤维伴行，直接下行到达上橄榄复合体或经内侧膝状体、下丘到上橄榄复合体，然后经MOCS到耳蜗。由于MOCS的绝大部分神经纤维在第四脑室底交叉到对侧，故皮层经MOCS对耳蜗的调控作用也主要是对侧的。我们推测，豚鼠DPOAEs在去大脑前后的变化可能与去大脑僵直的发生机制[6]相似：正常情况下，MOCS保持一定的紧张性，皮层发出的下行纤维对MOCS有易化和抑制作用，抑制作用占优势，使MOCS保持适度的紧张性。当在上下丘之间完全切断脑干与大脑的联系，下行纤维中断，皮层对MOCS的易化作用占优势，耳蜗正负反馈的平衡状态被打破，MOCS失去中枢抑制，紧张性升高，对耳蜗外毛细胞的抑制增加，表现为DPOAEs幅值下降。随时间延长，耳蜗正负反馈又重新达到平衡状态，MOCS紧张性逐渐恢复，DPOAEs幅值回到原来水平。本实验观察到在完全切断后 2 min DPOAEs幅值即开始下降，之后逐渐恢复到开颅前水平。实验中曾观察1例豚鼠去大脑僵直后 180 min，其DPOAEs幅值再未见明显波动，表明MOCS功能已恢复紧张性。这可能说明，上橄榄复合体是调控耳蜗微机制的主要中枢，皮层高级中枢通过MOCS而对耳蜗微机制进行调控。
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Froehlich[8]报告在生理睡眠的各个时相，瞬态耳声发射幅值均增加，最大可达 4 dB，而且对侧抑制效应减小或消失。认为这是由于睡眠时耳蜗外毛细胞去中枢抑制，高级中枢和MOCS的功能暂时“休息”的缘故。以往研究证实，强烈的选择注意任务能够使耳声发射下降[3~5]。受试者在进行选择注意实验时，新奇(novel)任务的出现强烈吸引其注意力，注意力发生转移[5]，听觉皮层中枢发放的神经冲动暂时减弱，MOCS紧张性失去中枢调控，之后的过程类似于去大脑僵直后的结果。本研究进一步表明皮层对耳蜗的调控作用是存在的，其机制与可能皮层对脊髓前角运动神经元的调控类似。但需要进一步对起至点、下行径路、递质、受体、功能等进行研究。
作者简介：王洪田(1964-)，男，山东省阳信县人，1998年同济医科大学博士毕业，现在解放军总医院耳鼻咽喉科研究所，博士后，导师姜泗长院士；发表论文22篇。电话：(010)66936752
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[参考文献]
[1] 郑杰夫，姜泗长，顾 瑞,等.内侧橄榄耳蜗系统功能障碍及其听力学检查[J].中华耳鼻咽喉科杂志，1996，31：78-81.
[2] Berlin CI, Hood LJ, Wen H, et al. Contralateral suppression of non-linear click-evoked otoacoustic emissions [J]. Hear Res, 1993,71:1-11.
[3] 王洪田，钟乃川.选择注意对畸变产物耳声发射影响研究[J].临床耳鼻咽喉科学杂志，1997，11：543-545.
[4] Puel JL, Bonfils P, Pujol R. Selective attention modifies the active micromechanical properties of the cochlea Froehlich P, Collet L, Chanal JM. Variability of the influence of a visual task on the active micromechanical properties of the cochlear[J]. Brain Res, 1990,508:286-288.
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[6] 陈其才，严定友，吴政星.生理学实验[M].北京：科学出版社，1995.41-43.
[7] 梁 勇，钟乃川.豚鼠畸变产物耳声发射潜伏期测试中时间、波数和相位的关系[J].生物物理学报，1998，14(2)：262-265.
[8] Froehlich P, Collet L, Vallatx JL, et al. Sleep and cochlear active micromechanical properties in human subjects [J]. Hear Res, 1993,66:1-7.
收稿日期：1999-11-13； 修回日期：1999-12-19, 百拇医药
单位：王洪田(解放军总医院耳鼻咽喉科，北京 100853)；钟乃川(同济医科大学附属协和医院耳鼻咽喉科，武汉 430022)
关键词：豚鼠；听皮层；外毛细胞；畸变产物耳声发射；内侧橄榄耳蜗系统
军医进修学院学报000312 [摘要]目的：进一步确定皮层高级中枢是否对耳蜗主动微机制有调控作用。方法：观察 17 只豚鼠在去大脑僵直前、后的畸变产物耳声发射(DPOAEs)变化情况。结果：在避免体温和颅温下降、缺氧等情况下，豚鼠去大脑僵直后 2 min、 5 min、 10 min 的DPOAEs幅值显著下降， 30 min 开始逐渐恢复， 60 min 基本恢复到术前水平。结论：结果提示大脑皮层高级中枢对耳蜗主动微机制有下行调控作用。文中对可能的机制进行了讨论。
中图号：R764 文献标识码：A
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文章编号：1005-1139(2000)03-0196-03
DPOAEs amplitude decline after decerebration in guinea pigs
WANG Hong-tian, ZHONG Nai-chuan
(Institute of Otolaryngology, PLA General Hospital, Beijing 100853, China)
Objective:To further prove whether auditory cortex topdown efferent exists and observe its effect on outer hair cells (OHCs). Methods:Distortion product otoacoustic emissions (DPOAEs) were measured before and after decerebration in 17 guinea pigs. Results:DPOAEs amplitude decreased significantly and rapidly after decerebration and remained at the lowest levels for 2,5,10 min. DPOAEs gradually recovered to the previous levels with time delay. Conclusion:It was further demonstrated that auditory cortex efferent really exists and controls OHCs and DPOAEs via medial olivocochlear system (MOCS). The possible mechanism was discussed in the paper.
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Key words:guinea pig; auditory cortex; outer hair cells; distortion product otoacoustic emissions; medial olivocochlear system
耳蜗接受传出神经系统支配，传出神经系统分为两个亚系统：内侧橄榄耳蜗系统(MOCS)和外侧橄榄耳蜗系统(LOCS)。利用对侧声刺激对耳声发射的抑制作用可研究MOCS对外毛细胞的调控作用，这方面已经有较多文献[1,2]。然而，皮层高级中枢是否对耳蜗外毛细胞的主动运动机制存在影响或调控作用？这一直是耳科学最前沿课题之一。在人类进行的选择注意实验已经证实[3~5]，选择注意任务使耳声发射幅值下降。表明选择注意所致的皮层兴奋灶的转移可引起耳蜗功能的改变，即人类皮层高级中枢对耳蜗外毛细胞功能有下行影响或控制。为进一步验证这种皮层高级中枢的调控作用，我们观察了豚鼠去大脑僵直后畸变产物耳声发射(distortion product otoacoustic emissions, DPOAEs)的变化情况。
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1 材料和方法
1.1 动物 选择耳廓反射灵敏的成年健康杂色豚鼠 17 只，体重 300～500 g，雌雄不拘。用 2% 戊巴比妥钠 40 mg/kg 腹腔注射麻醉，测试听性脑干反应(ABR)阈值，结果均在本室正常范围内。将动物固定于试验台上，剪除耳屏，暴露外耳道并清除耵聍。将动物随机分为两组。
1.1.1 开颅组 豚鼠 4 只 8 耳，单纯开颅而不作上下叠体切断，动物不发生僵直。按文献[6]报告的方式开颅：置豚鼠于腹位固定，从眉间至枕骨粗隆正中线切开皮肤，钝性分离颅顶骨膜。先在一侧颅骨开一小骨窗。为避免损伤脑组织，尽可能调节骨钻深度与颅骨厚度大致相当。用咬骨钳扩大创口，明胶海绵止血。待一侧大脑半球完全暴露后，同法暴露另一侧。
1.1.2 去大脑僵直组 豚鼠 13 只 21 耳，因外耳道血液流入或耵聍栓塞剔除 5 耳。按相同方法开颅后，纵向剪开硬脑暴露大脑皮层，向前翻开两侧枕叶，在四叠体的上下丘之间完全切断脑干与大脑间的联系。置豚鼠于侧卧，其躯干和四肢即刻变僵伸直，前肢僵直比后肢明显。为避免因缺氧、体温和脑温下降而影响DPOAEs，对以上两组动物均采取如下保护措施： 40 ℃ 热水袋保温，肛表监测体温，持续低流量吸氧，开颅后于大脑皮层表面滴 37 ℃ 液体石蜡以保持颅温。
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1.2 测试方法 用ILO92 耳动态分析仪测试 DPOAEs图(DP-gram)，测试在隔音室内进行。用本室已建立的方法固定动物[7]置豚鼠于侧卧位固定，将小儿探头置于外耳道内，并用自制可调外固定架固定探头使之与外耳道口耦合良好。作探头位置试验(checkfit)，当刺激信号平稳后开始测试。初始音f2/f1 频比关系为 1.22。初始音强度为L1＝60 dBSPL, L2=55 dBSPL。测试率为每倍频程 2 点，叠加 48 次以上，以 2f1-f2 反应幅值高出本底噪声 3 dB 作为DPOAEs出现的判定标准。分别于开颅前、开颅后和去大脑僵直前、去大脑僵直后测试 2 min、 5 min、10 min、 30 min 和 60 min 的DPOAEs幅值。将实验数据输入计算机用SAS统计软件包进行统计分析(ANOVA，即方差分析)。
2 结 果
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2.1 开颅组 开颅前豚鼠的DPOAEs幅值大而稳定，各频率点的出现率均为 100%。开颅后DPOAEs幅值与开颅前基本相同，出现率亦为 100%。经统计分析，开颅前与开颅后各个时间测试的DPOAEs幅值差异无统计学意义(P>0.05)，见图 1。
图1 开颅前后DPOAEs幅值变化
2.2 去大脑僵直组 在僵直后 2 min 即可见DPOAEs幅值下降，且见于各个频率处。于 5 min、 10 min 时DPOAEs保持低水平， 30 min 和 60 min 时DPOAEs逐渐恢复至开颅前水平。对不同时间测试结果的统计分析显示，以 2 min、 5 min、 10 min 的DPOAEs幅值与僵直前相比明显下降(P<0.05)。而到 60 min 时，其幅值回升，与僵直前比较差异无显著性意义(P>0.05)，见图 2。
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图2 去大脑僵直后DPOAEs幅值变化 (*P<0.05)
3 讨 论
目前知道，耳蜗存在两种反馈机制：一是外毛细胞的正反馈机制，它使基底膜运动增加、耳蜗灵敏度和频率选择特性升高；另一为耳蜗传出神经-橄榄耳蜗系统的负反馈调节机制，它的内侧部分-MOCS对外毛细胞的正反馈机制进行负反馈调节。外毛细胞→内毛细胞→感受声信号→听神经传入→耳蜗核→上传到上橄榄复合体→经MOCS传出→外毛细胞。这是一个完整的反馈环路，它构成了耳蜗微机制的基础。正常情况 下，上述的正负反馈处于动态平衡。现在，我们对MOCS通路、功能、递质、受体已经有较多的研究和了解，而对皮层高级中枢对耳蜗的调控情况却知之甚少。
皮层到耳蜗的下行纤维的起源及通路至今仍不甚清楚。文献报告[8]，下行纤维可能起源于听皮层并与上行传入纤维伴行，直接下行到达上橄榄复合体或经内侧膝状体、下丘到上橄榄复合体，然后经MOCS到耳蜗。由于MOCS的绝大部分神经纤维在第四脑室底交叉到对侧，故皮层经MOCS对耳蜗的调控作用也主要是对侧的。我们推测，豚鼠DPOAEs在去大脑前后的变化可能与去大脑僵直的发生机制[6]相似：正常情况下，MOCS保持一定的紧张性，皮层发出的下行纤维对MOCS有易化和抑制作用，抑制作用占优势，使MOCS保持适度的紧张性。当在上下丘之间完全切断脑干与大脑的联系，下行纤维中断，皮层对MOCS的易化作用占优势，耳蜗正负反馈的平衡状态被打破，MOCS失去中枢抑制，紧张性升高，对耳蜗外毛细胞的抑制增加，表现为DPOAEs幅值下降。随时间延长，耳蜗正负反馈又重新达到平衡状态，MOCS紧张性逐渐恢复，DPOAEs幅值回到原来水平。本实验观察到在完全切断后 2 min DPOAEs幅值即开始下降，之后逐渐恢复到开颅前水平。实验中曾观察1例豚鼠去大脑僵直后 180 min，其DPOAEs幅值再未见明显波动，表明MOCS功能已恢复紧张性。这可能说明，上橄榄复合体是调控耳蜗微机制的主要中枢，皮层高级中枢通过MOCS而对耳蜗微机制进行调控。
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Froehlich[8]报告在生理睡眠的各个时相，瞬态耳声发射幅值均增加，最大可达 4 dB，而且对侧抑制效应减小或消失。认为这是由于睡眠时耳蜗外毛细胞去中枢抑制，高级中枢和MOCS的功能暂时“休息”的缘故。以往研究证实，强烈的选择注意任务能够使耳声发射下降[3~5]。受试者在进行选择注意实验时，新奇(novel)任务的出现强烈吸引其注意力，注意力发生转移[5]，听觉皮层中枢发放的神经冲动暂时减弱，MOCS紧张性失去中枢调控，之后的过程类似于去大脑僵直后的结果。本研究进一步表明皮层对耳蜗的调控作用是存在的，其机制与可能皮层对脊髓前角运动神经元的调控类似。但需要进一步对起至点、下行径路、递质、受体、功能等进行研究。
作者简介：王洪田(1964-)，男，山东省阳信县人，1998年同济医科大学博士毕业，现在解放军总医院耳鼻咽喉科研究所，博士后，导师姜泗长院士；发表论文22篇。电话：(010)66936752
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[参考文献]
[1] 郑杰夫，姜泗长，顾 瑞,等.内侧橄榄耳蜗系统功能障碍及其听力学检查[J].中华耳鼻咽喉科杂志，1996，31：78-81.
[2] Berlin CI, Hood LJ, Wen H, et al. Contralateral suppression of non-linear click-evoked otoacoustic emissions [J]. Hear Res, 1993,71:1-11.
[3] 王洪田，钟乃川.选择注意对畸变产物耳声发射影响研究[J].临床耳鼻咽喉科学杂志，1997，11：543-545.
[4] Puel JL, Bonfils P, Pujol R. Selective attention modifies the active micromechanical properties of the cochlea Froehlich P, Collet L, Chanal JM. Variability of the influence of a visual task on the active micromechanical properties of the cochlear[J]. Brain Res, 1990,508:286-288.
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[6] 陈其才，严定友，吴政星.生理学实验[M].北京：科学出版社，1995.41-43.
[7] 梁 勇，钟乃川.豚鼠畸变产物耳声发射潜伏期测试中时间、波数和相位的关系[J].生物物理学报，1998，14(2)：262-265.
[8] Froehlich P, Collet L, Vallatx JL, et al. Sleep and cochlear active micromechanical properties in human subjects [J]. Hear Res, 1993,66:1-7.
收稿日期：1999-11-13； 修回日期：1999-12-19, 百拇医药