喉上皮性肿瘤与人乳头状瘤病毒的关系
作者：林昶 姜泗长 杨伟炎 韩东一 易自翔
单位：林昶(福建医科大学附属第一医院耳鼻咽喉科，350005)；姜泗长(解放军总医院耳鼻咽喉科)；杨伟炎(解放军总医院耳鼻咽喉科)；韩东一(解放军总医院耳鼻咽喉科)；易自翔(福建医科大学附属第一医院耳鼻咽喉科，350005)
关键词：喉肿瘤；喉上皮增生性病变；乳头状瘤病毒，人；聚合酶链反应
山东医大基础医学院学报000301 摘要 目的:研究HPV与喉上皮性肿瘤的关系。方法:采用一对HPVL1区通用引物及6、11、16、18型特异E6区引物多聚酶链反应,对128例喉癌及喉上皮增生性病变样本进行HPV检测。结果:24例检出HPV,16例为HPV6型,4例HPV11型,1例HPV18型,2例未定型。60例喉癌中5例阳性,其中3例6、11型均为整合状态,另2例为未定型。结论:大部分喉癌和上皮增生性病变与HPV感染无关;良性型HPV可整合于宿主细胞核;对少数HPV阳性患者,除采用手术、化疗及放疗外,还需抗病毒治疗。
, http://www.100md.com
中图分类号 R 739.65 文献标识码:A
文章编号:1008-8202(2000)03-0129-04
Relationship between laryngeal neoplasm and human papilloma virus
Lin Chang
(Dept.of Otorhinolaryngology,the First Affiliated Hospital of Fujian Medical University,350005)
Jiang Sichang
(The General Hospital of PLA,China)
, 百拇医药
Yang Weiyan
(The General Hospital of PLA,China)
Abstract Objective:To investigate the relationship between the laryngeal neoplasm and human papilloma virus(HPV).Methods:The 128 cases with formalin fixed paraffin-imbedded,of laryngeal squamous cell carcinoma(LSCC) and laryngeal epithelium hyperplastic lesion(LEHL) were detected for HPV infection by PCR with HPV consensus L1 primer and 6,11,16,18 type specific E6 primers.Results:The presence of HPV DNA was detected only in 5 of 60 LSCC,11 of 15 laryngeal papillomas,4 of 10 dysplasia and 1 of 10 keratosis .None HPV was detected in 15 laryngeal polyps and 9 adjacent chronic laryngitis. Most of HPV found were benign types,except that one keratosis was HPV18.Conclusions:This study suggests that most of LSCC and LEHL are not associate d with HPV infection.Benign HPV types also integrate with host cell genes in malignant lesions.Besides surgery,chemotherapy and radiation therapy,antiviral therapy should be accepted in a few HPV positive patients.
, 百拇医药
Key words Laryngeal neoplasms;Laryngeal epithelium hyperplastic lesion;Papilloma viruses,human;Polymerase chain reaction
喉癌占全身癌肿的1.2%～1.6%,每年死亡率为4～10/10 000,几乎所有喉癌都是鳞 状上皮癌,通常发病高峰在55～65岁年龄段。喉癌发病有明显的地域性,尽管已 进行了广泛的研究,其病因仍未定论,嗜酒、吸烟,特别是二者结合是最常提到的危险因素。 1982年Syjanan[1]提出人乳头状瘤病毒(HPV)感染与喉癌发病有关,此后,从免疫组 化、DNA杂交、扩增等方面进行的研究都获得证据支持该观点,但由于在不同人群中采用不同 方法,因而得出 的结论也不尽相同。
喉上皮增生性病变(LEHL)代表一系列喉的形态学 变化,其特征是上皮增生,伴程度不等的结构及细胞异常,但基底膜完整。发病机理也有争议, 嗜酒,吸烟,声带滥用,维生素缺乏,上呼吸道阻塞,慢性或重复性病毒感染,激素失调被 认为是可能的危险因素。
, 百拇医药
为了进一步评估HPV在喉癌及喉上皮增生性病变发生中所起 的作用,我们采用一对L1区通用引物及6、11、16、18型特异E6区引物多 聚酶链反应以求准确检出HPV感染情况及病毒基因存在状况。
1 资料与方法
1.1 临床资料 1995年1月至1996年6月在301医院病理确诊的114例喉良恶性病 变存档蜡块,其中喉鳞癌60例(男47例,女13例,平均59.9岁),喉原位癌10例,喉乳头状瘤15 例,喉不典型增生10例,喉角化症9例,喉息肉15例,癌旁慢性炎症组织9例,阳性对照用HPV6、1 1、16、18阳性的尖锐湿疣及宫颈癌标本。
1.2 方法 模板DNA提取:切取4～6片(片厚5μm)置于 Eppendorf管中,加400μl二甲苯10min脱蜡2次,无水乙醇除去二甲苯,真空干燥, 加入100μl蛋白酶K消化液(10μg/ml ProteinaseK,50mmol/LTris,lmmol/L EDTA),37℃孵育 过夜,饱和酚氯仿抽提,酒精沉淀,TE溶解备用。
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多聚酶链反应:应用通用引物及特异性引物分别扩增大部分嗜粘膜型HPV L1及6、11 、16、18 型的E6区。每个标本均进行4组PCR反应:(1)用人β-Actin引物估计标本DNA含量是否适合 扩增;(2)用HPV6和HPV11E6区的混合引物;(3)用HPV16 和HPV18E6区的混合引物;(4)用HPV L1区通用引物。反应体系:10μl模板DNA,20 0μmol/L dNTPs,3μl 10×缓冲液,0.2μmol/L每对引物,1UTaqDNA聚合酶,加三蒸水至30μ l。在Gene Amp PCR system 2400机上进行，采用热启动方法。反应条件：β-Actin:94℃1 min,60℃1min,72℃1min,共30个循环；L1及E6：94℃1min，45℃1min,72℃1min,共40个 循环，最后72℃延伸7min。阴性对照：采用三蒸水代替模板DNA。
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扩增产物分析：取扩增产物10μl在1.5%琼脂糖凝胶上(含0.5μg/ml溴化乙啶)80mV电泳30 min，在短波紫外灯下观察。用pBR322/hinf1作为标准DNA分子量对照，见表1。
表1 PCR扩增引物序列及扩 增长度 类 型
核苷酸序列
扩增长度(BP)
β-Actin
HPV 6
HPV 11
HPV 16
HPV 18
HPV L1
, 百拇医药
A TCACCATTGGCAATGAGCG
TTGAAGGTAGTTTCGTGGAT
CACCTAAAGGTCCTGTTTCG
CGGTTTGTGACACAG GTAGC
GTTGCTTAGAACTGCAAGGG
CGGCTTGTGACACAGGTAAC
ACAGTTACTGCGACGTGAGG
TTTGTTC AGGACACAGTGGC
TATACCGCATGCTGCATGCC
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ACGGTTTCTGGCACCGCAGG
TTTGTTACTGTGGTAGATAC
GAAAAATAAACTGTAAATCA
98
183
134
239
157
139～1 50
2 结 果
作为内源性对照的β-Actin引物扩 增显示128例样本中114例阳性(图1),HPVL1及E6区引物扩增显示,128例中24例检出HPV DNA(表2),16例HPV6,4例HPV11,1例HPV18,2例未定型HPV(图2～4)。5例喉 鳞癌阳性,其中2例HPV6,1例HPV11,2例未定型;10例乳头状瘤中9例为HPV6,1例HPV11;4例 阳性不典型增生均为HPV6,1例角化症检出HPV18。息肉及癌旁组织未检 出HPV。1例β-Actin扩增阴性的喉癌检出HPV。
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图1 β-Actin扩增结果
1.pBR322/hinf1,2.阳性对照,3、5、6、7阳性标本 ,4.阴性标本,8.阴性对照
图2 HPV6和HPV11E6区的混合引物扩增结果
1.pBR322/hinf1,2 .HPV6阳性对照,3.HPV11阳性对照,4.HPV6+HPV11阳性对照,5.HPV6 阳性,6.HPV11阳性标本,7.阴性标本,8.阴性对照
图3 HPV16和HPV18E6区的混合引物扩增结果
, 百拇医药 1 .pBR322/hinf1,2.HPV16阳性对照,3.HPV18阳性对照,4.HPV16+HPV 18阳性对照,5.HPV18阳性标本,6.阴性标本,7.阴性对照
图4 HPV L1区通用引物扩增结果
1.pBR322/hinf1,2.阳性对照,3、5、7.阳性标本,4、6.阴性标本,8.阴性对照
表2 组织学类型与HPV PCR结果 组 织学类型
n
(HPV E6)/(6 11 16 18)
HPV L 1
, 百拇医药
β-Actin
鳞癌
原位 癌
乳头状瘤
角化症
不典型增生
息肉
癌旁组织
总计
60
10
15
9
, 百拇医药
10
15
9
128
2
0
10
0
4
0
0
16
1
2
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1
0
0
0
0
4
0
0
0
0
0
0
0
0
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0
0
0
1
0
0
0
1
2
1
11
1
3
, 百拇医药
0
0
18
53
9
14
9
9
12
8
114
L1阳性而HPV6、11、16、18E6阴性
, 百拇医药
3 讨 论
人乳头状瘤病毒是一类严格嗜上皮性DNA双链病毒,目前已发现有90 余种亚型。一些病毒亚型与癌症有关,因而被称为高危型,常见为HPV16、18型。与良性病变 有关的则为低危型,常见为HPV6、11型。各亚型间致病力不同与其DNA的开放读码框架(ORF) 不同有关[2]。病毒 E6/E7蛋白,特别是来源于16、18型,可激活细胞因子E、A,促使细胞增殖;并且干扰肿瘤 抑制蛋白P53及Rb的功能,后者的相互作用是HPV导致宿主细胞基因突变及核异常的原因。
在过去的10余年中,应用各种分子生物学方法在许多器官的鳞癌中检出HPV D NA,但明确将它作为重要病因的只有宫颈癌,经过大量的实验及临床研究二者的关系得到证实 。但对喉鳞癌而言,HPV感染及其作为可能的致癌因子尚有争议。用PCR方法在喉鳞癌中HPV D NA检出率为3.3%～85%,由于这些研究是在不同人群中用了不同方法,所 以得出的结果也不同。为了评估HPV在喉癌发病中的作用,有必要采用最合适的方法进行HPV 检测及分类。但由于HPV各亚型间核酸序列不同,阻碍了建立一个简单而广泛的PCR方法检测 所有HPV亚型。用一对引物进行PCR检测可能导致假阴性,因为HPV L1、E1基因,通常作为 通用引物扩增区,可能在病毒整合中丢失;而E6、E7基因,虽然是最常保留的区域,但各型 间差异较大,不宜采用一通用引物检测所有亚型[3]。我们用一对能检测大部分 嗜粘膜型HPV的L1通用引物及常见HPV E6区型特异引物,试图最大限度检出HPV分型,并且 观察可能发生的由于病毒整合中L1区的丢失。在实验中,采用一次性耗材以减少假阳性,并 采用β-Actin作内 参照以排除标本因质量问题所引起的假阴性。但本研究结果表明,60例喉鳞癌仅5例检出HPV, 未检出高危型16、18,只在1例角化症检出高危型18,表明HPV在喉癌发病中不起主要作用。
, 百拇医药
近来,低危型HPV与癌症的关系也受到了重视,HPV6、11型虽然被认为是非致癌性的,但在 恶性肿瘤中也发现有;Linderberg等[4]认为,HPV11与成人及儿童的喉乳头状瘤复发 及恶变有关,Anna[5]在3例恶变的喉乳头瘤中检出HPV6、11、16,他们认为,HPV11、 16与侵袭性病变有关。Bercovich等[6]在1例口腔癌中检出HPV6,并发现核病毒呈整 合状态,他们认为,HPV6的整合增加了致癌潜能,并打乱了正常细胞的增殖。Suzuki[7] 在2例复发喉乳头状瘤中检出HPV6a,并发现其基因组中L1区发生部分缺失,这2例均出现 增生 过度及类似癌症的病理改变。Rady[8]在1例复发的上呼吸道乳头状瘤并最终发 生肺癌患者的标本中检出HPV11,在良性病变中病毒基因组呈游离和整合状态;而在肺癌则呈 整合状态,同时有p53突变和IFNB-1丢失,他认为,p53突变与HPV11的整合有关,促进了基因的 不稳定性,使复发的乳头状瘤发展为癌症。我们对比通用L1型和特异E6区引物扩增的结 果,在喉癌中也发生良性型HPV DNA的整合而使L1区丢失,L1区编码的是具有强免疫原性 的病毒壳蛋白,因而,L1的丢失使病毒的壳蛋白产生减少,使病毒能躲避宿主的免疫作用。 这说明良性型HPV感染也可能通过整合和逃避宿主免疫而致喉癌。提示在临床上诊治喉癌时, 除了采取手术、化疗外,对部分患者还需进行抗病毒治疗。
, 百拇医药
大量研究表明,喉乳头状瘤与感染HPV6、11有 关。本研究结果也证实了这一点。但HPV与非乳头瘤LEHL的关系还有争议。Gallo[9] 对115例喉角化症患者进行了10年追踪观察,其中9例发展为癌症,但在所有病变中用原位 杂交均未检出HPV DNA,他认为HPV在喉癌发病中不起重要作用。Poljak[10]用PCR在 58例LEHL中仅检出1例不典型增生HPV6,他认为,其他致病机理在这些病变中起主要作用。Fou ret等[11]用E6区引物PCR在57例喉不典型增生及角化症中检出6例HPV16。我们在 34例非乳头瘤LEHL检出5例HPV,我们认为,大部分LEHL发病与HPV无关。
我们在1例β- Actin扩增阴性的喉癌中检出HPV6。Park[12]在宫颈癌的研究中也见到此现象,10 例β-globin阴性的宫颈癌3例检出HPV。可能人类基因组与病毒不同,前者易降解,内源性基 因扩增阴性并不能完全排除HPV阴性。
, 百拇医药
总之,为了明确HPV在LSCC及LEHL的作用,有必要 进行类似于宫颈癌的研究,即用标准扩增系统进行严格对照、多中心、大样 本的研究。这对临床上是否采用抗病毒治疗,以提高喉癌患者的生存率是有益的探讨。
作者简介：林昶(1967-)，男，福建人，。福建医科大学附属第一医院耳鼻咽喉科主治工程师，博士，主要从事中耳炎病理及喉肿瘤分子病毒学研究。
参考文献
1，Syrjanan K,Syrjanan S,Pyrhonen S.Human papillomavirus antigen in lesion of laryngeal squamous cell carcinomas[J].ORL,1982,44:332-344
2，Mcglennen RL,Ghai J,Ostrow RS,et al.Cellular transformation by a unique isolate of human papilloma virus 11[J].Cancer Res,1 992,52:5872-5878
, 百拇医药
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4，Linderberg H,Syrjanen S,Karja J,et al.Human papillomavirus type 11 DNA in squamous cell carcinomas and pre-existing multiple laryngeal papillomas[J].Acta Otolaryngol(Stockh),1989,109:141-149
5，Pou AM,Shoemarker DL,Jordan JA,et al.Adult respiratory papillomatosis:Human papillomavirus type and viral coinfections as predictors of prognosis[J].Ann Otol Rhinol Laryngol,1996,104:7 58- 762
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6，Bercovich JA,Centeno CR,Aguilar OG,et al.Presence and integration of human papillomavirus type 6 in a tonsillar carcinoma[J]. J Gen Virol ,1991,72:2569-2572
7，Suzuki T,Tomita Y,Nakano K,et al.Deletion in the L1 open reading frame of human papillomavirus type 6 agenomes associated with recurrent laryngeal papillomas[J].J Med Virol,1995,47:191-197
8，Rady PL,Schnadig VJ,Weiss RL,et al.Malignant transformation of recurrent respiratory papillomatosis associated with integrated human papillomavirus type 11 DNA and mutation of P53[J].Laryngoscope,1998,108:735-740
, 百拇医药
9，Gallo O,Bianchi S,Giannini A,et al.Lack of detection of human papillomavirus in tr ansformed laryngeal keratosis by in situ hybridization technique[J].Acta Otola ryngo l(Stockh),1994,114:213-217
10，Poljak M,Gale N,Kambic V.Human papillomaviruses:A study of their prevalence in the epithelial hyperplastic lesions of the larynx[J].Acta Otolaryngol(Stockh),1997(Suppl)，527:66-69
11，Fouret P,Dabit D,Sibony M,et al.Expression of P53 protein related to the presence of human papillomavirus infection in precancer lesions of the larynx[J].Am J Pathol,1995,146:599-604
12，Park JS,Namkoong SE,Lee HY.Detection of human papillomavirus genotypes in cervical neoplasm from Korean women using polymerase chain reaction[J].Gynecol Oncol,1991,41:129-134
(收稿日期 2000-01-03), 百拇医药
单位：林昶(福建医科大学附属第一医院耳鼻咽喉科，350005)；姜泗长(解放军总医院耳鼻咽喉科)；杨伟炎(解放军总医院耳鼻咽喉科)；韩东一(解放军总医院耳鼻咽喉科)；易自翔(福建医科大学附属第一医院耳鼻咽喉科，350005)
关键词：喉肿瘤；喉上皮增生性病变；乳头状瘤病毒，人；聚合酶链反应
山东医大基础医学院学报000301 摘要 目的:研究HPV与喉上皮性肿瘤的关系。方法:采用一对HPVL1区通用引物及6、11、16、18型特异E6区引物多聚酶链反应,对128例喉癌及喉上皮增生性病变样本进行HPV检测。结果:24例检出HPV,16例为HPV6型,4例HPV11型,1例HPV18型,2例未定型。60例喉癌中5例阳性,其中3例6、11型均为整合状态,另2例为未定型。结论:大部分喉癌和上皮增生性病变与HPV感染无关;良性型HPV可整合于宿主细胞核;对少数HPV阳性患者,除采用手术、化疗及放疗外,还需抗病毒治疗。
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中图分类号 R 739.65 文献标识码:A
文章编号:1008-8202(2000)03-0129-04
Relationship between laryngeal neoplasm and human papilloma virus
Lin Chang
(Dept.of Otorhinolaryngology,the First Affiliated Hospital of Fujian Medical University,350005)
Jiang Sichang
(The General Hospital of PLA,China)
, 百拇医药
Yang Weiyan
(The General Hospital of PLA,China)
Abstract Objective:To investigate the relationship between the laryngeal neoplasm and human papilloma virus(HPV).Methods:The 128 cases with formalin fixed paraffin-imbedded,of laryngeal squamous cell carcinoma(LSCC) and laryngeal epithelium hyperplastic lesion(LEHL) were detected for HPV infection by PCR with HPV consensus L1 primer and 6,11,16,18 type specific E6 primers.Results:The presence of HPV DNA was detected only in 5 of 60 LSCC,11 of 15 laryngeal papillomas,4 of 10 dysplasia and 1 of 10 keratosis .None HPV was detected in 15 laryngeal polyps and 9 adjacent chronic laryngitis. Most of HPV found were benign types,except that one keratosis was HPV18.Conclusions:This study suggests that most of LSCC and LEHL are not associate d with HPV infection.Benign HPV types also integrate with host cell genes in malignant lesions.Besides surgery,chemotherapy and radiation therapy,antiviral therapy should be accepted in a few HPV positive patients.
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Key words Laryngeal neoplasms;Laryngeal epithelium hyperplastic lesion;Papilloma viruses,human;Polymerase chain reaction
喉癌占全身癌肿的1.2%～1.6%,每年死亡率为4～10/10 000,几乎所有喉癌都是鳞 状上皮癌,通常发病高峰在55～65岁年龄段。喉癌发病有明显的地域性,尽管已 进行了广泛的研究,其病因仍未定论,嗜酒、吸烟,特别是二者结合是最常提到的危险因素。 1982年Syjanan[1]提出人乳头状瘤病毒(HPV)感染与喉癌发病有关,此后,从免疫组 化、DNA杂交、扩增等方面进行的研究都获得证据支持该观点,但由于在不同人群中采用不同 方法,因而得出 的结论也不尽相同。
喉上皮增生性病变(LEHL)代表一系列喉的形态学 变化,其特征是上皮增生,伴程度不等的结构及细胞异常,但基底膜完整。发病机理也有争议, 嗜酒,吸烟,声带滥用,维生素缺乏,上呼吸道阻塞,慢性或重复性病毒感染,激素失调被 认为是可能的危险因素。
, 百拇医药
为了进一步评估HPV在喉癌及喉上皮增生性病变发生中所起 的作用,我们采用一对L1区通用引物及6、11、16、18型特异E6区引物多 聚酶链反应以求准确检出HPV感染情况及病毒基因存在状况。
1 资料与方法
1.1 临床资料 1995年1月至1996年6月在301医院病理确诊的114例喉良恶性病 变存档蜡块,其中喉鳞癌60例(男47例,女13例,平均59.9岁),喉原位癌10例,喉乳头状瘤15 例,喉不典型增生10例,喉角化症9例,喉息肉15例,癌旁慢性炎症组织9例,阳性对照用HPV6、1 1、16、18阳性的尖锐湿疣及宫颈癌标本。
1.2 方法 模板DNA提取:切取4～6片(片厚5μm)置于 Eppendorf管中,加400μl二甲苯10min脱蜡2次,无水乙醇除去二甲苯,真空干燥, 加入100μl蛋白酶K消化液(10μg/ml ProteinaseK,50mmol/LTris,lmmol/L EDTA),37℃孵育 过夜,饱和酚氯仿抽提,酒精沉淀,TE溶解备用。
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多聚酶链反应:应用通用引物及特异性引物分别扩增大部分嗜粘膜型HPV L1及6、11 、16、18 型的E6区。每个标本均进行4组PCR反应:(1)用人β-Actin引物估计标本DNA含量是否适合 扩增;(2)用HPV6和HPV11E6区的混合引物;(3)用HPV16 和HPV18E6区的混合引物;(4)用HPV L1区通用引物。反应体系:10μl模板DNA,20 0μmol/L dNTPs,3μl 10×缓冲液,0.2μmol/L每对引物,1UTaqDNA聚合酶,加三蒸水至30μ l。在Gene Amp PCR system 2400机上进行，采用热启动方法。反应条件：β-Actin:94℃1 min,60℃1min,72℃1min,共30个循环；L1及E6：94℃1min，45℃1min,72℃1min,共40个 循环，最后72℃延伸7min。阴性对照：采用三蒸水代替模板DNA。
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扩增产物分析：取扩增产物10μl在1.5%琼脂糖凝胶上(含0.5μg/ml溴化乙啶)80mV电泳30 min，在短波紫外灯下观察。用pBR322/hinf1作为标准DNA分子量对照，见表1。
表1 PCR扩增引物序列及扩 增长度 类 型
核苷酸序列
扩增长度(BP)
β-Actin
HPV 6
HPV 11
HPV 16
HPV 18
HPV L1
, 百拇医药
A TCACCATTGGCAATGAGCG
TTGAAGGTAGTTTCGTGGAT
CACCTAAAGGTCCTGTTTCG
CGGTTTGTGACACAG GTAGC
GTTGCTTAGAACTGCAAGGG
CGGCTTGTGACACAGGTAAC
ACAGTTACTGCGACGTGAGG
TTTGTTC AGGACACAGTGGC
TATACCGCATGCTGCATGCC
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ACGGTTTCTGGCACCGCAGG
TTTGTTACTGTGGTAGATAC
GAAAAATAAACTGTAAATCA
98
183
134
239
157
139～1 50
2 结 果
作为内源性对照的β-Actin引物扩 增显示128例样本中114例阳性(图1),HPVL1及E6区引物扩增显示,128例中24例检出HPV DNA(表2),16例HPV6,4例HPV11,1例HPV18,2例未定型HPV(图2～4)。5例喉 鳞癌阳性,其中2例HPV6,1例HPV11,2例未定型;10例乳头状瘤中9例为HPV6,1例HPV11;4例 阳性不典型增生均为HPV6,1例角化症检出HPV18。息肉及癌旁组织未检 出HPV。1例β-Actin扩增阴性的喉癌检出HPV。
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图1 β-Actin扩增结果
1.pBR322/hinf1,2.阳性对照,3、5、6、7阳性标本 ,4.阴性标本,8.阴性对照
图2 HPV6和HPV11E6区的混合引物扩增结果
1.pBR322/hinf1,2 .HPV6阳性对照,3.HPV11阳性对照,4.HPV6+HPV11阳性对照,5.HPV6 阳性,6.HPV11阳性标本,7.阴性标本,8.阴性对照
图3 HPV16和HPV18E6区的混合引物扩增结果
, 百拇医药 1 .pBR322/hinf1,2.HPV16阳性对照,3.HPV18阳性对照,4.HPV16+HPV 18阳性对照,5.HPV18阳性标本,6.阴性标本,7.阴性对照
图4 HPV L1区通用引物扩增结果
1.pBR322/hinf1,2.阳性对照,3、5、7.阳性标本,4、6.阴性标本,8.阴性对照
表2 组织学类型与HPV PCR结果 组 织学类型
n
(HPV E6)/(6 11 16 18)
HPV L 1
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β-Actin
鳞癌
原位 癌
乳头状瘤
角化症
不典型增生
息肉
癌旁组织
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L1阳性而HPV6、11、16、18E6阴性
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3 讨 论
人乳头状瘤病毒是一类严格嗜上皮性DNA双链病毒,目前已发现有90 余种亚型。一些病毒亚型与癌症有关,因而被称为高危型,常见为HPV16、18型。与良性病变 有关的则为低危型,常见为HPV6、11型。各亚型间致病力不同与其DNA的开放读码框架(ORF) 不同有关[2]。病毒 E6/E7蛋白,特别是来源于16、18型,可激活细胞因子E、A,促使细胞增殖;并且干扰肿瘤 抑制蛋白P53及Rb的功能,后者的相互作用是HPV导致宿主细胞基因突变及核异常的原因。
在过去的10余年中,应用各种分子生物学方法在许多器官的鳞癌中检出HPV D NA,但明确将它作为重要病因的只有宫颈癌,经过大量的实验及临床研究二者的关系得到证实 。但对喉鳞癌而言,HPV感染及其作为可能的致癌因子尚有争议。用PCR方法在喉鳞癌中HPV D NA检出率为3.3%～85%,由于这些研究是在不同人群中用了不同方法,所 以得出的结果也不同。为了评估HPV在喉癌发病中的作用,有必要采用最合适的方法进行HPV 检测及分类。但由于HPV各亚型间核酸序列不同,阻碍了建立一个简单而广泛的PCR方法检测 所有HPV亚型。用一对引物进行PCR检测可能导致假阴性,因为HPV L1、E1基因,通常作为 通用引物扩增区,可能在病毒整合中丢失;而E6、E7基因,虽然是最常保留的区域,但各型 间差异较大,不宜采用一通用引物检测所有亚型[3]。我们用一对能检测大部分 嗜粘膜型HPV的L1通用引物及常见HPV E6区型特异引物,试图最大限度检出HPV分型,并且 观察可能发生的由于病毒整合中L1区的丢失。在实验中,采用一次性耗材以减少假阳性,并 采用β-Actin作内 参照以排除标本因质量问题所引起的假阴性。但本研究结果表明,60例喉鳞癌仅5例检出HPV, 未检出高危型16、18,只在1例角化症检出高危型18,表明HPV在喉癌发病中不起主要作用。
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近来,低危型HPV与癌症的关系也受到了重视,HPV6、11型虽然被认为是非致癌性的,但在 恶性肿瘤中也发现有;Linderberg等[4]认为,HPV11与成人及儿童的喉乳头状瘤复发 及恶变有关,Anna[5]在3例恶变的喉乳头瘤中检出HPV6、11、16,他们认为,HPV11、 16与侵袭性病变有关。Bercovich等[6]在1例口腔癌中检出HPV6,并发现核病毒呈整 合状态,他们认为,HPV6的整合增加了致癌潜能,并打乱了正常细胞的增殖。Suzuki[7] 在2例复发喉乳头状瘤中检出HPV6a,并发现其基因组中L1区发生部分缺失,这2例均出现 增生 过度及类似癌症的病理改变。Rady[8]在1例复发的上呼吸道乳头状瘤并最终发 生肺癌患者的标本中检出HPV11,在良性病变中病毒基因组呈游离和整合状态;而在肺癌则呈 整合状态,同时有p53突变和IFNB-1丢失,他认为,p53突变与HPV11的整合有关,促进了基因的 不稳定性,使复发的乳头状瘤发展为癌症。我们对比通用L1型和特异E6区引物扩增的结 果,在喉癌中也发生良性型HPV DNA的整合而使L1区丢失,L1区编码的是具有强免疫原性 的病毒壳蛋白,因而,L1的丢失使病毒的壳蛋白产生减少,使病毒能躲避宿主的免疫作用。 这说明良性型HPV感染也可能通过整合和逃避宿主免疫而致喉癌。提示在临床上诊治喉癌时, 除了采取手术、化疗外,对部分患者还需进行抗病毒治疗。
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大量研究表明,喉乳头状瘤与感染HPV6、11有 关。本研究结果也证实了这一点。但HPV与非乳头瘤LEHL的关系还有争议。Gallo[9] 对115例喉角化症患者进行了10年追踪观察,其中9例发展为癌症,但在所有病变中用原位 杂交均未检出HPV DNA,他认为HPV在喉癌发病中不起重要作用。Poljak[10]用PCR在 58例LEHL中仅检出1例不典型增生HPV6,他认为,其他致病机理在这些病变中起主要作用。Fou ret等[11]用E6区引物PCR在57例喉不典型增生及角化症中检出6例HPV16。我们在 34例非乳头瘤LEHL检出5例HPV,我们认为,大部分LEHL发病与HPV无关。
我们在1例β- Actin扩增阴性的喉癌中检出HPV6。Park[12]在宫颈癌的研究中也见到此现象,10 例β-globin阴性的宫颈癌3例检出HPV。可能人类基因组与病毒不同,前者易降解,内源性基 因扩增阴性并不能完全排除HPV阴性。
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总之,为了明确HPV在LSCC及LEHL的作用,有必要 进行类似于宫颈癌的研究,即用标准扩增系统进行严格对照、多中心、大样 本的研究。这对临床上是否采用抗病毒治疗,以提高喉癌患者的生存率是有益的探讨。
作者简介：林昶(1967-)，男，福建人，。福建医科大学附属第一医院耳鼻咽喉科主治工程师，博士，主要从事中耳炎病理及喉肿瘤分子病毒学研究。
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(收稿日期 2000-01-03), 百拇医药