单纯疱疹病毒胸苷激酶基因对人膀胱癌的杀伤效应
作者：陈友琴何杰石明卢一平李虹杨宇如唐孝达
单位：陈友琴(华西医科大学 生物医学工程研究室, 四川 成都 610041)；何杰(成都市第三人民医院 泌尿外科, 四川 成都 610031)石明卢一平李虹杨宇如唐孝达(华西医科大学 第一附属临床医学院泌尿外科, 四川 成都 610041)
关键词：单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSV-TK)基因；基因治疗；逆转录病毒；膀胱癌；丙氧鸟苷(GCV)
中国医学物理学杂志000316 摘要: 目的:探讨单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSV-TK)基因在人膀胱癌基因治疗中的作用。材料与方法:利用电击基因导入法,将逆转录病毒载体PLNXSTK导入包装细胞PA317,经G418筛选,获得稳定产病毒的PA317/PLNXSTK(PA317/TK)细胞株。采用制备的病毒液转染体外培养的人膀胱癌T24细胞,并联合丙氧鸟苷(GCV)作用,研究其对膀胱癌细胞的生长抑制作用。结果:所获得的PA317/TK细胞能稳定地产生复制缺陷的逆转录病毒载体,滴度为1.65×105 cfu/ml。结论:逆转录病毒介导的HSV-TK基因在体外能成功地转染T24细胞,且HSV-TK/GCV系统能明显抑制膀胱癌细胞的生长。这为HSV-TK/GCV在人类膀胱癌治疗方面的进一步体内实验提供了可靠依据。
, 百拇医药
中图分类号: R977.9 文献标识码: A 文章编号: 1005-202X(2000)03-0160-02
The effect of HSV-TK gene on killing human bladder cancer cell
CHEN You-qing
(Institute of Biomedical Engineering,West University of Medical Science,Chendu 610041, China)
HE Jie
(Department of Urology,The Third People＇s Hospital of Chendu,Chendu 610031, China)
, 百拇医药
SHI Ming,LU Yi-ping,LI Hong,YAN Yu-ru,TAN Xiao-da
(Dpartment of Urology,The First Affiliated Hospital,West University of Medical Science,Chendu 610041, China)
Abstract: Purpose:In order to investigate the effect about traduction of herpes simplex virous thymidine kinase(HSV-TK)gene to treat human bladder cancer.Method:transduction of human recombinant retrovirus vector-PLNXS-TK,which contained the HSV-TK gene,into the packaging cell PA317 was been done. After selecting by using G418,the HSV-TK gene transduced cells PA317/PLNXSTK was obtained,which could produce replictation-defective retrovirus vector stably. In vitro,the retrovirus mediated HSV-TK gene was transferred into human bladder cancer cells T24 and the growth inhibiting effect by adding different dosage of GCV was observed.Result:The transferred retrovirus packaging cells PA317/PLNXSTK(PA317/TK)were obtained,which could produce replicated defective retrovirus vector and the titre of vector was 1.65×105 cfu/ml,and the sensitivity to GCV increased 1000 fold in HSV-TK gene transferred T24 cell compare with the untransfected contrd T24 cells.ConclusionThe retrovirus transferred HSV-TK gene can be transducted into human bladder cancer cell T24. HSV-TK gene transfection with GCV can effectively inhibit growth of human bladder cancer cell T24. The results suggest that therapy of HSV-TK gene will be a potential possibility of treatment of human bladder cancer.
, http://www.100md.com
Key words:HSV-TK gene;gene therapy;retrovirus;bladder cancer;ganciclovir(GCV)
前言:单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSV-TK)基因是存在于病毒等原核生物中的基因,是肿瘤基因治疗应用最广泛的自杀基因。它的表达产物,能将一些对哺乳动物细胞无毒性的核苷类似物转化成有毒性的磷酸化物,阻止细胞DNA的正常合成。当HSV-TK基因被导入肿瘤细胞后。GCV则可杀死转染HSV-TK基因的癌细胞[1]。迄今为止,采用HSV-TK基因转染联合应用GCV的“自杀基因”疗法,已在人类实体细胞肿瘤如脑肿瘤、卵巢癌,恶性黑色素瘤等的治疗实验中取得良好效果[2-5]。但采用HSV-TK基因转导治疗人膀胱癌的研究报告甚少,为了更加深入地了解HSV-TK基因在人膀胱癌基因治疗中的作用及其潜在的临床应用价值,本研究采用HSV-TK基因对人膀胱癌细胞株T24进行了体外转染实验,并联合GCV药物治疗,观察其体外对膀胱癌细胞的生长抑制作用。
, 百拇医药
1 材料和方法
1.1 材料与试剂
重组质粒PLNXSTK和包装细胞PA317由华西医科大学临床分子生物学研究中心黄倩教授提供,人T24膀胱癌细胞由重庆医科大学肝炎研究所任红教授提供,丙氧鸟苷(GCV)购自瑞士Roche公司。
1.2 实验方法
1.2.1 PA317/TK细胞株的建立
利用电击基因导入法,将逆转录病毒载体(PLNXSTK)导入包装细胞PA317,经含G418(600 μg/ml)的培养液选择培养4周后,挑取抗G418的细胞克隆继续扩增培养,称为PA317/PLNXSTK(PA317/TK)细胞。
1.2.2 逆转毒病毒滴度的测定
, 百拇医药
用收集的PA317/TK细胞上清液感染,对数生长期的NIH3T3细胞,在含G418(400 μg/ml)的培养基中选择培养,第2周观察抗G418的细胞克隆数。
1.2.3 T24/PLNXSTK细胞株的建立
用收集的病毒上清液感染贴壁生长的T24细胞,经含G418(800 μg/ml)的培养液筛选培养后,所得到抗G418的癌细胞,即为T24/PLNXSTK(T24/TK)细胞。
1.2.4 GCV对T24/TK细胞的体外杀伤作用
对照组T24膀胱癌细胞和转染后T24/TK细胞分别加入相同浓度(0.001～10 μg/ml)的GCV,观察细胞生长情况。
2 结 果
2.1 重组逆转录病毒的收获和滴度测定
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用重组质粒PLNXSTK转染PA317细胞,经一系列处理制备重组逆转录病毒液,感染NIH3T3细胞,经测定其滴度为1.65×105 cfu/ml。
2.2 抗性细胞的获得
用PLNXSTK病毒感染T24细胞24小时后,用G418加压筛选,2周后,长出抗性克隆,胰酶消化克隆灶,扩大培养,即可得T24/TK细胞。
2.3 不同浓度GCV对T24/TK细胞的体外杀伤作用
由于T24/TK细胞有HSV-TK基因的表达,故对GCV的敏感性明显高于T24细胞(表1,图1)。在GCV浓度为0.001 μg/ml时,T24/TK细胞已表现出生长抑制,存活数为对照组的73.56%,而T24细胞则需在GCV浓度为1 μg/ml时,才出现生长抑制。T24/TK细胞的GCV半数致死浓度为0.1 μg/ml,T24细胞在10 μg/ml GCV浓度时,存活细胞仍有55.7% 。说明T24/TK细胞比T24细胞对GCV的敏感性高1000倍。
, 百拇医药
表1 T24、T24/TK细胞对GCV的敏感性比较 细胞数
GCV浓度(μg/ml)
0
0.001
0.01
0.1
1
10
T24(×105)
2.19
2.66
2.46
, 百拇医药
2.43
1.81
1.22
(
±s)
±0.41
±0.37
±0.56
±0.49
±0.52
±0.35
百分比(%)
100
, http://www.100md.com
121.46
112.37
111.41
82.65
55.7
T24/TK(×105)
2.42
1.78
1.26
1.20
0.8
0.43
, 百拇医药
(±s)
±0.48
±0.62
±0.26
±0.33
±0.30
±0.14
百分比(%)
100
73.56
52.25
49.59
, http://www.100md.com
31.91
17.3
注以GCV浓度0组细胞数为100%
图1 GCV 对T24、T24/TK细胞的生长抑制
3 讨 论
将特定基因转入靶细胞,激活前体药物产生对靶细胞的毒性,这种策略被认为是目前肿瘤治疗中最有潜力的治疗措施。Morlten[6]提出了一种特殊的细胞毒基因治疗方法,那就是在采用病毒转染HSV-TK基因的基础上联合应用GCV对恶性肿瘤进行的治疗,因为HSV-TK基因的表达产物能使GCV磷酸化,而三磷酸化的GCV可通过抑制DNA合成酶活性或掺入DNA链中中止链的延长,从而造成被转染肿瘤细胞的死亡。这种“自杀”基因疗法在对脑肿瘤的体内、外实验中取得明显效果后,被广泛应用于对许多人类实体肿瘤的治疗研究中。Sutton[7]采用腺病毒介导的HSV-TK基因转染鼠的膀胱癌细胞MBT-2,结果发现GCV在体内、外均能杀伤转染后的癌细胞。我们采用了逆转录病毒介导的HSV-TK基因对人膀胱癌T24细胞进行了体外转染试验,将逆转录病毒载体PLNXSTK成功地导入T24细胞,联合应用GCV后,发现在GCV浓度为0.001 μg/ml时,治疗组的细胞生长已开始受到抑制,其半数至死浓度为0.1 μg/ml。治疗组细胞对GCV的敏感性超过对照组1000倍,说明HSV-TK基因导入T24细胞后其表达产物使T24细胞对GCV敏感性明显增加,从而易被GCV杀伤。谢文练[8]等也报道利用逆转录病毒载体成功地将HSV-TK基因转入人膀胱癌BIU-87细胞,加入ACV在80 μg/ml时能将细胞全部杀死,而对照组不能被相应的ACV杀死。同样证明了HSV-TK基因对膀胱癌细胞的体外治疗效果。
, 百拇医药
但是与谢文练[8]的结果不同的是:我们发现即使在高浓度GCV(10 μg/ml)作用下,仍有部分(17.3%)T24细胞存活,Barba等[9]也曾报道HSV-TK阳性的C6大鼠脑胶质瘤细胞体外GCV处理后仍然存活,并能在GCV存在的情况下继续增殖。产生这种现象的原因,目前比较共同的看法是随着被转染细胞系的不同,细胞对GCV的敏感性也发生变化[9]。
本实验表明逆转录病毒介导的HSV-TK基因能够成功地在体外转染人膀胱癌T24细胞,从而使其在体外对GCV的敏感性增加1000倍以上。这为进一步的体内实验提供了依据。
本研究提示HSV-TK/GCV在人膀胱癌治疗方面具有明显的临床运用前景。
作者简介:陈友琴(1963- ),女(白族),云南大理人,大理医学院讲师,博士研究生。
, http://www.100md.com
参考文献:
1，Culver KW,Ram Z,Wallbridge S,et al. In vivo gene transfer with retroviral vector-producer cells for treatment of experimental brain tumors [J]. Science,1992，256：1550-1552.
2，Lyons RM,Forry-Schaudies S,Otto E,et al. An improved retroviral encoding the herpes simplex virus thymidine kinase gene increases antitumor efficacy in vivo [J]. Cancer Gene Ther,1995,2:273-280.
3，Kumagai T,Tanio Y,Osaki J,et al. Eradication of Myc-overexpressing small cell lung cancr cells transfected with herpes simplex virus thymidine kinase gene containing Myc-Max response elements [J]. Cancer Res,1996,56:354-358.
, 百拇医药
4，Henoly AA,and Auersperg N Applying the herpes sim plex virus thymidine kinase/ganciclovir approach to ovarian cancer an effective in vitro drug-sensitization system [J]. Gynecol Obstet Invest,1997,43:268-272.
5，Yee D,McGuire SE,Brunner N,et al. Adenovirus-mediated gene transfer of herpes simplex virus thymidine kinase in an ascites model of human breast cancer[J]. Hum Gene Ther,1996,7(1):1251-1257.
6，Mooltern FL.Tumor chemosensitivity confered by inserted herpes thymidine inase genes:Paradiagm for a prospective cancer control strategy [J]. Cancer Res,1986465276-5281.
, http://www.100md.com
7，Sutton MA,Berkman.SA,Cheng SH,et al. Adenovirs-mediated suicide gene therapy for experimental bladder cancer[J].Urology,1997,49:173-180.
8，谢文练梅晔湛道明等.逆转录病毒载体介导HSV-TK基因在膀胱癌细胞的表达和作用.中华泌尿外科杂志[J],1997,18(9):549-552.
9，Barba D,HarDin J,Rayi,et al. Thmidine kinase-mediated killing of rat brain tumors[J]. J Neurosurg1993,79:729-735.
收稿日期:2000-2-17, http://www.100md.com
单位：陈友琴(华西医科大学 生物医学工程研究室, 四川 成都 610041)；何杰(成都市第三人民医院 泌尿外科, 四川 成都 610031)石明卢一平李虹杨宇如唐孝达(华西医科大学 第一附属临床医学院泌尿外科, 四川 成都 610041)
关键词：单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSV-TK)基因；基因治疗；逆转录病毒；膀胱癌；丙氧鸟苷(GCV)
中国医学物理学杂志000316 摘要: 目的:探讨单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSV-TK)基因在人膀胱癌基因治疗中的作用。材料与方法:利用电击基因导入法,将逆转录病毒载体PLNXSTK导入包装细胞PA317,经G418筛选,获得稳定产病毒的PA317/PLNXSTK(PA317/TK)细胞株。采用制备的病毒液转染体外培养的人膀胱癌T24细胞,并联合丙氧鸟苷(GCV)作用,研究其对膀胱癌细胞的生长抑制作用。结果:所获得的PA317/TK细胞能稳定地产生复制缺陷的逆转录病毒载体,滴度为1.65×105 cfu/ml。结论:逆转录病毒介导的HSV-TK基因在体外能成功地转染T24细胞,且HSV-TK/GCV系统能明显抑制膀胱癌细胞的生长。这为HSV-TK/GCV在人类膀胱癌治疗方面的进一步体内实验提供了可靠依据。
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中图分类号: R977.9 文献标识码: A 文章编号: 1005-202X(2000)03-0160-02
The effect of HSV-TK gene on killing human bladder cancer cell
CHEN You-qing
(Institute of Biomedical Engineering,West University of Medical Science,Chendu 610041, China)
HE Jie
(Department of Urology,The Third People＇s Hospital of Chendu,Chendu 610031, China)
, 百拇医药
SHI Ming,LU Yi-ping,LI Hong,YAN Yu-ru,TAN Xiao-da
(Dpartment of Urology,The First Affiliated Hospital,West University of Medical Science,Chendu 610041, China)
Abstract: Purpose:In order to investigate the effect about traduction of herpes simplex virous thymidine kinase(HSV-TK)gene to treat human bladder cancer.Method:transduction of human recombinant retrovirus vector-PLNXS-TK,which contained the HSV-TK gene,into the packaging cell PA317 was been done. After selecting by using G418,the HSV-TK gene transduced cells PA317/PLNXSTK was obtained,which could produce replictation-defective retrovirus vector stably. In vitro,the retrovirus mediated HSV-TK gene was transferred into human bladder cancer cells T24 and the growth inhibiting effect by adding different dosage of GCV was observed.Result:The transferred retrovirus packaging cells PA317/PLNXSTK(PA317/TK)were obtained,which could produce replicated defective retrovirus vector and the titre of vector was 1.65×105 cfu/ml,and the sensitivity to GCV increased 1000 fold in HSV-TK gene transferred T24 cell compare with the untransfected contrd T24 cells.ConclusionThe retrovirus transferred HSV-TK gene can be transducted into human bladder cancer cell T24. HSV-TK gene transfection with GCV can effectively inhibit growth of human bladder cancer cell T24. The results suggest that therapy of HSV-TK gene will be a potential possibility of treatment of human bladder cancer.
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Key words:HSV-TK gene;gene therapy;retrovirus;bladder cancer;ganciclovir(GCV)
前言:单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSV-TK)基因是存在于病毒等原核生物中的基因,是肿瘤基因治疗应用最广泛的自杀基因。它的表达产物,能将一些对哺乳动物细胞无毒性的核苷类似物转化成有毒性的磷酸化物,阻止细胞DNA的正常合成。当HSV-TK基因被导入肿瘤细胞后。GCV则可杀死转染HSV-TK基因的癌细胞[1]。迄今为止,采用HSV-TK基因转染联合应用GCV的“自杀基因”疗法,已在人类实体细胞肿瘤如脑肿瘤、卵巢癌,恶性黑色素瘤等的治疗实验中取得良好效果[2-5]。但采用HSV-TK基因转导治疗人膀胱癌的研究报告甚少,为了更加深入地了解HSV-TK基因在人膀胱癌基因治疗中的作用及其潜在的临床应用价值,本研究采用HSV-TK基因对人膀胱癌细胞株T24进行了体外转染实验,并联合GCV药物治疗,观察其体外对膀胱癌细胞的生长抑制作用。
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1 材料和方法
1.1 材料与试剂
重组质粒PLNXSTK和包装细胞PA317由华西医科大学临床分子生物学研究中心黄倩教授提供,人T24膀胱癌细胞由重庆医科大学肝炎研究所任红教授提供,丙氧鸟苷(GCV)购自瑞士Roche公司。
1.2 实验方法
1.2.1 PA317/TK细胞株的建立
利用电击基因导入法,将逆转录病毒载体(PLNXSTK)导入包装细胞PA317,经含G418(600 μg/ml)的培养液选择培养4周后,挑取抗G418的细胞克隆继续扩增培养,称为PA317/PLNXSTK(PA317/TK)细胞。
1.2.2 逆转毒病毒滴度的测定
, 百拇医药
用收集的PA317/TK细胞上清液感染,对数生长期的NIH3T3细胞,在含G418(400 μg/ml)的培养基中选择培养,第2周观察抗G418的细胞克隆数。
1.2.3 T24/PLNXSTK细胞株的建立
用收集的病毒上清液感染贴壁生长的T24细胞,经含G418(800 μg/ml)的培养液筛选培养后,所得到抗G418的癌细胞,即为T24/PLNXSTK(T24/TK)细胞。
1.2.4 GCV对T24/TK细胞的体外杀伤作用
对照组T24膀胱癌细胞和转染后T24/TK细胞分别加入相同浓度(0.001～10 μg/ml)的GCV,观察细胞生长情况。
2 结 果
2.1 重组逆转录病毒的收获和滴度测定
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用重组质粒PLNXSTK转染PA317细胞,经一系列处理制备重组逆转录病毒液,感染NIH3T3细胞,经测定其滴度为1.65×105 cfu/ml。
2.2 抗性细胞的获得
用PLNXSTK病毒感染T24细胞24小时后,用G418加压筛选,2周后,长出抗性克隆,胰酶消化克隆灶,扩大培养,即可得T24/TK细胞。
2.3 不同浓度GCV对T24/TK细胞的体外杀伤作用
由于T24/TK细胞有HSV-TK基因的表达,故对GCV的敏感性明显高于T24细胞(表1,图1)。在GCV浓度为0.001 μg/ml时,T24/TK细胞已表现出生长抑制,存活数为对照组的73.56%,而T24细胞则需在GCV浓度为1 μg/ml时,才出现生长抑制。T24/TK细胞的GCV半数致死浓度为0.1 μg/ml,T24细胞在10 μg/ml GCV浓度时,存活细胞仍有55.7% 。说明T24/TK细胞比T24细胞对GCV的敏感性高1000倍。
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表1 T24、T24/TK细胞对GCV的敏感性比较 细胞数
GCV浓度(μg/ml)
0
0.001
0.01
0.1
1
10
T24(×105)
2.19
2.66
2.46
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2.43
1.81
1.22
(
±s)±0.41
±0.37
±0.56
±0.49
±0.52
±0.35
百分比(%)
100
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121.46
112.37
111.41
82.65
55.7
T24/TK(×105)
2.42
1.78
1.26
1.20
0.8
0.43
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(
±s)±0.48
±0.62
±0.26
±0.33
±0.30
±0.14
百分比(%)
100
73.56
52.25
49.59
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31.91
17.3
注以GCV浓度0组细胞数为100%
图1 GCV 对T24、T24/TK细胞的生长抑制
3 讨 论
将特定基因转入靶细胞,激活前体药物产生对靶细胞的毒性,这种策略被认为是目前肿瘤治疗中最有潜力的治疗措施。Morlten[6]提出了一种特殊的细胞毒基因治疗方法,那就是在采用病毒转染HSV-TK基因的基础上联合应用GCV对恶性肿瘤进行的治疗,因为HSV-TK基因的表达产物能使GCV磷酸化,而三磷酸化的GCV可通过抑制DNA合成酶活性或掺入DNA链中中止链的延长,从而造成被转染肿瘤细胞的死亡。这种“自杀”基因疗法在对脑肿瘤的体内、外实验中取得明显效果后,被广泛应用于对许多人类实体肿瘤的治疗研究中。Sutton[7]采用腺病毒介导的HSV-TK基因转染鼠的膀胱癌细胞MBT-2,结果发现GCV在体内、外均能杀伤转染后的癌细胞。我们采用了逆转录病毒介导的HSV-TK基因对人膀胱癌T24细胞进行了体外转染试验,将逆转录病毒载体PLNXSTK成功地导入T24细胞,联合应用GCV后,发现在GCV浓度为0.001 μg/ml时,治疗组的细胞生长已开始受到抑制,其半数至死浓度为0.1 μg/ml。治疗组细胞对GCV的敏感性超过对照组1000倍,说明HSV-TK基因导入T24细胞后其表达产物使T24细胞对GCV敏感性明显增加,从而易被GCV杀伤。谢文练[8]等也报道利用逆转录病毒载体成功地将HSV-TK基因转入人膀胱癌BIU-87细胞,加入ACV在80 μg/ml时能将细胞全部杀死,而对照组不能被相应的ACV杀死。同样证明了HSV-TK基因对膀胱癌细胞的体外治疗效果。
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但是与谢文练[8]的结果不同的是:我们发现即使在高浓度GCV(10 μg/ml)作用下,仍有部分(17.3%)T24细胞存活,Barba等[9]也曾报道HSV-TK阳性的C6大鼠脑胶质瘤细胞体外GCV处理后仍然存活,并能在GCV存在的情况下继续增殖。产生这种现象的原因,目前比较共同的看法是随着被转染细胞系的不同,细胞对GCV的敏感性也发生变化[9]。
本实验表明逆转录病毒介导的HSV-TK基因能够成功地在体外转染人膀胱癌T24细胞,从而使其在体外对GCV的敏感性增加1000倍以上。这为进一步的体内实验提供了依据。
本研究提示HSV-TK/GCV在人膀胱癌治疗方面具有明显的临床运用前景。
作者简介:陈友琴(1963- ),女(白族),云南大理人,大理医学院讲师,博士研究生。
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参考文献:
1，Culver KW,Ram Z,Wallbridge S,et al. In vivo gene transfer with retroviral vector-producer cells for treatment of experimental brain tumors [J]. Science,1992，256：1550-1552.
2，Lyons RM,Forry-Schaudies S,Otto E,et al. An improved retroviral encoding the herpes simplex virus thymidine kinase gene increases antitumor efficacy in vivo [J]. Cancer Gene Ther,1995,2:273-280.
3，Kumagai T,Tanio Y,Osaki J,et al. Eradication of Myc-overexpressing small cell lung cancr cells transfected with herpes simplex virus thymidine kinase gene containing Myc-Max response elements [J]. Cancer Res,1996,56:354-358.
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4，Henoly AA,and Auersperg N Applying the herpes sim plex virus thymidine kinase/ganciclovir approach to ovarian cancer an effective in vitro drug-sensitization system [J]. Gynecol Obstet Invest,1997,43:268-272.
5，Yee D,McGuire SE,Brunner N,et al. Adenovirus-mediated gene transfer of herpes simplex virus thymidine kinase in an ascites model of human breast cancer[J]. Hum Gene Ther,1996,7(1):1251-1257.
6，Mooltern FL.Tumor chemosensitivity confered by inserted herpes thymidine inase genes:Paradiagm for a prospective cancer control strategy [J]. Cancer Res,1986465276-5281.
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7，Sutton MA,Berkman.SA,Cheng SH,et al. Adenovirs-mediated suicide gene therapy for experimental bladder cancer[J].Urology,1997,49:173-180.
8，谢文练梅晔湛道明等.逆转录病毒载体介导HSV-TK基因在膀胱癌细胞的表达和作用.中华泌尿外科杂志[J],1997,18(9):549-552.
9，Barba D,HarDin J,Rayi,et al. Thmidine kinase-mediated killing of rat brain tumors[J]. J Neurosurg1993,79:729-735.
收稿日期:2000-2-17, http://www.100md.com