涎腺基因治疗口腔、涎腺及系统性疾病的研究
作者：王松灵 徐岩英
单位：王松灵(首都医科大学附属北京口腔医院涎腺疾病治疗中心 100050)；徐岩英(北京医科大学口腔医学院中医粘膜科)
关键词：
中华口腔医学杂志000324 基因治疗是通过补充或替代体内基因缺陷或不足治疗人类疾病的方法。基因治疗是当今医学研究中最具有前景的研究之一。由于外分泌腺(如涎腺、胰腺、肝脏等)的解剖特点特别适用于基因治疗[1-4]：①涎腺有蛋白合成及分泌系统；②涎腺腺体分泌的蛋白可经基底膜至血液，经顶膜至唾液；③涎腺可通过导管系统无创逆行注射各种基因；④腺体的腺泡和导管均由单层细胞构成，一次注射即可将基因投递到绝大多数细胞；⑤经导管投递基因较经血液投递后免疫反应及炎症反应轻得多；⑥转基因后蛋白的分泌受多种生理因素调控。涎腺相对其他外分泌腺其基因投递更简易方便。已有研究表明，外源的基因经导管投递至涎腺能改变腺体本身的蛋白表达，能合成具有生物学效应的治疗蛋白，这些蛋白可到达唾液、口腔及血液，具有全身系统功效。
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1.腺病毒介导水通道基因至涎腺治疗口腔干燥：口腔干燥在临床上较常见，主要见于头颈部放射治疗涎腺损伤[5]、舍格伦综合征[6]及涎腺良性肥大[7]。目前对口干症的治疗除疗效短暂的促唾剂(如毛果云香碱、环戊硫酮及中药)外，尚无其他有效疗法。对哺乳类动物细胞膜水通道基础研究表明细胞膜水分泌是由水通道蛋白控制(aquaporins)，已从哺乳类动物细胞中分离出5种水通道蛋白，编号为AQP 1～5，分别由5个相应的水通道基因控制[8]，其中AQP5是从大鼠颌下腺细胞分离克隆出，广泛存在于涎腺、泪腺、气管、肺等上皮细胞，在涎腺和泪腺AQP 5型中在腺泡细胞顶膜上(apical membrane)[9]。Delporte等[10]用重组复制缺陷腺病毒介导AQP 5基因投递到人类颌下腺上皮细胞(human submandi-bular gland，HSG)、人类肾上腺皮细胞(293)、大鼠颌下腺上皮细胞(submandibular immortalized epithelium,SMIE)、猴肾上皮细胞(monkey kidney cell line,MDCK)均有AQP 5表达，并集中在顶膜上。通过在MDCK细胞的表达后，测定细胞净液体分泌率(net fluid secretion rate)，较对照组液体分泌增加5～6倍。用AQP 5基因治疗，20 Gy放射大鼠颌下腺，其颌下腺唾液分泌恢复到正常水平，而20 Gy放射大鼠颌下腺未经基因治疗的对照组唾液分泌只有正常分泌的1/4。用腺病毒介导水通道基因治疗口腔干燥的相关临床方案正在拟定中。
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2.腺病毒介导富组蛋白基因以治疗口腔白色念珠菌感染：口腔白色念珠菌感染临床上日趋常见[11]。临床上虽有抗真菌药，但近年来耐药株明显增多，治疗仍很困难[12]。由涎腺合成并分泌至人类唾液中一种富组蛋白(histatin)具有明显抗真菌作用，并对耐药性真菌有效[13，14]。富组蛋白由相应基因调控，已知富组蛋白的家族有9种，分别编号为histatin 1～9[15]。O′Connell[16]将富组蛋白-3基因在重组复制缺陷腺病毒介导下(AdCMVH 3)在涎腺的体内外均有表达。体外实验中将人富组蛋白的基因转移到人类肾上皮细胞、HSG及SMIE均有明显富组蛋白分泌至培养基中，用感染细胞培养基进行杀菌试验，120 min将90%白色念珠菌杀死，并且对耐药和非耐药菌均非常有效。大鼠体内实验表明，感染的颌下腺唾液中富组蛋白平均达302 mg/L，而未感染大鼠的颌下腺测不到富组蛋白。进一步体内实验正在白色念珠菌感染的动物模型中进行，人类临床应用也在拟定中。
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3.人胰岛素基因及生长激素基因投递至涎腺治疗相关全身病：Kagami等[4]用重组复制缺陷腺病毒介导人类抗胰蛋白的酶基因(AdαAT)作为标记蛋白，经导管注入大鼠颌下腺测定唾液、血清及其他组织胰蛋白酶含量，在基因转移24～48 h后体内各组织胰蛋白酶含量达高峰，颌下腺腺体内含量最高，其次是唾液，血液中浓度也明显升高，其他组织含量很低，该实验表明投递基因于涎腺局部，不仅腺体本身，唾液及血清中基因调控蛋白均明显升高，因此，涎腺基因治疗的分泌产物已投递至全身。
Goldfine等[17]将人胰岛素基因载体质粒(human insulin was expressed from the PBAT 16.hinsG1.M2 vector plasmid)经导管注入大鼠颌下腺，血液中人胰岛素浓度明显升高，注入人类生长激素载体质粒(human growth hormone vector plasmid)至大鼠颌下腺后，其血液中人生长激素也明显升高。为证实胰岛素基因投递于腮腺后产生胰岛素的生理作用，即建立糖尿病动物模型，其血清中血糖明显持续升高。将人类胰岛素载体质粒注入已建立的糖尿病动物模型的颌下腺后，大鼠血糖持续下降至正常范围，血中胰岛素浓度也恢复到正常水平，而对照组血糖一直升高，血中胰岛素浓度低下。He等[18]将人生长激素制成重组复制缺陷腺病毒将其注入大鼠颌下腺后，血中生长激素浓度与唾液中浓度一样高，而腺体内含量较低，表明腺病毒介导生长激素基因在颌下腺合成生长激素后，主要分泌至血液和唾液。用侏儒小鼠(出生时摘除脑垂体)，尾静脉注射生长激素基因，血的生长激素升高到正常范围，侏儒小鼠生长发育明显改善达健康小鼠水平，而对照组侏儒小鼠体重仅为治疗组的1/10。
, 百拇医药
随着研究的深入，各种治疗基因的分离和克隆，介导用的载体进一步改进，有效蛋白信息介入(能将基因调控产生的蛋白介导分泌到唾液、血液或停留在腺体内)，涎腺基因治疗将具有广阔的前景。
参考文献
1，Baum BJ,O′Connell BC.The impact of gene therapy on dentistry.J Am Dent Assoc,1995,126:179-189.
2，Mastrageli AO,O′Connell BC,Aladib W,et al.Direct in vivo adenovirus-mediated gene transfer to salivary glands.Am J Physiol,1994,266:1146-1155.
3，O′Connell BC,Tenhagen KG,Lazowski KW,et al.Facilitated DNA transfer to rat submandibular gland in vivo and GRP-Ca gene regulation.Am J Physiol,1995,268:1074-1078.
, http://www.100md.com
4，Kagami H,O′Connell BC,Baum BJ.Evidence for the systemic delivery of a transgene product from salivary glands.Human Gene Therapy,1996,7:7177-7184.
5，王松灵，朱宣智，吉野教夫，等.正常口腔颌面组织放射生物学研究概况.中华口腔医学杂志，1994， 29：57-659.
6，Wang SL,Zou ZJ,Yu SF,et al.Recurrent swelling of parotid glands and Sjögren′s syndrome.Int J Oral Maxillofac Surg,1993,22:362-365.
7，Wang SL,Zhao ZT,Li J,et al.Investigation of the clinical value of total saliva flow rates.Arch Oral Biol,1998,43:39-43.
, http://www.100md.com
8，Denker BM,Smith BL,Kuhajda FP,et al.Idenntification,purification,and partial characterization of a novel Mr 28,000 integral membrane protein from erythrocytes and renal tubules.J Biol Chem,1988,263:15634-15642.
9，Agre P,Brownn D,Nielsen S.Aquaporin water channels: unanswered questions and unresolved controversies.Curr Opin Cell Biol,1995,7:472-483.
10，Delporte C,O′Connell BC,He X,et al.Adenovirus-mediated expression of aquaporin-5 in epithelial cells.J Biol Chem,1996,271:22070-22075.
, 百拇医药
11，Klein RS,Harris CA,Small CB,et al.Oral candidiasis in high risk patients as the initial manifestation of the acquired immunodeficiency syndrome.N Engl J Med,1984,311:354-358.
12，Georgopapadakon NH,Walsh TJ.Human mycoses: drugs and targets for emerging pathogens.Science,1994,264:371-373.
13，Baum BJ,Bird JL,Miller DB,et al.Studies on hitidine-rich polypeptides from human parotid saliva.Arch Biochem Biophys,1976,177:447-456.
, 百拇医药
14，Edgerton M,Lo T,Raj PA.Salivary histatine 5 exhibit specific binding to yeast cell membranes.J Dent Res,1996,75:358.
15，Oppenhim FG,Xu T,McMillian FM,et al.Histatins,a novel family of histidine-rich protein in human parotid secretiion.Isolation,characterization,primary structure and fungistatic effects on candida albicans.J Biol Chem,1988,263:7472-7477.
16，O′Connell BC,Xu T,Walsh TJ,et al.Transfer of a gene encoding the anticandidal prtein histatin 3 to salivary glands.Human Gene Therapy,1996,7:2255-2261.
, 百拇医药
17，Goldfine ID,German MS,Tseng HC,et al.The endocrine secretion of human insulin and growth hormone by exocrine glands of the gastrointestinal tract.Nat Biotechnol,1997,15:1378-1383.
18，He XJ,Goldsmith C,Mammary Y,et al.Systemic action of human growth hormone following adenovirus-mediated gene transfer to rat submandibular glands.Gene Therapy,1998,5:537-541.
(收稿日期：1999-02-12), 百拇医药
单位：王松灵(首都医科大学附属北京口腔医院涎腺疾病治疗中心 100050)；徐岩英(北京医科大学口腔医学院中医粘膜科)
关键词：
中华口腔医学杂志000324 基因治疗是通过补充或替代体内基因缺陷或不足治疗人类疾病的方法。基因治疗是当今医学研究中最具有前景的研究之一。由于外分泌腺(如涎腺、胰腺、肝脏等)的解剖特点特别适用于基因治疗[1-4]：①涎腺有蛋白合成及分泌系统；②涎腺腺体分泌的蛋白可经基底膜至血液，经顶膜至唾液；③涎腺可通过导管系统无创逆行注射各种基因；④腺体的腺泡和导管均由单层细胞构成，一次注射即可将基因投递到绝大多数细胞；⑤经导管投递基因较经血液投递后免疫反应及炎症反应轻得多；⑥转基因后蛋白的分泌受多种生理因素调控。涎腺相对其他外分泌腺其基因投递更简易方便。已有研究表明，外源的基因经导管投递至涎腺能改变腺体本身的蛋白表达，能合成具有生物学效应的治疗蛋白，这些蛋白可到达唾液、口腔及血液，具有全身系统功效。
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1.腺病毒介导水通道基因至涎腺治疗口腔干燥：口腔干燥在临床上较常见，主要见于头颈部放射治疗涎腺损伤[5]、舍格伦综合征[6]及涎腺良性肥大[7]。目前对口干症的治疗除疗效短暂的促唾剂(如毛果云香碱、环戊硫酮及中药)外，尚无其他有效疗法。对哺乳类动物细胞膜水通道基础研究表明细胞膜水分泌是由水通道蛋白控制(aquaporins)，已从哺乳类动物细胞中分离出5种水通道蛋白，编号为AQP 1～5，分别由5个相应的水通道基因控制[8]，其中AQP5是从大鼠颌下腺细胞分离克隆出，广泛存在于涎腺、泪腺、气管、肺等上皮细胞，在涎腺和泪腺AQP 5型中在腺泡细胞顶膜上(apical membrane)[9]。Delporte等[10]用重组复制缺陷腺病毒介导AQP 5基因投递到人类颌下腺上皮细胞(human submandi-bular gland，HSG)、人类肾上腺皮细胞(293)、大鼠颌下腺上皮细胞(submandibular immortalized epithelium,SMIE)、猴肾上皮细胞(monkey kidney cell line,MDCK)均有AQP 5表达，并集中在顶膜上。通过在MDCK细胞的表达后，测定细胞净液体分泌率(net fluid secretion rate)，较对照组液体分泌增加5～6倍。用AQP 5基因治疗，20 Gy放射大鼠颌下腺，其颌下腺唾液分泌恢复到正常水平，而20 Gy放射大鼠颌下腺未经基因治疗的对照组唾液分泌只有正常分泌的1/4。用腺病毒介导水通道基因治疗口腔干燥的相关临床方案正在拟定中。
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2.腺病毒介导富组蛋白基因以治疗口腔白色念珠菌感染：口腔白色念珠菌感染临床上日趋常见[11]。临床上虽有抗真菌药，但近年来耐药株明显增多，治疗仍很困难[12]。由涎腺合成并分泌至人类唾液中一种富组蛋白(histatin)具有明显抗真菌作用，并对耐药性真菌有效[13，14]。富组蛋白由相应基因调控，已知富组蛋白的家族有9种，分别编号为histatin 1～9[15]。O′Connell[16]将富组蛋白-3基因在重组复制缺陷腺病毒介导下(AdCMVH 3)在涎腺的体内外均有表达。体外实验中将人富组蛋白的基因转移到人类肾上皮细胞、HSG及SMIE均有明显富组蛋白分泌至培养基中，用感染细胞培养基进行杀菌试验，120 min将90%白色念珠菌杀死，并且对耐药和非耐药菌均非常有效。大鼠体内实验表明，感染的颌下腺唾液中富组蛋白平均达302 mg/L，而未感染大鼠的颌下腺测不到富组蛋白。进一步体内实验正在白色念珠菌感染的动物模型中进行，人类临床应用也在拟定中。
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3.人胰岛素基因及生长激素基因投递至涎腺治疗相关全身病：Kagami等[4]用重组复制缺陷腺病毒介导人类抗胰蛋白的酶基因(AdαAT)作为标记蛋白，经导管注入大鼠颌下腺测定唾液、血清及其他组织胰蛋白酶含量，在基因转移24～48 h后体内各组织胰蛋白酶含量达高峰，颌下腺腺体内含量最高，其次是唾液，血液中浓度也明显升高，其他组织含量很低，该实验表明投递基因于涎腺局部，不仅腺体本身，唾液及血清中基因调控蛋白均明显升高，因此，涎腺基因治疗的分泌产物已投递至全身。
Goldfine等[17]将人胰岛素基因载体质粒(human insulin was expressed from the PBAT 16.hinsG1.M2 vector plasmid)经导管注入大鼠颌下腺，血液中人胰岛素浓度明显升高，注入人类生长激素载体质粒(human growth hormone vector plasmid)至大鼠颌下腺后，其血液中人生长激素也明显升高。为证实胰岛素基因投递于腮腺后产生胰岛素的生理作用，即建立糖尿病动物模型，其血清中血糖明显持续升高。将人类胰岛素载体质粒注入已建立的糖尿病动物模型的颌下腺后，大鼠血糖持续下降至正常范围，血中胰岛素浓度也恢复到正常水平，而对照组血糖一直升高，血中胰岛素浓度低下。He等[18]将人生长激素制成重组复制缺陷腺病毒将其注入大鼠颌下腺后，血中生长激素浓度与唾液中浓度一样高，而腺体内含量较低，表明腺病毒介导生长激素基因在颌下腺合成生长激素后，主要分泌至血液和唾液。用侏儒小鼠(出生时摘除脑垂体)，尾静脉注射生长激素基因，血的生长激素升高到正常范围，侏儒小鼠生长发育明显改善达健康小鼠水平，而对照组侏儒小鼠体重仅为治疗组的1/10。
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随着研究的深入，各种治疗基因的分离和克隆，介导用的载体进一步改进，有效蛋白信息介入(能将基因调控产生的蛋白介导分泌到唾液、血液或停留在腺体内)，涎腺基因治疗将具有广阔的前景。
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8，Denker BM,Smith BL,Kuhajda FP,et al.Idenntification,purification,and partial characterization of a novel Mr 28,000 integral membrane protein from erythrocytes and renal tubules.J Biol Chem,1988,263:15634-15642.
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12，Georgopapadakon NH,Walsh TJ.Human mycoses: drugs and targets for emerging pathogens.Science,1994,264:371-373.
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14，Edgerton M,Lo T,Raj PA.Salivary histatine 5 exhibit specific binding to yeast cell membranes.J Dent Res,1996,75:358.
15，Oppenhim FG,Xu T,McMillian FM,et al.Histatins,a novel family of histidine-rich protein in human parotid secretiion.Isolation,characterization,primary structure and fungistatic effects on candida albicans.J Biol Chem,1988,263:7472-7477.
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18，He XJ,Goldsmith C,Mammary Y,et al.Systemic action of human growth hormone following adenovirus-mediated gene transfer to rat submandibular glands.Gene Therapy,1998,5:537-541.
(收稿日期：1999-02-12), 百拇医药