口腔粘膜下纤维化组织中内皮素1的免疫电镜研究
作者：许春姣 彭解英 刘蜀凡 方厂云 彭隆祥 徐锡萍
单位：许春姣(湖南医科大学附属湘雅医院口腔科 长沙，410008)；彭解英(湖南医科大学附属湘雅医院口腔科 长沙，410008)；刘蜀凡(湖南医科大学附属湘雅医院口腔科 长沙，410008)；方厂云(湖南医科大学附属湘雅医院口腔科 长沙，410008)；彭隆祥(湖南医科大学电镜室)；徐锡萍(湖南医科大学电镜室)
关键词：内皮缩血管肽1；口腔粘膜下纤维化；显微镜检查，免疫电子
中华口腔医学杂志000317 【摘要】目的 观察内皮素1(endothelin-1,ET-1)在人口腔粘膜下纤维化(oral submucous fibrosis，OSF)组织中的形态学定位，并探讨ET-1与OSF病变的关系。方法 用免疫电镜技术检测ET-1在OSF组织中的超微结构定位。结果 ET-1免疫阳性颗粒主要存在于OSF组织的上皮细胞、成纤维细胞及内皮细胞的胞浆内。正常口腔粘膜组织中未发现ET-1免疫阳性颗粒。OSF组织中，上皮细胞内的ET-1阳性颗粒定位于细胞膜上，胞浆内的阳性颗粒可能定位于粗面内质网、线粒体上，成纤维细胞内的阳性颗粒定位于线粒体、粗面内质网和细胞膜上。内皮细胞内的阳性颗粒较少。结论 ET-1可能为OSF的病因因素之一。
, 百拇医药
Localization of endothelin-1 in biopsies from oral submucous fibrosis:immunoelectron microscopic study
XÜ Chunjiao,PENG Xieying,LIU Shufan,et al.
(Department of Stomatology,Xiangya Hospital,Hunan Medical University,Changsha 410008，China)
【Abstract】Objective To determine the endothelin-1 ( ET-1)immunoreactivity in biopsies from human oral submucous fibrosis (OSF)and to investigate the relation between ET-1 and OSF.Methods The localization of ET-1 in biopsies from OSF was observed with immunoelectron microscopic techniques.Results High-density deposits existed predominantly in the cytoplasm of epithelial cells,fibroblasts and endothelial cells,but not found in the biopsies of normal controls.In the biopsies of OSF,high-density granules were lined on the cell membrane,possibly on the rough endoplsamic reticulum and the mitochondria of the epithelial cells and of the fibroblasts.But a few granules were seen in the cytoplasm of the endothelial cells of microvesseles.Conclusion ET-1 is one of the pathogenetic factors of OSF.
, 百拇医药
【Key words】Endothelin-1；Oral submucous fibrosis；Microscopy，immunoelectron
1988年，Yanagisawa等[1]从培养的猪主动脉内皮细胞中分离并序列化一种作用强大的血管收缩肽——内皮素1(endothelin-1,ET-1)，这是迄今所知最强的缩血管因子,它除了参与心血管功能的调节外，还具有多重生物学效应。已有报道表明，ET-1在OSF组织中的表达水平显著高于正常对照,提示ET-1在OSF的纤维化和胶原堆积过程中可能起重要作用[2]。我们首次应用链霉素抗生素蛋白的过氧化物酶(streptavidin biotin-peroxidae complex,SABC)的免疫电镜技术，对ET-1在OSF组织中的分布进行超微水平定位,并探讨其在OSF组织中的异常表达及意义,为OSF的病因研究提供可靠的依据。
材料和方法
, 百拇医药
1.材料：10例OSF患者均选自湖南医科大学口腔系门诊1996～1997年间收治的患者，男9例，女1例，平均年龄为31.0岁，病程1个月～5年。5例正常对照取自无槟榔、烟、酒嗜好,身体健康的自愿者，男4例，女1例，平均年龄24.8岁(表1)。所有标本均取口腔颊粘膜组织，平均分为2份，1份用10%甲醛固定，常规石蜡包埋，切片作HE染色以核实病理诊断，另1份固定于4℃多聚甲醛-戊二醛混合固定液中，拟作免疫电镜观察。
2.方法：采用美国Peninsula Laboratories公司的兔抗人ET-1抗体和武汉博士德公司的SABC试剂盒，显色剂购自DAKO公司。取OSF病变组早期7例，中期2例，晚期1例，共10例标本，正常对照组5例标本，采用包埋前染色方法。新鲜的口腔粘膜切成5 mm×5 mm×1 mm大小，固定于0.5%多聚甲醛-戊二醛混合固定液中8 h～1个月。具体步骤如下：①组织制成15～30 μm厚的切片，浸泡于含蔗糖的PBS液中5 min，3次；②0.1%胰酶消化30 min,PBS漂洗5 min，3次；③10%正常羊血清，孵育1～1.5 h；④1∶500 ET-1抗体,4℃ 36 h,PBS浸泡5 min，3次；⑤1∶100生物素标记的羊抗兔IgG作用4℃ 1 h,PBS浸泡5 min，3次；⑥1∶100 SABC试剂,37℃ 30 min,PBS浸泡5 min，3次；⑦0.04%DAB-H2O2液显色10 min，PBS浸泡5 min，3次；⑧1%锇酸后固定4℃ 1 h；⑨丙酮梯度脱水；⑩Epon812包埋；B11光镜下半薄切片定位后LKB超薄切片机制片；B12Hitachi-H-600(日本)透射电镜观察。为避免铅颗粒与阳性颗粒混淆，对照及病变组样品均不做硝酸铅、醋酸铀双重染色。每例均用PBS代替ET-1作替代对照。
, 百拇医药
表1 口腔粘膜下纤维化及正常对照组的组织标本来源 组别
例数
年龄
(岁)
性别
嚼槟榔史
(年)
吸烟史
(年)
病程
(年)
病理
分期
, 百拇医药
口腔粘膜下
1
28
女
2
3
1/2
早期
纤维化
2
26
男
5
6
, http://www.100md.com
3
早期
3
22
男
1
5
1/12
早期
4
39
男
6
8
, 百拇医药
5 /12
早期
5
35
男
2
9
1/2
中期
6
27
男
3
0
, 百拇医药
1
中期
7
36
男
11
0
5
晚期
8
35
男
6
8
, http://www.100md.com
1/2
早期
9
32
男
1
10
1/2
早期
10
30
男
1
0
, 百拇医药
5/12
早期
正常对照
1
22
女
0
0
0
-
2
23
男
0
, http://www.100md.com
0
0
-
3
27
男
0
0
0
-
4
25
男
0
, 百拇医药
0
0
-
5
27
男
0
0
0
-
结果
免疫电镜发现,ET-1免疫阳性颗粒主要定位于OSF组织的上皮细胞、成纤维细胞及血管内皮细胞的胞浆内。正常及替代对照未见ET-1阳性颗粒(图1～3)。
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OSF组织中，上皮细胞胞浆内的ET-1免疫阳性颗粒密集而清晰，主要定位于上皮细胞的细胞膜上，胞浆内的阳性颗粒可能定位于粗面内质网、线粒体上(图4)。成纤维细胞胞浆内的免疫阳性颗粒细而密，主要定位于线粒体、粗面内质网和细胞膜上(图5)。毛细血管内皮细胞胞浆内的免疫阳性颗粒数量较少(图6)。
讨论
我们用免疫组化和图像分析技术发现，ET-1在OSF组织有超量表达，阳性产物主要分布于上皮棘细胞、基底细胞、间质成纤维细胞及血管内皮细胞的胞浆胞膜上，提示ET-1可能参与了OSF的纤维化过程[2]。我们以更先进的免疫电镜技术获得了ET-1在OSF组织中的超微结构定位，进一步支持了ET-1与OSF病变之间的潜在关系，为深入研究ET-1在OSF病因机制中的作用奠定了基础。
本研究发现，OSF组织中上皮细胞胞浆内存在密集的ET-1阳性颗粒，此阳性颗粒可能定位于粗面内质网、线粒体上。Zamora等[3]用放射免疫法及Northern杂交证实了体外培养的角朊细胞能合成、分泌ET-1。然而,Hideyuki等[4]免疫电镜研究表明，ET-1大量存在于系统硬皮病皮肤的成纤维细胞、血管内皮细胞的胞浆内，角朊细胞内未发现阳性颗粒。这是否提示同为纤维化疾病的两者之间，其病因在分子水平上存在差异？OSF是一种局限性硬皮病，以口腔粘膜硬化、张口受限为主要病变特征，与嚼槟榔有密切关系[5]。本研究中的患者均有不同程度的嚼槟榔史，槟榔有效成分及石灰等添加剂的直接化学刺激可使上皮细胞发生改变，表面受体被激活，分泌产生转化生长因子β1(transforming growth fator-β1,TGF-β1)[6]、ET-1等活性物质，这些物质又进一步作用于成纤维细胞，诱导胶原沉积而导致口腔粘膜纤维化。而且，上皮细胞膜上可见排列密集的ET-1颗粒，提示OSF中上皮细胞除了自分泌ET-1外，可能还存在大量的ET-1受体，能接受其他来源的ET-1而引发细胞内的一系列生物效应，具体机制尚需进一步研究加以证实。
, 百拇医药
更重要的是，本研究发现，OSF中成纤维细胞的粗面内质网、线粒体及细胞膜上存在ET-1颗粒。这与Hideyuki等[4]的报道基本一致。同时，Kawaguchi等[7]也证实体外培养的皮肤成纤维细胞能自身合成分泌ET-1，其膜上亦表达ET-1受体的mRNA。OSF中，ET-1存在于粗面内质网上提示ET-1可能由成纤维细胞合成，存在于线粒体上提示ET-1与胶原合成的能量供给有关，而存在于膜上则提示ET-1受体的存在。于是，OSF中的成纤维细胞可能自身合成分泌ET-1，也可能接受其他来源(上皮细胞、内皮细胞、血循环等)的ET-1，过量的ET-1与其他细胞因子协同作用，可加速成纤维细胞的增殖分化，影响胶原合成降解代谢而作为一种中间介质参与了OSF的纤维化过程。
Lerman等[8]研究表明,ET由损伤的内皮细胞大量释放，又反馈地损伤血管,它是血管损伤程度的一种标志物。以往研究也证实了OSF微血管病变的存在[9]，但免疫电镜下血管内皮细胞内ET-1免疫阳性颗粒较少，其表达程度弱于上皮细胞和成纤维细胞。刘蜀凡等[10]研究证明，OSF组织中内皮细胞内吞噬小泡明显增多，其大量的存在是细胞内活动力高的表现，它将血浆等物质以胞饮形式迅速转运至血管外，发生基质水肿、胶原纤维堆积等一系列病变。这样，进入内皮细胞的外源性ET-1可能因快速的胞饮作用明显减少，并且内源性ET-1也有可能被高动力的吞噬小泡快速运出细胞外，故可检测出的ET-1颗粒极少。值得一提的是，Johannessen电镜下并未发现内皮细胞内含高密度的ET-1分泌颗粒，故有人推测，ET的分泌调节是在转录和翻译水平进行的，而不是调节其释放过程[1]。
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本研究显示,ET-1在OSF组织中的上皮细胞、成纤维细胞及血管内皮细胞中异常表达,该结果支持ET-1在OSF形成过程中的致病作用这一观点。尤其ET-1在OSF组织成纤维细胞中表达显著高于正常对照,提示了ET-1对成纤维细胞的胶原合成可能起重要作用，特别是ET-1在OSF组织上皮细胞中表达显著高于正常对照,提示了ET-1可能与槟榔及其相关成分对上皮细胞的直接刺激有关，而ET-1在OSF组织血管内皮细胞中表达的增强，从分子水平证实了OSF微血管病变的存在。
图1 正常口腔粘膜的上皮棘细胞内未发现免疫阳性物质(SABC×8 000)
图2 正常口腔粘膜的成纤维细胞内未见免疫阳性物质(SABC×10 000)
, 百拇医药
图3 正常口腔粘膜的毛细血管内皮细胞未见免疫阳性颗粒(SABC×6 000)
图4 密集的免疫阳性颗粒存在于OSF上皮棘细胞的胞浆内，该阳性颗粒主要分布于细胞膜上(↑)，胞浆内阳性颗粒可能分布于粗面内质网(△)、线粒体上(.)(SABC×8 000)
图5 细密的免疫阳性颗粒定位于OSF组织的成纤维细胞的粗面内质网(△)、线粒体(.)、细胞膜上(↑)(SABC×10 000)
图6 免疫阳性颗粒存在于OSF组织毛细血管内皮细胞的胞浆内(↑)(SABC×8 000)
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基金项目：湖南省科委发展基金资助项目(99ssy2002-14)
参考文献
1，Yanagisawa M,Kurihara H,Kimura S,et al.A novel potent vasoconstrictor peptide produced by vascular endothelial cells.Nature,1988，332:411-415.
2，许春姣，彭解英，刘蜀凡，等.内皮素1在口腔粘膜下纤维性变中的表达水平.临床口腔医学杂志,1999,15：41-44.
3，Zamora M,Morelli JG,Norris DA,et al.Culrured human keratinocytes synthesize and secrete endothelin-1.J Invest Dermatol,1992,98:646.
, 百拇医药
4，Hideyuki T,Akio Y,Soji Y,et al.Cutaneous Localization of endothelin-1 in patients with systemic sclerosis:immunoelectron microscopic study.Int J Dermat,1997,36:272-275.
5，Murti PR,Bhonsle RB,Cupta PC,et al.Etiology of oral submucous fibrosis with special reference to the role of area nut chewing.J Oral Pathol Med,1995,24:145-152.
6，高义军，凌天牖，吴汉江,等 .口腔粘膜下纤维性变组织中转化生长因子β1mRNA表达水平.华西口腔医学杂志,1996，14：20-22.
, 百拇医药
7，Kawaguchi Y,Suzuki K,Hara M,et al.Increased endothelin-1 production in fibroblasts derived from patients with systemic sclerosis.Ann Rheum Dis,1994,53:506-510.
8，Lerman A,Edwards BS,Hallett JW,et al.Circulating and tissue endothelin immunoreactivity in advanced atherosclerosis.N Engl J Med,1991,325:997-1001.
9，翦新春，刘蜀凡，沈子华,等.口腔粘膜下纤维性变的组织病理学观察.中华口腔医学杂志，1988,23：11-13.
10，刘蜀凡，沈子华，彭隆祥,等.口腔粘膜下纤维性变中毛细血管损伤的超微结构研究.中华口腔医学杂志，1999，34：111.
(收稿日期：1999-09-15), 百拇医药
单位：许春姣(湖南医科大学附属湘雅医院口腔科 长沙，410008)；彭解英(湖南医科大学附属湘雅医院口腔科 长沙，410008)；刘蜀凡(湖南医科大学附属湘雅医院口腔科 长沙，410008)；方厂云(湖南医科大学附属湘雅医院口腔科 长沙，410008)；彭隆祥(湖南医科大学电镜室)；徐锡萍(湖南医科大学电镜室)
关键词：内皮缩血管肽1；口腔粘膜下纤维化；显微镜检查，免疫电子
中华口腔医学杂志000317 【摘要】目的 观察内皮素1(endothelin-1,ET-1)在人口腔粘膜下纤维化(oral submucous fibrosis，OSF)组织中的形态学定位，并探讨ET-1与OSF病变的关系。方法 用免疫电镜技术检测ET-1在OSF组织中的超微结构定位。结果 ET-1免疫阳性颗粒主要存在于OSF组织的上皮细胞、成纤维细胞及内皮细胞的胞浆内。正常口腔粘膜组织中未发现ET-1免疫阳性颗粒。OSF组织中，上皮细胞内的ET-1阳性颗粒定位于细胞膜上，胞浆内的阳性颗粒可能定位于粗面内质网、线粒体上，成纤维细胞内的阳性颗粒定位于线粒体、粗面内质网和细胞膜上。内皮细胞内的阳性颗粒较少。结论 ET-1可能为OSF的病因因素之一。
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Localization of endothelin-1 in biopsies from oral submucous fibrosis:immunoelectron microscopic study
XÜ Chunjiao,PENG Xieying,LIU Shufan,et al.
(Department of Stomatology,Xiangya Hospital,Hunan Medical University,Changsha 410008，China)
【Abstract】Objective To determine the endothelin-1 ( ET-1)immunoreactivity in biopsies from human oral submucous fibrosis (OSF)and to investigate the relation between ET-1 and OSF.Methods The localization of ET-1 in biopsies from OSF was observed with immunoelectron microscopic techniques.Results High-density deposits existed predominantly in the cytoplasm of epithelial cells,fibroblasts and endothelial cells,but not found in the biopsies of normal controls.In the biopsies of OSF,high-density granules were lined on the cell membrane,possibly on the rough endoplsamic reticulum and the mitochondria of the epithelial cells and of the fibroblasts.But a few granules were seen in the cytoplasm of the endothelial cells of microvesseles.Conclusion ET-1 is one of the pathogenetic factors of OSF.
, 百拇医药
【Key words】Endothelin-1；Oral submucous fibrosis；Microscopy，immunoelectron
1988年，Yanagisawa等[1]从培养的猪主动脉内皮细胞中分离并序列化一种作用强大的血管收缩肽——内皮素1(endothelin-1,ET-1)，这是迄今所知最强的缩血管因子,它除了参与心血管功能的调节外，还具有多重生物学效应。已有报道表明，ET-1在OSF组织中的表达水平显著高于正常对照,提示ET-1在OSF的纤维化和胶原堆积过程中可能起重要作用[2]。我们首次应用链霉素抗生素蛋白的过氧化物酶(streptavidin biotin-peroxidae complex,SABC)的免疫电镜技术，对ET-1在OSF组织中的分布进行超微水平定位,并探讨其在OSF组织中的异常表达及意义,为OSF的病因研究提供可靠的依据。
材料和方法
, 百拇医药
1.材料：10例OSF患者均选自湖南医科大学口腔系门诊1996～1997年间收治的患者，男9例，女1例，平均年龄为31.0岁，病程1个月～5年。5例正常对照取自无槟榔、烟、酒嗜好,身体健康的自愿者，男4例，女1例，平均年龄24.8岁(表1)。所有标本均取口腔颊粘膜组织，平均分为2份，1份用10%甲醛固定，常规石蜡包埋，切片作HE染色以核实病理诊断，另1份固定于4℃多聚甲醛-戊二醛混合固定液中，拟作免疫电镜观察。
2.方法：采用美国Peninsula Laboratories公司的兔抗人ET-1抗体和武汉博士德公司的SABC试剂盒，显色剂购自DAKO公司。取OSF病变组早期7例，中期2例，晚期1例，共10例标本，正常对照组5例标本，采用包埋前染色方法。新鲜的口腔粘膜切成5 mm×5 mm×1 mm大小，固定于0.5%多聚甲醛-戊二醛混合固定液中8 h～1个月。具体步骤如下：①组织制成15～30 μm厚的切片，浸泡于含蔗糖的PBS液中5 min，3次；②0.1%胰酶消化30 min,PBS漂洗5 min，3次；③10%正常羊血清，孵育1～1.5 h；④1∶500 ET-1抗体,4℃ 36 h,PBS浸泡5 min，3次；⑤1∶100生物素标记的羊抗兔IgG作用4℃ 1 h,PBS浸泡5 min，3次；⑥1∶100 SABC试剂,37℃ 30 min,PBS浸泡5 min，3次；⑦0.04%DAB-H2O2液显色10 min，PBS浸泡5 min，3次；⑧1%锇酸后固定4℃ 1 h；⑨丙酮梯度脱水；⑩Epon812包埋；B11光镜下半薄切片定位后LKB超薄切片机制片；B12Hitachi-H-600(日本)透射电镜观察。为避免铅颗粒与阳性颗粒混淆，对照及病变组样品均不做硝酸铅、醋酸铀双重染色。每例均用PBS代替ET-1作替代对照。
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表1 口腔粘膜下纤维化及正常对照组的组织标本来源 组别
例数
年龄
(岁)
性别
嚼槟榔史
(年)
吸烟史
(年)
病程
(年)
病理
分期
, 百拇医药
口腔粘膜下
1
28
女
2
3
1/2
早期
纤维化
2
26
男
5
6
, http://www.100md.com
3
早期
3
22
男
1
5
1/12
早期
4
39
男
6
8
, 百拇医药
5 /12
早期
5
35
男
2
9
1/2
中期
6
27
男
3
0
, 百拇医药
1
中期
7
36
男
11
0
5
晚期
8
35
男
6
8
, http://www.100md.com
1/2
早期
9
32
男
1
10
1/2
早期
10
30
男
1
0
, 百拇医药
5/12
早期
正常对照
1
22
女
0
0
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2
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男
0
, http://www.100md.com
0
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27
男
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男
0
, 百拇医药
0
0
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5
27
男
0
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结果
免疫电镜发现,ET-1免疫阳性颗粒主要定位于OSF组织的上皮细胞、成纤维细胞及血管内皮细胞的胞浆内。正常及替代对照未见ET-1阳性颗粒(图1～3)。
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OSF组织中，上皮细胞胞浆内的ET-1免疫阳性颗粒密集而清晰，主要定位于上皮细胞的细胞膜上，胞浆内的阳性颗粒可能定位于粗面内质网、线粒体上(图4)。成纤维细胞胞浆内的免疫阳性颗粒细而密，主要定位于线粒体、粗面内质网和细胞膜上(图5)。毛细血管内皮细胞胞浆内的免疫阳性颗粒数量较少(图6)。
讨论
我们用免疫组化和图像分析技术发现，ET-1在OSF组织有超量表达，阳性产物主要分布于上皮棘细胞、基底细胞、间质成纤维细胞及血管内皮细胞的胞浆胞膜上，提示ET-1可能参与了OSF的纤维化过程[2]。我们以更先进的免疫电镜技术获得了ET-1在OSF组织中的超微结构定位，进一步支持了ET-1与OSF病变之间的潜在关系，为深入研究ET-1在OSF病因机制中的作用奠定了基础。
本研究发现，OSF组织中上皮细胞胞浆内存在密集的ET-1阳性颗粒，此阳性颗粒可能定位于粗面内质网、线粒体上。Zamora等[3]用放射免疫法及Northern杂交证实了体外培养的角朊细胞能合成、分泌ET-1。然而,Hideyuki等[4]免疫电镜研究表明，ET-1大量存在于系统硬皮病皮肤的成纤维细胞、血管内皮细胞的胞浆内，角朊细胞内未发现阳性颗粒。这是否提示同为纤维化疾病的两者之间，其病因在分子水平上存在差异？OSF是一种局限性硬皮病，以口腔粘膜硬化、张口受限为主要病变特征，与嚼槟榔有密切关系[5]。本研究中的患者均有不同程度的嚼槟榔史，槟榔有效成分及石灰等添加剂的直接化学刺激可使上皮细胞发生改变，表面受体被激活，分泌产生转化生长因子β1(transforming growth fator-β1,TGF-β1)[6]、ET-1等活性物质，这些物质又进一步作用于成纤维细胞，诱导胶原沉积而导致口腔粘膜纤维化。而且，上皮细胞膜上可见排列密集的ET-1颗粒，提示OSF中上皮细胞除了自分泌ET-1外，可能还存在大量的ET-1受体，能接受其他来源的ET-1而引发细胞内的一系列生物效应，具体机制尚需进一步研究加以证实。
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更重要的是，本研究发现，OSF中成纤维细胞的粗面内质网、线粒体及细胞膜上存在ET-1颗粒。这与Hideyuki等[4]的报道基本一致。同时，Kawaguchi等[7]也证实体外培养的皮肤成纤维细胞能自身合成分泌ET-1，其膜上亦表达ET-1受体的mRNA。OSF中，ET-1存在于粗面内质网上提示ET-1可能由成纤维细胞合成，存在于线粒体上提示ET-1与胶原合成的能量供给有关，而存在于膜上则提示ET-1受体的存在。于是，OSF中的成纤维细胞可能自身合成分泌ET-1，也可能接受其他来源(上皮细胞、内皮细胞、血循环等)的ET-1，过量的ET-1与其他细胞因子协同作用，可加速成纤维细胞的增殖分化，影响胶原合成降解代谢而作为一种中间介质参与了OSF的纤维化过程。
Lerman等[8]研究表明,ET由损伤的内皮细胞大量释放，又反馈地损伤血管,它是血管损伤程度的一种标志物。以往研究也证实了OSF微血管病变的存在[9]，但免疫电镜下血管内皮细胞内ET-1免疫阳性颗粒较少，其表达程度弱于上皮细胞和成纤维细胞。刘蜀凡等[10]研究证明，OSF组织中内皮细胞内吞噬小泡明显增多，其大量的存在是细胞内活动力高的表现，它将血浆等物质以胞饮形式迅速转运至血管外，发生基质水肿、胶原纤维堆积等一系列病变。这样，进入内皮细胞的外源性ET-1可能因快速的胞饮作用明显减少，并且内源性ET-1也有可能被高动力的吞噬小泡快速运出细胞外，故可检测出的ET-1颗粒极少。值得一提的是，Johannessen电镜下并未发现内皮细胞内含高密度的ET-1分泌颗粒，故有人推测，ET的分泌调节是在转录和翻译水平进行的，而不是调节其释放过程[1]。
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本研究显示,ET-1在OSF组织中的上皮细胞、成纤维细胞及血管内皮细胞中异常表达,该结果支持ET-1在OSF形成过程中的致病作用这一观点。尤其ET-1在OSF组织成纤维细胞中表达显著高于正常对照,提示了ET-1对成纤维细胞的胶原合成可能起重要作用，特别是ET-1在OSF组织上皮细胞中表达显著高于正常对照,提示了ET-1可能与槟榔及其相关成分对上皮细胞的直接刺激有关，而ET-1在OSF组织血管内皮细胞中表达的增强，从分子水平证实了OSF微血管病变的存在。
图1 正常口腔粘膜的上皮棘细胞内未发现免疫阳性物质(SABC×8 000)
图2 正常口腔粘膜的成纤维细胞内未见免疫阳性物质(SABC×10 000)
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图3 正常口腔粘膜的毛细血管内皮细胞未见免疫阳性颗粒(SABC×6 000)
图4 密集的免疫阳性颗粒存在于OSF上皮棘细胞的胞浆内，该阳性颗粒主要分布于细胞膜上(↑)，胞浆内阳性颗粒可能分布于粗面内质网(△)、线粒体上(.)(SABC×8 000)
图5 细密的免疫阳性颗粒定位于OSF组织的成纤维细胞的粗面内质网(△)、线粒体(.)、细胞膜上(↑)(SABC×10 000)
图6 免疫阳性颗粒存在于OSF组织毛细血管内皮细胞的胞浆内(↑)(SABC×8 000)
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基金项目：湖南省科委发展基金资助项目(99ssy2002-14)
参考文献
1，Yanagisawa M,Kurihara H,Kimura S,et al.A novel potent vasoconstrictor peptide produced by vascular endothelial cells.Nature,1988，332:411-415.
2，许春姣，彭解英，刘蜀凡，等.内皮素1在口腔粘膜下纤维性变中的表达水平.临床口腔医学杂志,1999,15：41-44.
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(收稿日期：1999-09-15), 百拇医药