组织蛋白酶D在涎腺腺样囊性癌表达的研究
作者：彭歆 俞光岩 高岩 武登诚
单位：彭歆(北京医科大学口腔医学院口腔颌面外科 100081)；俞光岩(北京医科大学口腔医学院口腔颌面外科 100081) 高岩(病理科) 武登诚(病理科)
关键词：涎腺肿瘤；癌，腺样囊性；组织蛋白酶D；免疫组织化学
中华口腔医学杂志000314
【摘要】目的 探讨组织蛋白酶D(cathepsin-D，Cath-D)与涎腺腺样囊性癌(salivary adenoid cystic carcinoma,SACC)预后的关系。方法 采用免疫组织化学链亲和素法分析52例SACC的Cath-D表达，并统计学分析Cath-D与SACC病理学分型、临床分期、局部复发、远处转移和患者生存率的关系。结果 Cath-D表达与SACC病理学分型、局部复发和患者生存率无明显相关(P>0.05)，而与临床分期和远处转移呈正相关关系(P<0.05)。结论 Cath-D能通过溶解基底膜、细胞外间质和结缔组织，从而促进SACC的远处转移；Cath-D可作为预后指标来预测SACC的远处转移，指导临床治疗。
, 百拇医药
The expression of cathepsin-D in salivary adenoid cystic carcinoma
PENG Xin,YU Guangyan,GAO Yan,et al.
(Department of Oral Maxillofacial Surgery,School of Stomatology,Beijing Medical University，Beijing 100081,China)
【Abstract】Objective To investigate the relationship between Cathepsin-D(Cath-D) and the prognosis of patients with salivary adenoid cystic carcinoma (SACC).Methods The immunoactivity of Cath-D of 52 cases with SACC was determined by immunohistochemistry method (Streptavidin-Biotin method).The relationship between Cath-D and the histological type,clinical stage,local recurrence,distant metastasis of the tumor and survival rate of the patients with SACC were analysed.Results Statistical analysis showed that the expression levels of Cath-D were correlated positively with distant metastasis potential and clinical stage (P<0.05),and had no significant relation with histological type,local recurrence and survival rate (P>0.05).Conclusions Cath-D can facilitate invasiveness and distant metastasis of SACC;evaluation of Cath-D can act as a predictor of distant metastasis of SACC and direct the clinical treatment.
, 百拇医药
【Key words】Salivary gland neoplasms;Carcinoma,adenoid cystic;Cathepsin D;Immunohistochemistry
涎腺腺样囊性癌(salivary adenoid cystic carcinoma,SACC)是涎腺最常见的恶性肿瘤之一，具有很强的浸润性和远处转移力，手术切除后常有局部复发和远处转移，其远处转移率在口腔颌面部恶性肿瘤中居首[1]。
组织蛋白酶D(cathepsin-D，Cath-D)是溶酶体中天冬氨酸肽链内切酶，参与基底膜的降解，有助于肿瘤细胞对基底膜及间质蛋白的溶解突破，促进肿瘤的远处转移[2]。
我们应用免疫组织化学方法，对Cath-D在SACC中的表达及分布特征进行研究，探讨SACC远处转移的机制及Cath-D检测对临床的指导意义。
, 百拇医药
材料和方法
1.临床资料及组织标本：
(1)1970～1995年间，在北京医科大学口腔医学院口腔颌面外科手术治疗原发病变，并有完好蜡块保存的SACC 52例，男性28例，女性24例；年龄19～72岁(中位年龄为43.0岁)；全部病例均经病理证实为SACC。根据国际抗癌联盟(UICC) 1992年涎腺癌、口腔癌和上颌窦癌的国际TNM分类及分期标准对52例进行TNM分类及临床分期，其中Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期的病例数分别为9、21、15和7例。所有患者均经5年以上的临床随访，最长随访时间达25年，平均随访时间为8.1年。根据X线片、B超等辅助检查确定有无肺、肝、骨等的SACC远处转移；根据临床检查及病理诊断确定肿瘤有无局部复发。
(2)采用52例患者的术后肿瘤组织标本，常规10%甲醛固定，石蜡包埋。
2.实验试剂和方法：兔抗人Cath-D多克隆抗体；生物素连接的兔抗小鼠免疫球蛋白；过氧化物酶链亲和素(丹麦DAKO公司产品)。采用链亲和素法行免疫组织化学研究。
, 百拇医药
3.阳性标准：染色强度分4级：阴性(-)：肿瘤细胞核或浆中无着色；弱阳性(+)：肿瘤细胞核或浆中出现浅黄色染色颗粒；阳性(++)：肿瘤细胞核或浆中出现棕黄色染色颗粒；强阳性(+++)：肿瘤细胞核或浆中出现深棕色染色颗粒。
4.统计方法：χ2检验和秩和检验用于分析Cath-D免疫组化反应与SACC病理分型、临床分期、局部复发和远处转移的关系；不同组别生存率的统计学分析应用log rank检验。
结果
1.Cath-D在SACC的表达：在52例中，Cath-D阳性反应为29例，其中(+)、(++)和(+++)分别为23、4和2例，总体阳性率为55.8%。阳性细胞见于SACC各病理分型，肌上皮细胞和腺上皮细胞均可见阳性反应，并可见神经纤维和血管被Cath-D阳性的上皮条索或上皮团块包绕，在肿瘤浸润前沿也可见Cath-D的阳性表达。细胞浆阳性着色，呈不均匀颗粒状，细胞膜及细胞核均为阴性反应。阳性着色也可在间质中出现，为散在点状或灶性分布。
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2.Cath-D表达与SACC组织病理学分型及临床分期的关系：根据WHO 1991年涎腺肿瘤组织病理学分类标准，将SACC分为腺样型(筛孔状)、小管型和实体型。52例中，3种病理学分型的Cath-D阳性表达率分别为47.8%(11/23)、60.0%(15/25)和75.0%(3/4)，秩和检验表明，3组间差异无显著性(P=0.470 1,>0.05)(表1)。
从临床分期来看，Ⅰ+Ⅱ期和Ⅲ+Ⅳ期的Cath-D阳性表达率分别为43.3%(13/24)和72.7%(16/22)，后者明显高于前者，χ2检验表明，两组间差异有显著性(P=0.035，<0.05)。
3.Cath-D表达与SACC远处转移、局部复发和患者生存率的关系：52例中，20例出现了SACC的肺、肝、骨远处转移，远处转移率为38.5%。转移组的Cath-D阳性表达率为75.0%(15/20)，无转移组为43.8%(14/32)，转移组明显高于无转移组，经统计学分析，两组间差异有显著性(P=0.027 3，<0.05)。
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表1 SACC的Cath-D免疫组化反应与
组织学分型、临床分期、远处转移及局部复发的关系 项目
例数
Cath-D
阳性例数(%)
P值
组织学分型
腺样型
23
11(47.8)
管状型
25
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15(60.0)
0.470 1
实体型
4
3(75.0)
临床分期
I+II
30
13(43.3)
III+IV
22
16(72.7)
0.035 0*
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远处转移
有转移
20
15(75.0)
无转移
32
14(43.8)
0.027 3*
局部复发
有复发
28
17(60.7)
无复发
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24
12(50.0)
0.438 0
注：SACC：涎腺腺样囊性癌；Cath-D：组织蛋白酶D；*P<0.05
52例中，28例出现了局部复发，局部复发率为53.8%。复发组与无复发组Cath-D阳性表达率分别为60.7%(17/28)和50.0%(12/24)，经统计学分析，两组间差异无显著性(P=0.438 0，>0.05)。
52例按照Cath-D免疫组化反应分为表达阳性组(29例)和表达阴性组(23例)，依据随访资料计算两组的3年、5年、10年生存率分别为76.67%、70.00%、55.15%和85.00%、75.00%、60.00%，经统计学分析，两组间差异无显著性(P>0.1)(图1)。
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图1 Cath-D表达与涎腺腺样囊性癌患者生存率的关系
讨论
一、Cath-D与SACC的远处转移
本研究首次对Cath-D与SACC预后的关系进行了研究，结果表明：Cath-D在转移组和无转移组的阳性表达率分别为75.0%和43.8%，两者差异具有显著性，Cath-D表达与SACC远处转移成正相关关系。这与Kute等[3]对乳腺癌的研究结果相一致，但Henry等[4]应用免疫组化方法对94例乳腺癌研究表明：Cath-D阳性表达患者具有更高的生存率，因而Cath-D是预测良好预后的指标。本研究结果支持Cath-D能促进肿瘤转移这一观点，并证实了Cath-D在SACC远处转移中的作用。在肿瘤浸润前沿及神经纤维及血管周围可见Cath-D阳性的瘤细胞团块或条索，肿瘤间质中也可见到Cath-D阳性表达，这更进一步证实了Cath-D阳性的癌细胞能通过基底膜降解实现局部侵袭和远处转移[5，6]。
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Cath-D是一种蛋白水解酶，可溶解基底膜、细胞外基质和结缔组织。基底膜的降解在肿瘤转移过程中是一重要环节，这一环节的突破使得肿瘤细胞更易进入血液循环，并在远隔部位形成转移灶。Cath-D可促进癌细胞生长，提高了肿瘤的侵袭力，从而促进肿瘤的远处转移。
二、Cath-D免疫组织化学研究的临床意义
本研究将Cath-D免疫组化反应分别与病理分型、临床分期、局部复发、远处转移和生存率进行统计学分析，以探讨Cath-D对SACC预后的指导意义。结果表明：Cath-D与远处转移和临床分期具有显著相关性(P<0.05)，而与病理分型、局部复发和生存率的关系无统计学意义(P>0.05)。这与Tandon等[5]的研究结果相似。
Cath-D与肿瘤临床分期的关系具有统计学意义说明：肿瘤在发展过程中，其生物学行为也发生变化，晚期肿瘤(Ⅲ、Ⅳ期)较早期肿瘤(Ⅰ、Ⅱ期)蛋白水解酶的作用更为明显，基底膜的降解更为显著，肿瘤的侵袭性更强，更易出现远处转移。Cath-D阳性反应与SACC远处转移呈明显正相关关系，这表明Cath-D是影响SACC远处转移的重要因素，Cath-D可作为临床预后指标来预测SACC的远处转移。
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Cath-D染色反应在SACC 3种分型中无明显差异，表明Cath-D的表达并不受病理分型的影响。由于影响局部复发的因素很多，故无法单一从Cath-D能增强癌细胞局部侵袭力这一方面来说明Cath-D与局部复发的必然联系。
对于生存率的分析，虽然Cath-D阴性表达组略高于阳性表达组，但两组间并无统计学意义，这与Kute等[3]的乳腺癌的研究结果不一致。对其可解释为：SACC较乳腺癌等有其特殊性，前者常见的肺部转移瘤通常生长缓慢，患者常带瘤生存[1]，故生存率这一指标不很敏感。
SACC的远处转移不是由单一因素决定的，可能是多种基因的调控、肿瘤细胞本身的内因及其所处的机体内环境等多种因素影响的结果，其转移发生的机制还需更深入的研究和探讨。
基金项目：国家自然科学基金资助项目(39270723)
, http://www.100md.com
参考文献
1，俞光岩.涎腺疾病.第1版.北京：北京医科大学中国协和医科大学联合出版社,1994.163-170.
2，Garcia M,Derocq D,Pujol P,et al.Overexpression of transfected cathepsin D in transformed cells increases their malignant phenotype and metastatic potency.Oncogene,1990,5 :1809-1814.
3，Kute TE,Shao ZM,Sugg NK,et al.Cathepsin D as a prognostic indicator for node-negative breast cancer patients using both immunoassays and enzymatic assays.Cancer Res,1992,52:5198-5203.
, 百拇医药
4，Henry JA,McCarthy AL,Angus B,et al.Prognostic significance of the estrogen-regulated protein,cathepsin D,in breast cancer.An immunohistochemical study.Cancer,1990,65:265-271.
5，Tandon AK,Clark GM,Chamness GC,et al.Cathepsin D and prognosis in breast cancer.N Engl J Med,1990,322:297-302.
6，Schwartz MK.Tissue cathepsins as tumor markers.Clin Chim Acta,1995,237:67-78.
(收稿日期：1999-03-05), http://www.100md.com
单位：彭歆(北京医科大学口腔医学院口腔颌面外科 100081)；俞光岩(北京医科大学口腔医学院口腔颌面外科 100081) 高岩(病理科) 武登诚(病理科)
关键词：涎腺肿瘤；癌，腺样囊性；组织蛋白酶D；免疫组织化学
中华口腔医学杂志000314
【摘要】目的 探讨组织蛋白酶D(cathepsin-D，Cath-D)与涎腺腺样囊性癌(salivary adenoid cystic carcinoma,SACC)预后的关系。方法 采用免疫组织化学链亲和素法分析52例SACC的Cath-D表达，并统计学分析Cath-D与SACC病理学分型、临床分期、局部复发、远处转移和患者生存率的关系。结果 Cath-D表达与SACC病理学分型、局部复发和患者生存率无明显相关(P>0.05)，而与临床分期和远处转移呈正相关关系(P<0.05)。结论 Cath-D能通过溶解基底膜、细胞外间质和结缔组织，从而促进SACC的远处转移；Cath-D可作为预后指标来预测SACC的远处转移，指导临床治疗。
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The expression of cathepsin-D in salivary adenoid cystic carcinoma
PENG Xin,YU Guangyan,GAO Yan,et al.
(Department of Oral Maxillofacial Surgery,School of Stomatology,Beijing Medical University，Beijing 100081,China)
【Abstract】Objective To investigate the relationship between Cathepsin-D(Cath-D) and the prognosis of patients with salivary adenoid cystic carcinoma (SACC).Methods The immunoactivity of Cath-D of 52 cases with SACC was determined by immunohistochemistry method (Streptavidin-Biotin method).The relationship between Cath-D and the histological type,clinical stage,local recurrence,distant metastasis of the tumor and survival rate of the patients with SACC were analysed.Results Statistical analysis showed that the expression levels of Cath-D were correlated positively with distant metastasis potential and clinical stage (P<0.05),and had no significant relation with histological type,local recurrence and survival rate (P>0.05).Conclusions Cath-D can facilitate invasiveness and distant metastasis of SACC;evaluation of Cath-D can act as a predictor of distant metastasis of SACC and direct the clinical treatment.
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【Key words】Salivary gland neoplasms;Carcinoma,adenoid cystic;Cathepsin D;Immunohistochemistry
涎腺腺样囊性癌(salivary adenoid cystic carcinoma,SACC)是涎腺最常见的恶性肿瘤之一，具有很强的浸润性和远处转移力，手术切除后常有局部复发和远处转移，其远处转移率在口腔颌面部恶性肿瘤中居首[1]。
组织蛋白酶D(cathepsin-D，Cath-D)是溶酶体中天冬氨酸肽链内切酶，参与基底膜的降解，有助于肿瘤细胞对基底膜及间质蛋白的溶解突破，促进肿瘤的远处转移[2]。
我们应用免疫组织化学方法，对Cath-D在SACC中的表达及分布特征进行研究，探讨SACC远处转移的机制及Cath-D检测对临床的指导意义。
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材料和方法
1.临床资料及组织标本：
(1)1970～1995年间，在北京医科大学口腔医学院口腔颌面外科手术治疗原发病变，并有完好蜡块保存的SACC 52例，男性28例，女性24例；年龄19～72岁(中位年龄为43.0岁)；全部病例均经病理证实为SACC。根据国际抗癌联盟(UICC) 1992年涎腺癌、口腔癌和上颌窦癌的国际TNM分类及分期标准对52例进行TNM分类及临床分期，其中Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期的病例数分别为9、21、15和7例。所有患者均经5年以上的临床随访，最长随访时间达25年，平均随访时间为8.1年。根据X线片、B超等辅助检查确定有无肺、肝、骨等的SACC远处转移；根据临床检查及病理诊断确定肿瘤有无局部复发。
(2)采用52例患者的术后肿瘤组织标本，常规10%甲醛固定，石蜡包埋。
2.实验试剂和方法：兔抗人Cath-D多克隆抗体；生物素连接的兔抗小鼠免疫球蛋白；过氧化物酶链亲和素(丹麦DAKO公司产品)。采用链亲和素法行免疫组织化学研究。
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3.阳性标准：染色强度分4级：阴性(-)：肿瘤细胞核或浆中无着色；弱阳性(+)：肿瘤细胞核或浆中出现浅黄色染色颗粒；阳性(++)：肿瘤细胞核或浆中出现棕黄色染色颗粒；强阳性(+++)：肿瘤细胞核或浆中出现深棕色染色颗粒。
4.统计方法：χ2检验和秩和检验用于分析Cath-D免疫组化反应与SACC病理分型、临床分期、局部复发和远处转移的关系；不同组别生存率的统计学分析应用log rank检验。
结果
1.Cath-D在SACC的表达：在52例中，Cath-D阳性反应为29例，其中(+)、(++)和(+++)分别为23、4和2例，总体阳性率为55.8%。阳性细胞见于SACC各病理分型，肌上皮细胞和腺上皮细胞均可见阳性反应，并可见神经纤维和血管被Cath-D阳性的上皮条索或上皮团块包绕，在肿瘤浸润前沿也可见Cath-D的阳性表达。细胞浆阳性着色，呈不均匀颗粒状，细胞膜及细胞核均为阴性反应。阳性着色也可在间质中出现，为散在点状或灶性分布。
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2.Cath-D表达与SACC组织病理学分型及临床分期的关系：根据WHO 1991年涎腺肿瘤组织病理学分类标准，将SACC分为腺样型(筛孔状)、小管型和实体型。52例中，3种病理学分型的Cath-D阳性表达率分别为47.8%(11/23)、60.0%(15/25)和75.0%(3/4)，秩和检验表明，3组间差异无显著性(P=0.470 1,>0.05)(表1)。
从临床分期来看，Ⅰ+Ⅱ期和Ⅲ+Ⅳ期的Cath-D阳性表达率分别为43.3%(13/24)和72.7%(16/22)，后者明显高于前者，χ2检验表明，两组间差异有显著性(P=0.035，<0.05)。
3.Cath-D表达与SACC远处转移、局部复发和患者生存率的关系：52例中，20例出现了SACC的肺、肝、骨远处转移，远处转移率为38.5%。转移组的Cath-D阳性表达率为75.0%(15/20)，无转移组为43.8%(14/32)，转移组明显高于无转移组，经统计学分析，两组间差异有显著性(P=0.027 3，<0.05)。
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表1 SACC的Cath-D免疫组化反应与
组织学分型、临床分期、远处转移及局部复发的关系 项目
例数
Cath-D
阳性例数(%)
P值
组织学分型
腺样型
23
11(47.8)
管状型
25
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15(60.0)
0.470 1
实体型
4
3(75.0)
临床分期
I+II
30
13(43.3)
III+IV
22
16(72.7)
0.035 0*
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远处转移
有转移
20
15(75.0)
无转移
32
14(43.8)
0.027 3*
局部复发
有复发
28
17(60.7)
无复发
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12(50.0)
0.438 0
注：SACC：涎腺腺样囊性癌；Cath-D：组织蛋白酶D；*P<0.05
52例中，28例出现了局部复发，局部复发率为53.8%。复发组与无复发组Cath-D阳性表达率分别为60.7%(17/28)和50.0%(12/24)，经统计学分析，两组间差异无显著性(P=0.438 0，>0.05)。
52例按照Cath-D免疫组化反应分为表达阳性组(29例)和表达阴性组(23例)，依据随访资料计算两组的3年、5年、10年生存率分别为76.67%、70.00%、55.15%和85.00%、75.00%、60.00%，经统计学分析，两组间差异无显著性(P>0.1)(图1)。
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图1 Cath-D表达与涎腺腺样囊性癌患者生存率的关系
讨论
一、Cath-D与SACC的远处转移
本研究首次对Cath-D与SACC预后的关系进行了研究，结果表明：Cath-D在转移组和无转移组的阳性表达率分别为75.0%和43.8%，两者差异具有显著性，Cath-D表达与SACC远处转移成正相关关系。这与Kute等[3]对乳腺癌的研究结果相一致，但Henry等[4]应用免疫组化方法对94例乳腺癌研究表明：Cath-D阳性表达患者具有更高的生存率，因而Cath-D是预测良好预后的指标。本研究结果支持Cath-D能促进肿瘤转移这一观点，并证实了Cath-D在SACC远处转移中的作用。在肿瘤浸润前沿及神经纤维及血管周围可见Cath-D阳性的瘤细胞团块或条索，肿瘤间质中也可见到Cath-D阳性表达，这更进一步证实了Cath-D阳性的癌细胞能通过基底膜降解实现局部侵袭和远处转移[5，6]。
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Cath-D是一种蛋白水解酶，可溶解基底膜、细胞外基质和结缔组织。基底膜的降解在肿瘤转移过程中是一重要环节，这一环节的突破使得肿瘤细胞更易进入血液循环，并在远隔部位形成转移灶。Cath-D可促进癌细胞生长，提高了肿瘤的侵袭力，从而促进肿瘤的远处转移。
二、Cath-D免疫组织化学研究的临床意义
本研究将Cath-D免疫组化反应分别与病理分型、临床分期、局部复发、远处转移和生存率进行统计学分析，以探讨Cath-D对SACC预后的指导意义。结果表明：Cath-D与远处转移和临床分期具有显著相关性(P<0.05)，而与病理分型、局部复发和生存率的关系无统计学意义(P>0.05)。这与Tandon等[5]的研究结果相似。
Cath-D与肿瘤临床分期的关系具有统计学意义说明：肿瘤在发展过程中，其生物学行为也发生变化，晚期肿瘤(Ⅲ、Ⅳ期)较早期肿瘤(Ⅰ、Ⅱ期)蛋白水解酶的作用更为明显，基底膜的降解更为显著，肿瘤的侵袭性更强，更易出现远处转移。Cath-D阳性反应与SACC远处转移呈明显正相关关系，这表明Cath-D是影响SACC远处转移的重要因素，Cath-D可作为临床预后指标来预测SACC的远处转移。
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Cath-D染色反应在SACC 3种分型中无明显差异，表明Cath-D的表达并不受病理分型的影响。由于影响局部复发的因素很多，故无法单一从Cath-D能增强癌细胞局部侵袭力这一方面来说明Cath-D与局部复发的必然联系。
对于生存率的分析，虽然Cath-D阴性表达组略高于阳性表达组，但两组间并无统计学意义，这与Kute等[3]的乳腺癌的研究结果不一致。对其可解释为：SACC较乳腺癌等有其特殊性，前者常见的肺部转移瘤通常生长缓慢，患者常带瘤生存[1]，故生存率这一指标不很敏感。
SACC的远处转移不是由单一因素决定的，可能是多种基因的调控、肿瘤细胞本身的内因及其所处的机体内环境等多种因素影响的结果，其转移发生的机制还需更深入的研究和探讨。
基金项目：国家自然科学基金资助项目(39270723)
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1，俞光岩.涎腺疾病.第1版.北京：北京医科大学中国协和医科大学联合出版社,1994.163-170.
2，Garcia M,Derocq D,Pujol P,et al.Overexpression of transfected cathepsin D in transformed cells increases their malignant phenotype and metastatic potency.Oncogene,1990,5 :1809-1814.
3，Kute TE,Shao ZM,Sugg NK,et al.Cathepsin D as a prognostic indicator for node-negative breast cancer patients using both immunoassays and enzymatic assays.Cancer Res,1992,52:5198-5203.
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5，Tandon AK,Clark GM,Chamness GC,et al.Cathepsin D and prognosis in breast cancer.N Engl J Med,1990,322:297-302.
6，Schwartz MK.Tissue cathepsins as tumor markers.Clin Chim Acta,1995,237:67-78.
(收稿日期：1999-03-05), http://www.100md.com