六亚甲基二乙酰胺对MEC-1细胞体外粘附、移动和侵袭的影响
作者：刘斌 吴军正 司徒镇强 李焰
单位：刘斌(第四军医大学口腔医学院生物学教研室 西安,710032)；吴军正(第四军医大学口腔医学院生物学教研室 西安,710032)；司徒镇强(第四军医大学口腔医学院生物学教研室 西安,710032)；李焰(第四军医大学口腔医学院生物学教研室 西安,710032)
关键词：癌；粘液表皮样；六亚甲基二乙酰胺；侵袭性
中华口腔医学杂志000311 【摘要】目的 研究分化诱导剂六亚甲基二乙酰胺(hexamethylene bisacetamide,HMBA)对人粘液表皮样癌细胞系MEC-1体外粘附、移动和侵袭的影响。方法 用2 mmol/L HMBA体外诱导培养MEC-1细胞,用MTT(thiazalyl blue,噻唑蓝)比色法测定细胞在重构基底膜Matrigel上的粘附,用Millicell-PCF 培养系统测定细胞的移动性和侵袭性。结果 HMBA诱导的MEC-1细胞在30 min和90 min 粘附实验中的粘附率，分别下降了26.81%和31.13%(P<0.05)。HMBA对MEC-1细胞体外移动和侵袭的抑制率分别为63.49%和67.65%(P<0.05)。结论 HMBA对人粘液表皮样癌细胞MEC-1具有抗侵袭作用。
, 百拇医药
Effects of hexamethylene bisacetamide on in vitro adhesion,motility and invasion of human mucoepidermoid carcinoma cell line MEC-1
LIU Bin,WU Junzheng,SITU Zhenqiang,et al.
(Department of Biology,School of Stomatology,Fourth Military Medical University,Xi＇an 710032,China)
【Abstract】Objective To investigate the effects of hexamethylene bisacetamide (HMBA) on the in vitro adhesion,motility and invasion of human mucoepidermoid carcinoma cell line MEC-1.Methods MEC-1 cells were induced with 2 mmol/L of HMBA in vitro,the adhesion of MEC-1 cells to the reconstituted basement membrane Matrigel was investigated with MTT colorimetric assay; the motility and invasion of MEC-1 cells were assayed using biopore membrane Millicell-PCF inserts culture system.Results The adhesion of MEC-1 cells treated with HMBA for 30 min or 90 min reduced by 26.47% and 31.13%,respectively; the motility and invasion of MEC-1 cells treated with HMBA reduced by 63.49% and 67.65%,respectively.Conclusions HMBA has anti-invasion effects on human mucoepidermoid carcinoma cells in vitro.
, 百拇医药
【Key words】Carcinoma mucoepidermoid；Hexamethylene bisacetamide；Invasion
低分化型粘液表皮样癌具有侵袭性强、转移率高和预后差的特点。针对该肿瘤的特点，探索新的抗侵袭方法，将有助于减少肿瘤的侵袭和转移。 我们以往的研究表明,分化诱导剂六亚甲基二乙酰胺( hexamethylene bisacetamide,HMBA)能有效地诱导体外培养的人低分化型粘液表皮样癌细胞系MEC-1及其裸鼠移植瘤向良性方向分化,降低其恶性表型[1,2]。本项研究进一步探讨HMBA对MEC-1细胞体外粘附性、移动性和侵袭性的影响。
材料和方法
1.细胞培养：人低分化型粘液表皮样癌细胞系MEC-1，由我室建立。细胞用含10%胎牛血清的RPMI 1640培养液(美国GIBCO公司),在37℃、5%CO2及饱和湿度环境中培养。
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2.细胞的分化诱导：HMBA(美国Sigma公司),用三蒸水配制为0.5 mol/L 的母液。实验时用培养液稀释至2 mmol/L。0.25%胰蛋白酶消化MEC-1细胞，用含HMBA的培养液体外诱导培养4 d。然后，收集细胞进行以下实验。
3.体外粘附性的测定：参照文献进行[3]。重构基底膜Matrigel(Collaborative Rsearch 公司)，按说明用无血清培养液以1∶8稀释,在96 孔培养板(丹麦NUNC公司)中加入50 μl，无菌吹干；取 HMBA 诱导的和未诱导的MEC-1 细胞100 μl (5×108个/L)分别接种到有及没有Matrigel的96孔板中,培养30 min、90 min后,洗去未粘附细胞,用MTT(thiazalyl blue,噻唑蓝)比色法测定粘附细胞并计算粘附率。
4.体外移动性的测定：参照文献方法稍加改良[4]，用市售的Millicell-PCF塑料培养小室(呈圆桶形，直径12 mm,底部装有聚碳酸酯微孔膜,孔径12 μm,美国Millipore公司出品)测定细胞穿行微孔膜的能力。将Millicell放入24孔培养板(NUNC公司)中,在Millicell内加入100 μl(5×108个/L)的HMBA诱导和未诱导的MEC-1 细胞,在Millicell外室加500 μl起趋化作用的条件培养液(用NIH3T3细胞系制备条件培养液[5])。培养8 h后,取出Millicell,PBS洗涤,3%戊二醛固定,Giemsa染色,用棉签小心擦去微孔膜上层细胞,在倒置显微镜高倍视野(150×)下，计数取景框中移至微孔膜下层的细胞。 每个样本计数10个视野。
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5.体外侵袭性的测定：按上述方法3，在Millicell内微孔膜上铺一层重构基底膜Matrigel，将Millicell放入24孔板中。在Millicell内加入100 μl(5×108个/L)的HMBA 诱导和未诱导的MEC-1细胞,在Millicell外室加500 μl条件培养液，培养20 h后,取出Millicell,按方法4进行固定、染色、 计数[4]。
结果
1. HMBA对MEC-1细胞粘附性的影响： 如表1所示,MEC-1细胞在 重构基底膜Matrigel 上的粘附率明显大于在塑料表面的粘附率。2 mmol/L的HMBA能显著抑制 MEC-1细胞在Matrigel上的粘附,30 min和90 min的粘附率则分别下降了26.81%和31.13%。但对细胞在塑料表面的粘附没有明显影响(90min组),表明HMBA的抗粘附作用具有选择性。
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表1 HMBA对MEC-1细胞体外粘附性的抑制作用(
±s) 分组
细胞粘附率
30 min
90 min
无Matrigel:对照组
0.328 1±0.031 2
0.615 3±0.021 4
HMBA组
0.251 0±0.041 9*
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0.617 6±0.074 2
有Matrigel: 对照组
0.696 7±0.047 3**
0.946 7±0.057 4**
HMBA组
0.428 6±0.131 5*
0.635 4±0.173 5*
注：*与对照组比较，P<0.05(t检验)；**与无Matrigel对照组比较，P<0.05(t检验) 2. HMBA对MEC-1细胞移动性的影响：MEC-1细胞在NIH3T3细胞培养液中趋化因子的作用下,能从Millicell微孔膜的上方移动至膜的下方。从表2结果可见，2 mmol/L的HMBA具有抑制MEC-1细胞移动的能力。
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3.HMBA对MEC-1细胞侵袭性的影响：在Millicell微孔膜表面所铺的重构基底膜Matrigel与机体内的基底膜组分相似， 癌细胞通过分泌基质降解酶分解人工基底膜,才能够穿过微孔膜。如表2所示,2 mmol/L的HMBA对MEC-1 细胞的侵袭性有显著的抑制作用。
表2 HMBA对MEC-1细胞体外移动性和侵袭性的抑制作用 分组
移动实验
侵袭实验
细胞数(±s)
抑制率(%)
细胞数(±s)
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抑制率(%)
对照组
13.23±1.75
0
8.13±2.01
0
HMBA组
4.83±0.12*
63.49
2.63±0.35*
67.65
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注：*t检验结果，与对照组比较，P<0.05讨论
多孔生物膜Millicell培养系统是近年来发展的一项实验技术,用于体外Matrigel侵袭实验。 不仅可用于研究细胞分化和细胞与基质的相互作用,还可用来筛选抗侵袭和抗移动药物。本项实验应用该技术研究,证实分化诱导剂 HMBA对MEC-1细胞体外移动和侵袭行为有明显的抑制作用。
肿瘤侵袭过程分3个阶段: ①肿瘤细胞首先借助其表面特异性受体粘附到基底膜或基质; ②肿瘤细胞通过分泌蛋白酶降解细胞外基质(ECM); ③肿瘤细胞穿过蛋白酶降解的ECM，发生侵袭[6]。癌细胞表面含有丰富的粘附分子如层粘连蛋白(LN)受体,其表达与侵袭转移能力成正相关。与正常上皮细胞相比,癌细胞对富含层粘连蛋白(LN)的基底膜具有更强的粘附性[7]。我们在实验中观察到,富含LN和Ⅳ型胶原等成分的Matrigel能促进MEC-1细胞体外粘附， 而HMBA能选择性抑制癌细胞对Matrigel的粘附。HMBA抑制癌细胞粘附的机理目前尚不清楚，可能与影响癌细胞LN受体表达有关。
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肿瘤细胞的移动性和侵袭性受到多种因素影响,蛋白激酶C(PKC)的激活能增强瘤细胞的移动性和侵袭性[8]。已有研究发现HMBA具有抑制癌细胞PKC活性的作用[9]。本项实验结果显示,HMBA能显著抑制MEC-1细胞的移动性和侵袭性，其机理可能与抑制PKC活性有关。
结合我们以往的研究结果，可以看出分化诱导剂HMBA对MEC-1细胞不仅有显著的诱导分化作用[1,2]，而且有明显的抗粘附、抗移动和抗侵袭作用。这一结果为进一步研究HMBA抗转移治疗提供了实验依据。
基金项目：国家自然科学基金资助项目(39370740)
参考文献
1，陈宇萍,吴军正,司徒镇强,等.人粘液表皮样癌MEC-1细胞HMBA诱导分化的研究.中华口腔医学杂志,1996,31:28-30.
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2，贾保军,司徒镇强,吴军正,等.六亚甲基二乙酰胺对MEC-1细胞裸鼠移植瘤的诱导分化作用.中华口腔医学杂志,1996,31:85-87.
3，韩振国，马长金，Jiang WG，等.肿瘤侵袭抑制因子-2对基因重组肝细胞生长因子诱导的人肺癌细胞运动和侵袭的抑制作用.现代口腔医学杂志，1996,9:106-109.
4，Merzak A,McCrea S,Koochekpour S,et al.Control of human glioma cell growth,migration and invasion in vitro by transforming growth factor β1.Br J Cancer,1994,74:199-203.
5，周可祥，吴秉铨，郑杰，等.TIMP-基因转染对人肺巨细胞癌细胞系生物学行为的影响.中华医学杂志,1994,74:420-405.
, 百拇医药
6，DeClerck YV,Yean TD,Chan D,et al.Inhibiton of tumor invasion of smooth muscle cell layers by recombinant human metalloproteinase inhibitor.Cancer Res,1991,51:2151-2157.
7，Zhang K,Kim JP,Woodley DT,et al.Restricted expreesion and function of la minin 1-binding integrins in normal and malignant oral mucosal keratinocytes.Cell Adhes Commun,1996,4:159-174.
8，Jiang WG,Puntis MC,Hallett MB.Molecular and cellular basis of cancer invasion and metastasis:implications for treatment.Br J Surg,1994,81:1576-1590.
9，谷善青,梁云燕,王跃民,等.环六亚甲基双乙酰胺对胃癌不同细胞周期两条信号系统的调节.生物化学与生物物理进展,1997,24:443-447.
收稿日期：19999-02-06, http://www.100md.com
单位：刘斌(第四军医大学口腔医学院生物学教研室 西安,710032)；吴军正(第四军医大学口腔医学院生物学教研室 西安,710032)；司徒镇强(第四军医大学口腔医学院生物学教研室 西安,710032)；李焰(第四军医大学口腔医学院生物学教研室 西安,710032)
关键词：癌；粘液表皮样；六亚甲基二乙酰胺；侵袭性
中华口腔医学杂志000311 【摘要】目的 研究分化诱导剂六亚甲基二乙酰胺(hexamethylene bisacetamide,HMBA)对人粘液表皮样癌细胞系MEC-1体外粘附、移动和侵袭的影响。方法 用2 mmol/L HMBA体外诱导培养MEC-1细胞,用MTT(thiazalyl blue,噻唑蓝)比色法测定细胞在重构基底膜Matrigel上的粘附,用Millicell-PCF 培养系统测定细胞的移动性和侵袭性。结果 HMBA诱导的MEC-1细胞在30 min和90 min 粘附实验中的粘附率，分别下降了26.81%和31.13%(P<0.05)。HMBA对MEC-1细胞体外移动和侵袭的抑制率分别为63.49%和67.65%(P<0.05)。结论 HMBA对人粘液表皮样癌细胞MEC-1具有抗侵袭作用。
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Effects of hexamethylene bisacetamide on in vitro adhesion,motility and invasion of human mucoepidermoid carcinoma cell line MEC-1
LIU Bin,WU Junzheng,SITU Zhenqiang,et al.
(Department of Biology,School of Stomatology,Fourth Military Medical University,Xi＇an 710032,China)
【Abstract】Objective To investigate the effects of hexamethylene bisacetamide (HMBA) on the in vitro adhesion,motility and invasion of human mucoepidermoid carcinoma cell line MEC-1.Methods MEC-1 cells were induced with 2 mmol/L of HMBA in vitro,the adhesion of MEC-1 cells to the reconstituted basement membrane Matrigel was investigated with MTT colorimetric assay; the motility and invasion of MEC-1 cells were assayed using biopore membrane Millicell-PCF inserts culture system.Results The adhesion of MEC-1 cells treated with HMBA for 30 min or 90 min reduced by 26.47% and 31.13%,respectively; the motility and invasion of MEC-1 cells treated with HMBA reduced by 63.49% and 67.65%,respectively.Conclusions HMBA has anti-invasion effects on human mucoepidermoid carcinoma cells in vitro.
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【Key words】Carcinoma mucoepidermoid；Hexamethylene bisacetamide；Invasion
低分化型粘液表皮样癌具有侵袭性强、转移率高和预后差的特点。针对该肿瘤的特点，探索新的抗侵袭方法，将有助于减少肿瘤的侵袭和转移。 我们以往的研究表明,分化诱导剂六亚甲基二乙酰胺( hexamethylene bisacetamide,HMBA)能有效地诱导体外培养的人低分化型粘液表皮样癌细胞系MEC-1及其裸鼠移植瘤向良性方向分化,降低其恶性表型[1,2]。本项研究进一步探讨HMBA对MEC-1细胞体外粘附性、移动性和侵袭性的影响。
材料和方法
1.细胞培养：人低分化型粘液表皮样癌细胞系MEC-1，由我室建立。细胞用含10%胎牛血清的RPMI 1640培养液(美国GIBCO公司),在37℃、5%CO2及饱和湿度环境中培养。
, 百拇医药
2.细胞的分化诱导：HMBA(美国Sigma公司),用三蒸水配制为0.5 mol/L 的母液。实验时用培养液稀释至2 mmol/L。0.25%胰蛋白酶消化MEC-1细胞，用含HMBA的培养液体外诱导培养4 d。然后，收集细胞进行以下实验。
3.体外粘附性的测定：参照文献进行[3]。重构基底膜Matrigel(Collaborative Rsearch 公司)，按说明用无血清培养液以1∶8稀释,在96 孔培养板(丹麦NUNC公司)中加入50 μl，无菌吹干；取 HMBA 诱导的和未诱导的MEC-1 细胞100 μl (5×108个/L)分别接种到有及没有Matrigel的96孔板中,培养30 min、90 min后,洗去未粘附细胞,用MTT(thiazalyl blue,噻唑蓝)比色法测定粘附细胞并计算粘附率。
4.体外移动性的测定：参照文献方法稍加改良[4]，用市售的Millicell-PCF塑料培养小室(呈圆桶形，直径12 mm,底部装有聚碳酸酯微孔膜,孔径12 μm,美国Millipore公司出品)测定细胞穿行微孔膜的能力。将Millicell放入24孔培养板(NUNC公司)中,在Millicell内加入100 μl(5×108个/L)的HMBA诱导和未诱导的MEC-1 细胞,在Millicell外室加500 μl起趋化作用的条件培养液(用NIH3T3细胞系制备条件培养液[5])。培养8 h后,取出Millicell,PBS洗涤,3%戊二醛固定,Giemsa染色,用棉签小心擦去微孔膜上层细胞,在倒置显微镜高倍视野(150×)下，计数取景框中移至微孔膜下层的细胞。 每个样本计数10个视野。
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5.体外侵袭性的测定：按上述方法3，在Millicell内微孔膜上铺一层重构基底膜Matrigel，将Millicell放入24孔板中。在Millicell内加入100 μl(5×108个/L)的HMBA 诱导和未诱导的MEC-1细胞,在Millicell外室加500 μl条件培养液，培养20 h后,取出Millicell,按方法4进行固定、染色、 计数[4]。
结果
1. HMBA对MEC-1细胞粘附性的影响： 如表1所示,MEC-1细胞在 重构基底膜Matrigel 上的粘附率明显大于在塑料表面的粘附率。2 mmol/L的HMBA能显著抑制 MEC-1细胞在Matrigel上的粘附,30 min和90 min的粘附率则分别下降了26.81%和31.13%。但对细胞在塑料表面的粘附没有明显影响(90min组),表明HMBA的抗粘附作用具有选择性。
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表1 HMBA对MEC-1细胞体外粘附性的抑制作用(
±s) 分组细胞粘附率
30 min
90 min
无Matrigel:对照组
0.328 1±0.031 2
0.615 3±0.021 4
HMBA组
0.251 0±0.041 9*
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0.617 6±0.074 2
有Matrigel: 对照组
0.696 7±0.047 3**
0.946 7±0.057 4**
HMBA组
0.428 6±0.131 5*
0.635 4±0.173 5*
注：*与对照组比较，P<0.05(t检验)；**与无Matrigel对照组比较，P<0.05(t检验) 2. HMBA对MEC-1细胞移动性的影响：MEC-1细胞在NIH3T3细胞培养液中趋化因子的作用下,能从Millicell微孔膜的上方移动至膜的下方。从表2结果可见，2 mmol/L的HMBA具有抑制MEC-1细胞移动的能力。
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3.HMBA对MEC-1细胞侵袭性的影响：在Millicell微孔膜表面所铺的重构基底膜Matrigel与机体内的基底膜组分相似， 癌细胞通过分泌基质降解酶分解人工基底膜,才能够穿过微孔膜。如表2所示,2 mmol/L的HMBA对MEC-1 细胞的侵袭性有显著的抑制作用。
表2 HMBA对MEC-1细胞体外移动性和侵袭性的抑制作用 分组
移动实验
侵袭实验
细胞数(
±s)抑制率(%)
细胞数(
±s), http://www.100md.com
抑制率(%)
对照组
13.23±1.75
0
8.13±2.01
0
HMBA组
4.83±0.12*
63.49
2.63±0.35*
67.65
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注：*t检验结果，与对照组比较，P<0.05讨论
多孔生物膜Millicell培养系统是近年来发展的一项实验技术,用于体外Matrigel侵袭实验。 不仅可用于研究细胞分化和细胞与基质的相互作用,还可用来筛选抗侵袭和抗移动药物。本项实验应用该技术研究,证实分化诱导剂 HMBA对MEC-1细胞体外移动和侵袭行为有明显的抑制作用。
肿瘤侵袭过程分3个阶段: ①肿瘤细胞首先借助其表面特异性受体粘附到基底膜或基质; ②肿瘤细胞通过分泌蛋白酶降解细胞外基质(ECM); ③肿瘤细胞穿过蛋白酶降解的ECM，发生侵袭[6]。癌细胞表面含有丰富的粘附分子如层粘连蛋白(LN)受体,其表达与侵袭转移能力成正相关。与正常上皮细胞相比,癌细胞对富含层粘连蛋白(LN)的基底膜具有更强的粘附性[7]。我们在实验中观察到,富含LN和Ⅳ型胶原等成分的Matrigel能促进MEC-1细胞体外粘附， 而HMBA能选择性抑制癌细胞对Matrigel的粘附。HMBA抑制癌细胞粘附的机理目前尚不清楚，可能与影响癌细胞LN受体表达有关。
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肿瘤细胞的移动性和侵袭性受到多种因素影响,蛋白激酶C(PKC)的激活能增强瘤细胞的移动性和侵袭性[8]。已有研究发现HMBA具有抑制癌细胞PKC活性的作用[9]。本项实验结果显示,HMBA能显著抑制MEC-1细胞的移动性和侵袭性，其机理可能与抑制PKC活性有关。
结合我们以往的研究结果，可以看出分化诱导剂HMBA对MEC-1细胞不仅有显著的诱导分化作用[1,2]，而且有明显的抗粘附、抗移动和抗侵袭作用。这一结果为进一步研究HMBA抗转移治疗提供了实验依据。
基金项目：国家自然科学基金资助项目(39370740)
参考文献
1，陈宇萍,吴军正,司徒镇强,等.人粘液表皮样癌MEC-1细胞HMBA诱导分化的研究.中华口腔医学杂志,1996,31:28-30.
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2，贾保军,司徒镇强,吴军正,等.六亚甲基二乙酰胺对MEC-1细胞裸鼠移植瘤的诱导分化作用.中华口腔医学杂志,1996,31:85-87.
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4，Merzak A,McCrea S,Koochekpour S,et al.Control of human glioma cell growth,migration and invasion in vitro by transforming growth factor β1.Br J Cancer,1994,74:199-203.
5，周可祥，吴秉铨，郑杰，等.TIMP-基因转染对人肺巨细胞癌细胞系生物学行为的影响.中华医学杂志,1994,74:420-405.
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6，DeClerck YV,Yean TD,Chan D,et al.Inhibiton of tumor invasion of smooth muscle cell layers by recombinant human metalloproteinase inhibitor.Cancer Res,1991,51:2151-2157.
7，Zhang K,Kim JP,Woodley DT,et al.Restricted expreesion and function of la minin 1-binding integrins in normal and malignant oral mucosal keratinocytes.Cell Adhes Commun,1996,4:159-174.
8，Jiang WG,Puntis MC,Hallett MB.Molecular and cellular basis of cancer invasion and metastasis:implications for treatment.Br J Surg,1994,81:1576-1590.
9，谷善青,梁云燕,王跃民,等.环六亚甲基双乙酰胺对胃癌不同细胞周期两条信号系统的调节.生物化学与生物物理进展,1997,24:443-447.
收稿日期：19999-02-06, http://www.100md.com