凝血酶受体在人牙髓组织和细胞中表达的免疫组化研究
作者：王美霞 张郁 史俊南 汪平 吴补领
单位：王美霞(第四军医大学口腔医学院， 陕西 西安 710032)；张郁(第四军医大学口腔医学院， 陕西 西安 710032)；史俊南(第四军医大学口腔医学院， 陕西 西安 710032)；汪平(第四军医大学口腔医学院， 陕西 西安 710032)；吴补领(第四军医大学口腔医学院， 陕西 西安 710032)
关键词：凝血酶受体； 人牙髓； 表达； 免疫组织化学
牙体牙髓牙周病学杂志000305 【摘 要】 目的：探讨凝血酶受体在人正常、炎症牙 髓组织及体外培养的牙髓成纤维细胞中 的表达及其意义。方法：体外培养人牙髓成纤维细胞，收集正常和 炎症牙髓组织，采用免疫 组织化学方法观察凝血酶受体在牙髓组织和细胞中的表达和分布。结果：体外培养的牙髓成纤维细胞可见受体强阳性表达，正常及炎症牙髓组织中成牙本质细 胞层、牙髓细胞、血管内 皮细胞均呈广泛的阳性表达，炎症区淋巴细胞、单核细胞、中性粒细胞染色为强阳性。结论 ：人牙髓组织和体外培养的牙髓细胞均表达凝血酶受体，为进一步研 究凝血酶在牙髓组织中的作用机理提供实验依据。探讨凝血酶受体在人正常、炎症牙 髓组织及体外培养的牙髓成纤维细胞中 的表达及其意义。方法：体外培养人牙髓成纤维细胞，收集正常和 炎症牙髓组织，采用免疫 组织化学方法观察凝血酶受体在牙髓组织和细胞中的表达和分布。结果：体外培养的牙髓成纤维细胞可见受体强阳性表达，正常及炎症牙髓组织中成牙本质细 胞层、牙髓细胞、血管内 皮细胞均呈广泛的阳性表达，炎症区淋巴细胞、单核细胞、中性粒细胞染色为强阳性。结论 ：人牙髓组织和体外培养的牙髓细胞均表达凝血酶受体，为进一步研 究凝血酶在牙髓组织中的作用机理提供实验依据。
, 百拇医药
【中图号】 R780.2 【文献标识码】 A
【文章编号】 1005-2593(20 00)03-0129-03
[牙体牙髓牙周病学杂志，2000；10(3)：129]
Immunolocalization of thrombin receptor expressed
in human dental pulp cell and tissue
WANG Mei-xia， ZHANG Yu， SHI Jun-nan, et al
School of Stomatology,The Fourth Military Medical University,Xi'an 710032
, 百拇医药
【Abstract】 AIM: To investigate the expression and di stribution of thrombin receptor in human normal and inflamed dental pulp tissue and cultured dental pu lp fibroblasts. METHODS: We applied immunohistochemi cal te chniques to examine the thrombin receptor expression and distribution using an m onoclonal antibody to human thrombin receptor. RESULTS: Cu ltured dental pulp fibroblasts were strong positive stained. Positive staining w as observed in odontoblasts, dental pulp cells and vascular endothelial cells in both healthy and disease teeth. Strong specific staining was detected in lympho cytes, monocytes and neutrophils at sites of pulp inflammation. CONCLUTION: The expression of thrombin receptor in human dental pulp cell and tissue was detected, and this provides the basis for furthe r studying the mechanism of thrombin in dental pulp.
, 百拇医药
【Key words】 thrombin receptor; human dental pulp; expres sion; immunohistochemistry
[Chinese Journal of Conservative Dentistry, 2000,10(3):129]
凝血酶(thrombin)是一种多功能丝氨酸蛋白酶，它将可溶性纤维蛋白 原转变为不溶性的纤维蛋白凝块，促进血小板聚集，将许多凝血因 子转化为活性状 态。近年来，很多研究发现，凝血酶在发挥止血作用的同时，也通过激活其受体(thrombin receptor,TR)影响一系列生物学效应，可能在炎症、组织修复、伤口愈合方面起着重要作 用[1，2]。研究表明，凝血酶受体在体内的内皮细胞、成纤维细胞有明确表达 [3]。受体功能研究是近年来研究炎症及创伤愈合初期修复机理的热点之一。本研究利 用抗人凝血酶受体单克隆 抗体，对TR 在正常、炎症牙髓组织及体外培养的牙髓细胞的表达情况进行免疫组化定位研 究，旨在为进一步研究凝血酶在牙髓组织中的作用机理提供实验依据。
, http://www.100md.com
1 材料和方法
1.1 人牙髓细胞培养和标本制备
收集临床因阻生或正畸需拔除的正常牙，患者年龄12～26岁，取其牙髓，组织块法[4 ]原代培养人牙髓成纤维细胞，传代。培养液为含150ml/L 胎牛血清的 DMEM培养液(Gib c o,USA)。取生长良好的第5代牙髓细胞，以2×107/L细胞浓度接种到预先放有盖玻片的2 4孔板中，待细胞爬满盖玻片后，取出盖玻片，40g/L 多聚甲醛固定30min，备用。
1.2 组织标本制备
收集临床因治疗需要拔除的健康、龋坏第三磨牙，患者年龄18～40岁。牙齿拔除后立即穿 通髓角，40g/L多聚甲醛4℃固定24h，制备2mm牙齿磨片，再固定24h 。甲酸甲酸钠脱钙液4 ℃下脱钙3周，常规脱水，石蜡包埋，制备4μm 免疫组化切片。HE染色病理学检查区 分正常、炎症标本。
, 百拇医药
1.3 抗体
抗人TR单克隆抗体(军事医学科学院微生物流行病研究所陈万荣惠赠)；Sp试剂盒(DAKO公 司产)。
1.4 免疫组化染色
采用Sp两步法。脱蜡至水的切片与固定好的细胞爬片，3ml/L过氧化氢室温下30min，消除内 源性酶，1g/L胰酶消化10min，滴加一抗工作液(1：400)，4℃过夜，37℃ 复温1h，滴加 辣根过氧化物酶标记的多聚物连接二抗(即用型)，37℃ 30min，DAB显微镜下控制显色。 上述各步之后均用0.01mol/L PBS振洗3次，每次5min,阴性对照用PBS代替一抗。苏木精复 染石蜡切片，脱水，透明，封片，光镜观察。
2 结果
凝血酶受体的染色阳性部位在细胞膜和细胞浆，为棕黄色颗粒。体外培养的牙髓成纤维细胞 受体呈强阳性表达(图1)。正常及炎症牙髓组织中成牙本质细胞层、牙髓细胞及血管内皮 细胞呈广泛的阳性表达(图2)。在炎症牙髓组织中可见炎症浸润区的淋巴细胞、单核细胞 、中性粒细胞染色较深，呈强阳性表达，炎症区及周围的牙髓细胞染色阳性(图3)。
, 百拇医药
图1 体外培养的人牙髓成纤维细胞TR染色呈强阳性 ×40
图2 牙髓组织的成牙本质细胞层、牙髓细胞、血管内皮细胞TR呈广泛阳性表达 ×40
图3 炎症浸润区淋巴细胞、单核细胞、中性粒细胞TR呈强阳性表达 ×40
3 讨论
TR是G-蛋白偶联受体家族中的一个重要成员，主要分布 在内皮细胞、血管平滑肌细胞、成纤维细胞以及某些淋巴细胞[5]。在出血及炎症性损伤的初期，凝血酶在激活TR 后，除了引发凝血过程，使可 溶性纤维蛋白原转变为非可溶性纤维蛋白形成凝血块外，还能够发挥促使局部内皮细胞、成 纤维细胞的DNA 合成、细胞增殖，诱发前列腺素E2、白介素-1释放，促使炎性细胞趋化等 作用[6～8]。这种直接的细胞刺激作用和介导细胞因子功能，在组织早期损伤中具 有稳定血块、封闭创口、促使纤维化的作用，是组织损伤最早发生的生理和病理过程。研究 TR 的分布、激活和灭活，是近年来心血管疾病损伤修复的重要课题。本研究采用免疫组织 化学方法，观察到培养的人牙髓细胞的细胞膜及细胞浆内TR表达为强阳性，正常和炎症 牙髓组织的牙髓细胞区TR广泛分布。证明凝血酶受体在牙髓细胞、血管内皮细胞均有表达 和分布。
, 百拇医药
对于TR在牙髓中的表达国外虽然没有同类研究，但是，1998年Chang 等人用RT-PCR 法首次检测到体外培养的牙髓细胞上有TR的 mRNA 表达[9]。本实验从组织学角度 证明TR存在于牙髓组织及细胞中。
研究牙髓损伤修复其关键点是创伤愈合机理。在任何损伤中最初的修复无疑是从凝血机 制开始，牙髓组织由于其特殊的生理条件，如何在损伤初期(意外穿髓的保存治疗)加速血 凝块的形成、促使创口的稳定和早期纤维化是活髓保存的基础。由于凝血酶是一种多功能蛋 白酶，激活受体后介导一系列效应，牙髓组织中的TR表达和分布，为今后应用凝血酶在活髓 保存早期修复机理的研究提供了实验依据。
【参考文献】
[1] Schwartz SM.Serum-derived growth factor is thrombin.J Clin Invest, 1993,91: 4
, 百拇医药
[2] Dawes KE, Gray AJ, Laurent GJ. Thrombin stimulates fibroblast chem otaxis and replication. Eur J Cell Biol, 1993, 61: 126
[3] Dery O,Corvera CU,Steinhoff M, et al. Proteinase-activated rec eptors:novel m echanisms of signaling by serine proteases. Am J Physiol, 1998,274: C142
[4] 吴军正，司徒镇强，陈建元，等. 体外培养的人牙龈牙周牙髓成纤维细胞生 长曲线及形态特点. 实用口腔医学杂志，1993，9(4)：227
[5] Vu TK, Hung D, Wheaton V, et al. Molecular cloning of a funct ional thromb in receptor reveals a novel proteolytic mechanisms of receptor activation. Cell, 1991, 64: 1057
, 百拇医药
[6] Herbert JM, Dupuy E, Laplace MC, et al. Thrombin induces endo thelial cell growth via both a proteolytic and a nonproteolytic pathway. Biochem J,1994,30 3:227
[7] Carney DH. Postclotting effects of thrombin mediated by interactio n with affinity receptors. In: Thrombin structure and function. Berliner L, ed. New York：Plenum, 1992,351
[8] Fenton JW Ⅱ. Regulation of thrombin generation and functions. Sem in Thromb Haemost,1988,14:234
[9] Chang MC, Lin CP, Huang TF, et al. Thrombin-induced DNA synthe sis of cultu red human dental pulp cells is dependent on its proteolytic activity and modulat ed by prostaglandin E2. J Endod, 1998, 24: 709
收稿日期：1999-10-21
修回日期：2000-02-20, 百拇医药
单位：王美霞(第四军医大学口腔医学院， 陕西 西安 710032)；张郁(第四军医大学口腔医学院， 陕西 西安 710032)；史俊南(第四军医大学口腔医学院， 陕西 西安 710032)；汪平(第四军医大学口腔医学院， 陕西 西安 710032)；吴补领(第四军医大学口腔医学院， 陕西 西安 710032)
关键词：凝血酶受体； 人牙髓； 表达； 免疫组织化学
牙体牙髓牙周病学杂志000305 【摘 要】 目的：探讨凝血酶受体在人正常、炎症牙 髓组织及体外培养的牙髓成纤维细胞中 的表达及其意义。方法：体外培养人牙髓成纤维细胞，收集正常和 炎症牙髓组织，采用免疫 组织化学方法观察凝血酶受体在牙髓组织和细胞中的表达和分布。结果：体外培养的牙髓成纤维细胞可见受体强阳性表达，正常及炎症牙髓组织中成牙本质细 胞层、牙髓细胞、血管内 皮细胞均呈广泛的阳性表达，炎症区淋巴细胞、单核细胞、中性粒细胞染色为强阳性。结论 ：人牙髓组织和体外培养的牙髓细胞均表达凝血酶受体，为进一步研 究凝血酶在牙髓组织中的作用机理提供实验依据。探讨凝血酶受体在人正常、炎症牙 髓组织及体外培养的牙髓成纤维细胞中 的表达及其意义。方法：体外培养人牙髓成纤维细胞，收集正常和 炎症牙髓组织，采用免疫 组织化学方法观察凝血酶受体在牙髓组织和细胞中的表达和分布。结果：体外培养的牙髓成纤维细胞可见受体强阳性表达，正常及炎症牙髓组织中成牙本质细 胞层、牙髓细胞、血管内 皮细胞均呈广泛的阳性表达，炎症区淋巴细胞、单核细胞、中性粒细胞染色为强阳性。结论 ：人牙髓组织和体外培养的牙髓细胞均表达凝血酶受体，为进一步研 究凝血酶在牙髓组织中的作用机理提供实验依据。
, 百拇医药
【中图号】 R780.2 【文献标识码】 A
【文章编号】 1005-2593(20 00)03-0129-03
[牙体牙髓牙周病学杂志，2000；10(3)：129]
Immunolocalization of thrombin receptor expressed
in human dental pulp cell and tissue
WANG Mei-xia， ZHANG Yu， SHI Jun-nan, et al
School of Stomatology,The Fourth Military Medical University,Xi'an 710032
, 百拇医药
【Abstract】 AIM: To investigate the expression and di stribution of thrombin receptor in human normal and inflamed dental pulp tissue and cultured dental pu lp fibroblasts. METHODS: We applied immunohistochemi cal te chniques to examine the thrombin receptor expression and distribution using an m onoclonal antibody to human thrombin receptor. RESULTS: Cu ltured dental pulp fibroblasts were strong positive stained. Positive staining w as observed in odontoblasts, dental pulp cells and vascular endothelial cells in both healthy and disease teeth. Strong specific staining was detected in lympho cytes, monocytes and neutrophils at sites of pulp inflammation. CONCLUTION: The expression of thrombin receptor in human dental pulp cell and tissue was detected, and this provides the basis for furthe r studying the mechanism of thrombin in dental pulp.
, 百拇医药
【Key words】 thrombin receptor; human dental pulp; expres sion; immunohistochemistry
[Chinese Journal of Conservative Dentistry, 2000,10(3):129]
凝血酶(thrombin)是一种多功能丝氨酸蛋白酶，它将可溶性纤维蛋白 原转变为不溶性的纤维蛋白凝块，促进血小板聚集，将许多凝血因 子转化为活性状 态。近年来，很多研究发现，凝血酶在发挥止血作用的同时，也通过激活其受体(thrombin receptor,TR)影响一系列生物学效应，可能在炎症、组织修复、伤口愈合方面起着重要作 用[1，2]。研究表明，凝血酶受体在体内的内皮细胞、成纤维细胞有明确表达 [3]。受体功能研究是近年来研究炎症及创伤愈合初期修复机理的热点之一。本研究利 用抗人凝血酶受体单克隆 抗体，对TR 在正常、炎症牙髓组织及体外培养的牙髓细胞的表达情况进行免疫组化定位研 究，旨在为进一步研究凝血酶在牙髓组织中的作用机理提供实验依据。
, http://www.100md.com
1 材料和方法
1.1 人牙髓细胞培养和标本制备
收集临床因阻生或正畸需拔除的正常牙，患者年龄12～26岁，取其牙髓，组织块法[4 ]原代培养人牙髓成纤维细胞，传代。培养液为含150ml/L 胎牛血清的 DMEM培养液(Gib c o,USA)。取生长良好的第5代牙髓细胞，以2×107/L细胞浓度接种到预先放有盖玻片的2 4孔板中，待细胞爬满盖玻片后，取出盖玻片，40g/L 多聚甲醛固定30min，备用。
1.2 组织标本制备
收集临床因治疗需要拔除的健康、龋坏第三磨牙，患者年龄18～40岁。牙齿拔除后立即穿 通髓角，40g/L多聚甲醛4℃固定24h，制备2mm牙齿磨片，再固定24h 。甲酸甲酸钠脱钙液4 ℃下脱钙3周，常规脱水，石蜡包埋，制备4μm 免疫组化切片。HE染色病理学检查区 分正常、炎症标本。
, 百拇医药
1.3 抗体
抗人TR单克隆抗体(军事医学科学院微生物流行病研究所陈万荣惠赠)；Sp试剂盒(DAKO公 司产)。
1.4 免疫组化染色
采用Sp两步法。脱蜡至水的切片与固定好的细胞爬片，3ml/L过氧化氢室温下30min，消除内 源性酶，1g/L胰酶消化10min，滴加一抗工作液(1：400)，4℃过夜，37℃ 复温1h，滴加 辣根过氧化物酶标记的多聚物连接二抗(即用型)，37℃ 30min，DAB显微镜下控制显色。 上述各步之后均用0.01mol/L PBS振洗3次，每次5min,阴性对照用PBS代替一抗。苏木精复 染石蜡切片，脱水，透明，封片，光镜观察。
2 结果
凝血酶受体的染色阳性部位在细胞膜和细胞浆，为棕黄色颗粒。体外培养的牙髓成纤维细胞 受体呈强阳性表达(图1)。正常及炎症牙髓组织中成牙本质细胞层、牙髓细胞及血管内皮 细胞呈广泛的阳性表达(图2)。在炎症牙髓组织中可见炎症浸润区的淋巴细胞、单核细胞 、中性粒细胞染色较深，呈强阳性表达，炎症区及周围的牙髓细胞染色阳性(图3)。
, 百拇医药
图1 体外培养的人牙髓成纤维细胞TR染色呈强阳性 ×40
图2 牙髓组织的成牙本质细胞层、牙髓细胞、血管内皮细胞TR呈广泛阳性表达 ×40
图3 炎症浸润区淋巴细胞、单核细胞、中性粒细胞TR呈强阳性表达 ×40
3 讨论
TR是G-蛋白偶联受体家族中的一个重要成员，主要分布 在内皮细胞、血管平滑肌细胞、成纤维细胞以及某些淋巴细胞[5]。在出血及炎症性损伤的初期，凝血酶在激活TR 后，除了引发凝血过程，使可 溶性纤维蛋白原转变为非可溶性纤维蛋白形成凝血块外，还能够发挥促使局部内皮细胞、成 纤维细胞的DNA 合成、细胞增殖，诱发前列腺素E2、白介素-1释放，促使炎性细胞趋化等 作用[6～8]。这种直接的细胞刺激作用和介导细胞因子功能，在组织早期损伤中具 有稳定血块、封闭创口、促使纤维化的作用，是组织损伤最早发生的生理和病理过程。研究 TR 的分布、激活和灭活，是近年来心血管疾病损伤修复的重要课题。本研究采用免疫组织 化学方法，观察到培养的人牙髓细胞的细胞膜及细胞浆内TR表达为强阳性，正常和炎症 牙髓组织的牙髓细胞区TR广泛分布。证明凝血酶受体在牙髓细胞、血管内皮细胞均有表达 和分布。
, 百拇医药
对于TR在牙髓中的表达国外虽然没有同类研究，但是，1998年Chang 等人用RT-PCR 法首次检测到体外培养的牙髓细胞上有TR的 mRNA 表达[9]。本实验从组织学角度 证明TR存在于牙髓组织及细胞中。
研究牙髓损伤修复其关键点是创伤愈合机理。在任何损伤中最初的修复无疑是从凝血机 制开始，牙髓组织由于其特殊的生理条件，如何在损伤初期(意外穿髓的保存治疗)加速血 凝块的形成、促使创口的稳定和早期纤维化是活髓保存的基础。由于凝血酶是一种多功能蛋 白酶，激活受体后介导一系列效应，牙髓组织中的TR表达和分布，为今后应用凝血酶在活髓 保存早期修复机理的研究提供了实验依据。
【参考文献】
[1] Schwartz SM.Serum-derived growth factor is thrombin.J Clin Invest, 1993,91: 4
, 百拇医药
[2] Dawes KE, Gray AJ, Laurent GJ. Thrombin stimulates fibroblast chem otaxis and replication. Eur J Cell Biol, 1993, 61: 126
[3] Dery O,Corvera CU,Steinhoff M, et al. Proteinase-activated rec eptors:novel m echanisms of signaling by serine proteases. Am J Physiol, 1998,274: C142
[4] 吴军正，司徒镇强，陈建元，等. 体外培养的人牙龈牙周牙髓成纤维细胞生 长曲线及形态特点. 实用口腔医学杂志，1993，9(4)：227
[5] Vu TK, Hung D, Wheaton V, et al. Molecular cloning of a funct ional thromb in receptor reveals a novel proteolytic mechanisms of receptor activation. Cell, 1991, 64: 1057
, 百拇医药
[6] Herbert JM, Dupuy E, Laplace MC, et al. Thrombin induces endo thelial cell growth via both a proteolytic and a nonproteolytic pathway. Biochem J,1994,30 3:227
[7] Carney DH. Postclotting effects of thrombin mediated by interactio n with affinity receptors. In: Thrombin structure and function. Berliner L, ed. New York：Plenum, 1992,351
[8] Fenton JW Ⅱ. Regulation of thrombin generation and functions. Sem in Thromb Haemost,1988,14:234
[9] Chang MC, Lin CP, Huang TF, et al. Thrombin-induced DNA synthe sis of cultu red human dental pulp cells is dependent on its proteolytic activity and modulat ed by prostaglandin E2. J Endod, 1998, 24: 709
收稿日期：1999-10-21
修回日期：2000-02-20, 百拇医药