rhBMP2和rhTGF-β1联合应用对人牙髓细胞碱性磷酸酶活性的影响
作者：刘嘉利 张郁 王晓方 汪平
单位：刘嘉利(第四军医大学口腔医学院，陕西 西安 710032)；张郁(第四军医大学口腔医学院，陕西 西安 710032)；王晓方(第四军医大学口腔医学院，陕西 西安 710032)；汪平(第四军医大学口腔医学院，陕西 西安 710032)
关键词：人牙髓细胞；rhBMP2；rhTGF-β1；ALPase
牙体牙髓牙周病学杂志000306 【摘 要】 目的：探讨rhBMP2和rhTGF-β1联合应用对人牙髓细 胞ALPase活性的影响。方法：采用酶动力学的方法，比较不同浓 度rhBMP2和rhTGF-β1单独或联合应用对人牙髓细胞的ALPase活性的影响。结果 ：rhBMP2对人牙髓细胞的ALPase活性呈浓度依赖性增强，rhTGF-β1对人牙髓细 胞ALPase活性的影响与其本身浓度有关 。当rhTGF-β1浓度为1μg/L与rhBMP2联合应用时， ALPa se活性比rhBMP2单独应用明显增高。结论：rhBMP2、rhTGF-β1单独 及联合应用于人牙髓细胞时，对人牙髓细胞的ALPase活性作用不同，其对人牙髓细胞的生理 功能可能有调节作用。
, http://www.100md.com
【中图号】 R780.2 【文献标识码】 A
【文章编号】 1005-2593(20 00)03-0132-03
[牙体牙髓牙周病学杂志，2000；10(3)：132]
Effect of rhBMP2 and rhTGF-β1 on alkaline phosphatase
activity of human dental pulp cells in vitro
LIU Jia-li， ZHANG Yu， WANG Xiao-fang, et al
School of Stomatology, The Fourth Military Medical University, Xi'an 710032
, http://www.100md.com
【Abstract】 AIM: To study the effect of rhBMP2 and rhT GF-β1 on alkaline phosphatase activity of human dental pulp cells in vitro. METHODS:The alkaline phosphatase(ALPase) activity level o f hu man dental pulp cells was determined by a modified enzyme dynamical method ,when different doses of rhBMP2 and rhTGF-β1were added into culture medium. RESULTS:The activity of ALPase in human dental pulp cells enhanced while the concentration of rhBMP2 rised. The influence of rhTGF-β1 on the acti vity of ALPase in human dental pulp cells related to the concentration of rhTGF -β1. Compared with unique use of rhBMP2 , the activity of ALPase in human de ntal pulp cells enhanced abviously when rhBMP2 combined with rhTGF-β 1(1μg/L). CONCLUSION: These factors may play a regulato ry role on the physiological function of human dental pulp cells such as the alk aline phosphatase activity.
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【Key words】 human dental pulp cells； rhBMP2； rhTGF-β1 ； ALPase
[Chinese Journal of Conservative Dentistry, 2000,10(3):132]
碱性磷酸酶(ALPase)被认为与体内硬组织的形成有关，是研究成骨 细胞功能和分化的一个重要参考指标[1]。众多研究表明，体外培养的牙髓细胞不 同于一般的成纤维细胞，具有许多与成骨细胞相似的特征，如高碱性磷酸酶活性、钙化现象 、对钙调节因子和激素的特殊反应性等[2]。已发现rhBMP2和rhTGF-β1单独使用 对人牙髓细胞的ALPase具有调节作用[3,4]。其两者联合应用对人牙髓细胞的ALPa se活性水平如何?目前资料尚少。本研究旨在观察rhBMP2与rhTGF-β1联合 应用对体外培养的人牙髓细胞碱性磷酸酶活性的影响。
, http://www.100md.com
1 材料和方法
1.1 主要试剂和仪器
碱性磷酸酶测定试剂盒(台湾BGH)、1g/L TritonX-100(华美生物工程公司)、酶联免疫 检测 仪(华东电子管厂)、rhBMP2(中国军事医学科学院)、rhTGF-β1(四医大西京医院骨科 )。
1.2 方法
选择生长良好的第5代人牙髓细胞以浓度3×107/L接种96孔培养板，每孔100μl，培养液 为100ml/L FCS的DMEM培养液，在37℃、50ml/L CO2孵箱中培育24h，弃孔内液体和未贴壁 细胞，无血清培养液洗3遍，实验组换20ml/L FCS的DMEM培养液，稀释不同浓度的rhBMP2 (μg/L)：50、100、200；rhTGF-β1(μg/L)：0.1、1、10；rhTGF-β1+rhBMP2 ( μg/L)：1+50、1+100、1+200的生长因子加入孔内，阴性对照只加入10ml/L FCS的培养 液，每组4孔，各100μl，继续培养48h后弃除各孔培养液，用pH7.4的PBS洗3遍，吸干，每 孔加入1g/L的TritonX-100 50μl，置4℃冰箱过夜，然后加入ALP底物，每孔100μl，37℃ 孵箱内置30min，以每孔加入0.2mol/L NaOH 50μl 终止反应，在酶联免疫检测仪 上选择410nm波长测各孔A值，各浓度组取平均值，采用t检验进行统计学分析。
, 百拇医药
2 结果 (表1)
表1 不同程度rhBMP2 与rhTGF-β1 单独及联合应用对人牙髓细胞ALPase的影响 分组
剂量(μg/L)
( rhBMP2+rhTGF-β1)
A值
t值
对照组
0 0
0.25±0.04
rhBMP2
50 —
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0.38±0.02 *
5.90
100 —
0.42±0.05 *
5.31
200 —
0.51±0.07 *
6.45
rhTGF-β1
— 0.1
0.30±0.05
1.56
, http://www.100md.com
— 1
0.37±0.03 *
4.80
— 10
0.27±0.04
0.71
联合组
50+ 1
0.43±0.03 *
7.20
100+1
0.56±0.07 *
, 百拇医药
7.75
200+1
0.68±0.06 *
11.94
* P<0.05 单独使用rhBMP2 时，各浓度组均可刺激人牙髓细胞的ALPase活性(P<0.05 ) ，并呈浓度依赖性。
单独使用rhTGF-β1，在浓度为1μg/L时，可刺激人牙髓细胞的ALPase活性(P<0.05) 。其余各浓度组对ALPase无明显作用(P>0.05)。1μg/L组与10μg/L组对ALPase作用 有显著差异(P<0.05)。
rhBMP2与rhTGF-β1联合应用时，各浓度组均可刺激人牙髓细胞的ALPase活性(P<0.05 )。并与相应单独使用rhBMP2 的各浓度组相比ALPase活性有所增强(P<0.05 )。
, 百拇医药
rhBMP2与rhTGF-β1联合应用时，各浓度组之间ALPase活性均有差异(P<0.05 )。
3 讨论
ALPase是参与骨等钙化组织代谢和再生的一种功能性标志酶，牙髓中ALPase水平与骨中相 当，显著高于非成骨组织。对于各种激素和生长因子的刺激，体外培养的牙髓细胞ALPase活 性反应各异。通过测定牙髓细胞的ALPase活性，可反映细胞的功能。牙髓成纤维细胞的ALPa se活性可以反映牙髓成纤维细胞向成牙本质样细胞分化的能力[5]。
本实验结果显示，rhBMP2使牙髓细胞的ALPase活性明显增加，且有浓度依赖性，说明rhBMP2 可促进牙髓细胞合成ALPase，而ALPase又是骨细胞分化的标志酶，提示rhBMP2有促进牙髓细 胞向成牙本质细胞分化的可能，与其他文献报道一致。
, 百拇医药 本组实验，rhTGF-β1在0.1μg/L时对人牙髓细胞ALPase无明显作用，1μg/L时能 刺激细胞内ALPase活性，10μg/L时对人牙髓细胞ALPase无明显作用。10μg/L时对人牙髓细 胞ALPase的作用与1μg/L相比有降低趋势(P<0.05 )，相关文献报道：对于具有较高A LPase、钙含量、骨结合蛋白和骨钙素水平的P1系细胞，低浓度rhTGF-β1增加ALPase活性和 DNA合成。然而rhTGF-β1在5μg/L浓度时，则使 ALPase活性降低到最低水平[6]。 由于牙髓细胞所处的分化、增殖状态不同，不同个体来源的细胞在生物学上可能有较大差异 ,而且本实验所用rhTGF-β1纯度不是很高，所以在浓度上有一定的差异。本实验结果显示rh TGF-β1对人牙髓细胞ALPase活性的影响与其本身浓度有关。
rhTGF-β1和rhBMP2与肝素或纤连蛋白等结合时能“复制”出生理状态下成牙本质细胞的 分化[7]。rhBMP2和rhTGF-β1联合应用对人牙髓细胞的碱性磷酸酶活性的影响，在 国内外文献中尚未见报道。本组实验选择rhTGF-β1浓度为1μg/L时与rhBMP-2浓度为50、1 00、200μg/L分别联合应用结果表明：两者联合应用时，各浓度组均可刺激 人牙髓细胞的ALPase活性(P<0.05 )。并与相应单独使用rhBMP2 的各浓度组相比ALPase活性有所增强(P<0.05 )。各浓度组之间ALPase活性均有差异 (P<0.05 )。说明rhBMP2与rhTGF-β1联合应用时，两者可能存在着一定的协同作 用，这一作用的机理可能是： 两者联合应用时，rhTGF-β1作为牙髓细胞的 丝裂原，在牙髓细胞的分化中发挥了积极的诱导作用，rhBMP2在诱导牙髓成纤维细胞分化的 同时受到rhTGF-β1的作用，二者共同作用的结果使牙髓细胞的ALPase活性明显增加，且有 浓度依赖性，所以rhBMP2与rhTGF-β1联合应用时对人牙髓细胞的ALPase活性刺激增强，能 够更有效的作用于培养的细胞。由于细胞因子的作用是多项的，多种因子相互作用的机制非 常复杂，影响因素较多，本实验仅从ALPase的角度探讨rhBMP2和rhTGF-β1的相互作用，更 进一步的机理有待研究。
, http://www.100md.com
【参考文献】
[1] Wlodarski KH, Reddi AH. Alkaline phosphatase as a amaarker of ost eo-inductive cells .Calc Tiss INT,1986,39:382
[2] 彭彬. 体外牙髓细胞的生物学特征. 国外口腔医学体外牙髓细胞分册， 1994,21:290
[3] 任卫红. rhBMP2对体外人牙髓细胞的增殖及碱性磷酸酶的影响. 现代口腔医 学杂志,1997,11(增刊):99
[4] 周廷冲, 主编. 多肽生长因子基础与临床. 北京：中国科学技术出版社，19 92. 240
[5] 陈筠. 牙髓碱性磷酸酶的提纯、cDNA克隆和氢氧化钙对其活性、表达的影 响：[学位论文]. 第四军医大学口腔医学院，1991
, http://www.100md.com
[6] Shirakawa M, Shiba H, Nakanishi k, et al. Transforming growth- beta-1 reduces alakaline phosphatase mRNA and activity and stimulates cell proli feration in cultures of human pulp cells. J Dent Res,1994, 73:1509
[7] Begue-Kirn C,Smith AJ, Loriot M, et al. Comparative analysis o f TGFβs,BMPs IGF1 msx fibronectin, osteonectin and bone sailoprotein gene e xpressions during normal and in vitro induced odontoblast differentitation.I nt J Dev Biol,1994,38:405
收稿日期：1999-12-29
修回日期：2000-02-15, 百拇医药
单位：刘嘉利(第四军医大学口腔医学院，陕西 西安 710032)；张郁(第四军医大学口腔医学院，陕西 西安 710032)；王晓方(第四军医大学口腔医学院，陕西 西安 710032)；汪平(第四军医大学口腔医学院，陕西 西安 710032)
关键词：人牙髓细胞；rhBMP2；rhTGF-β1；ALPase
牙体牙髓牙周病学杂志000306 【摘 要】 目的：探讨rhBMP2和rhTGF-β1联合应用对人牙髓细 胞ALPase活性的影响。方法：采用酶动力学的方法，比较不同浓 度rhBMP2和rhTGF-β1单独或联合应用对人牙髓细胞的ALPase活性的影响。结果 ：rhBMP2对人牙髓细胞的ALPase活性呈浓度依赖性增强，rhTGF-β1对人牙髓细 胞ALPase活性的影响与其本身浓度有关 。当rhTGF-β1浓度为1μg/L与rhBMP2联合应用时， ALPa se活性比rhBMP2单独应用明显增高。结论：rhBMP2、rhTGF-β1单独 及联合应用于人牙髓细胞时，对人牙髓细胞的ALPase活性作用不同，其对人牙髓细胞的生理 功能可能有调节作用。
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【中图号】 R780.2 【文献标识码】 A
【文章编号】 1005-2593(20 00)03-0132-03
[牙体牙髓牙周病学杂志，2000；10(3)：132]
Effect of rhBMP2 and rhTGF-β1 on alkaline phosphatase
activity of human dental pulp cells in vitro
LIU Jia-li， ZHANG Yu， WANG Xiao-fang, et al
School of Stomatology, The Fourth Military Medical University, Xi'an 710032
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【Abstract】 AIM: To study the effect of rhBMP2 and rhT GF-β1 on alkaline phosphatase activity of human dental pulp cells in vitro. METHODS:The alkaline phosphatase(ALPase) activity level o f hu man dental pulp cells was determined by a modified enzyme dynamical method ,when different doses of rhBMP2 and rhTGF-β1were added into culture medium. RESULTS:The activity of ALPase in human dental pulp cells enhanced while the concentration of rhBMP2 rised. The influence of rhTGF-β1 on the acti vity of ALPase in human dental pulp cells related to the concentration of rhTGF -β1. Compared with unique use of rhBMP2 , the activity of ALPase in human de ntal pulp cells enhanced abviously when rhBMP2 combined with rhTGF-β 1(1μg/L). CONCLUSION: These factors may play a regulato ry role on the physiological function of human dental pulp cells such as the alk aline phosphatase activity.
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【Key words】 human dental pulp cells； rhBMP2； rhTGF-β1 ； ALPase
[Chinese Journal of Conservative Dentistry, 2000,10(3):132]
碱性磷酸酶(ALPase)被认为与体内硬组织的形成有关，是研究成骨 细胞功能和分化的一个重要参考指标[1]。众多研究表明，体外培养的牙髓细胞不 同于一般的成纤维细胞，具有许多与成骨细胞相似的特征，如高碱性磷酸酶活性、钙化现象 、对钙调节因子和激素的特殊反应性等[2]。已发现rhBMP2和rhTGF-β1单独使用 对人牙髓细胞的ALPase具有调节作用[3,4]。其两者联合应用对人牙髓细胞的ALPa se活性水平如何?目前资料尚少。本研究旨在观察rhBMP2与rhTGF-β1联合 应用对体外培养的人牙髓细胞碱性磷酸酶活性的影响。
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1 材料和方法
1.1 主要试剂和仪器
碱性磷酸酶测定试剂盒(台湾BGH)、1g/L TritonX-100(华美生物工程公司)、酶联免疫 检测 仪(华东电子管厂)、rhBMP2(中国军事医学科学院)、rhTGF-β1(四医大西京医院骨科 )。
1.2 方法
选择生长良好的第5代人牙髓细胞以浓度3×107/L接种96孔培养板，每孔100μl，培养液 为100ml/L FCS的DMEM培养液，在37℃、50ml/L CO2孵箱中培育24h，弃孔内液体和未贴壁 细胞，无血清培养液洗3遍，实验组换20ml/L FCS的DMEM培养液，稀释不同浓度的rhBMP2 (μg/L)：50、100、200；rhTGF-β1(μg/L)：0.1、1、10；rhTGF-β1+rhBMP2 ( μg/L)：1+50、1+100、1+200的生长因子加入孔内，阴性对照只加入10ml/L FCS的培养 液，每组4孔，各100μl，继续培养48h后弃除各孔培养液，用pH7.4的PBS洗3遍，吸干，每 孔加入1g/L的TritonX-100 50μl，置4℃冰箱过夜，然后加入ALP底物，每孔100μl，37℃ 孵箱内置30min，以每孔加入0.2mol/L NaOH 50μl 终止反应，在酶联免疫检测仪 上选择410nm波长测各孔A值，各浓度组取平均值，采用t检验进行统计学分析。
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2 结果 (表1)
表1 不同程度rhBMP2 与rhTGF-β1 单独及联合应用对人牙髓细胞ALPase的影响 分组
剂量(μg/L)
( rhBMP2+rhTGF-β1)
A值
t值
对照组
0 0
0.25±0.04
rhBMP2
50 —
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0.38±0.02 *
5.90
100 —
0.42±0.05 *
5.31
200 —
0.51±0.07 *
6.45
rhTGF-β1
— 0.1
0.30±0.05
1.56
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— 1
0.37±0.03 *
4.80
— 10
0.27±0.04
0.71
联合组
50+ 1
0.43±0.03 *
7.20
100+1
0.56±0.07 *
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7.75
200+1
0.68±0.06 *
11.94
* P<0.05 单独使用rhBMP2 时，各浓度组均可刺激人牙髓细胞的ALPase活性(P<0.05 ) ，并呈浓度依赖性。
单独使用rhTGF-β1，在浓度为1μg/L时，可刺激人牙髓细胞的ALPase活性(P<0.05) 。其余各浓度组对ALPase无明显作用(P>0.05)。1μg/L组与10μg/L组对ALPase作用 有显著差异(P<0.05)。
rhBMP2与rhTGF-β1联合应用时，各浓度组均可刺激人牙髓细胞的ALPase活性(P<0.05 )。并与相应单独使用rhBMP2 的各浓度组相比ALPase活性有所增强(P<0.05 )。
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rhBMP2与rhTGF-β1联合应用时，各浓度组之间ALPase活性均有差异(P<0.05 )。
3 讨论
ALPase是参与骨等钙化组织代谢和再生的一种功能性标志酶，牙髓中ALPase水平与骨中相 当，显著高于非成骨组织。对于各种激素和生长因子的刺激，体外培养的牙髓细胞ALPase活 性反应各异。通过测定牙髓细胞的ALPase活性，可反映细胞的功能。牙髓成纤维细胞的ALPa se活性可以反映牙髓成纤维细胞向成牙本质样细胞分化的能力[5]。
本实验结果显示，rhBMP2使牙髓细胞的ALPase活性明显增加，且有浓度依赖性，说明rhBMP2 可促进牙髓细胞合成ALPase，而ALPase又是骨细胞分化的标志酶，提示rhBMP2有促进牙髓细 胞向成牙本质细胞分化的可能，与其他文献报道一致。
, 百拇医药 本组实验，rhTGF-β1在0.1μg/L时对人牙髓细胞ALPase无明显作用，1μg/L时能 刺激细胞内ALPase活性，10μg/L时对人牙髓细胞ALPase无明显作用。10μg/L时对人牙髓细 胞ALPase的作用与1μg/L相比有降低趋势(P<0.05 )，相关文献报道：对于具有较高A LPase、钙含量、骨结合蛋白和骨钙素水平的P1系细胞，低浓度rhTGF-β1增加ALPase活性和 DNA合成。然而rhTGF-β1在5μg/L浓度时，则使 ALPase活性降低到最低水平[6]。 由于牙髓细胞所处的分化、增殖状态不同，不同个体来源的细胞在生物学上可能有较大差异 ,而且本实验所用rhTGF-β1纯度不是很高，所以在浓度上有一定的差异。本实验结果显示rh TGF-β1对人牙髓细胞ALPase活性的影响与其本身浓度有关。
rhTGF-β1和rhBMP2与肝素或纤连蛋白等结合时能“复制”出生理状态下成牙本质细胞的 分化[7]。rhBMP2和rhTGF-β1联合应用对人牙髓细胞的碱性磷酸酶活性的影响，在 国内外文献中尚未见报道。本组实验选择rhTGF-β1浓度为1μg/L时与rhBMP-2浓度为50、1 00、200μg/L分别联合应用结果表明：两者联合应用时，各浓度组均可刺激 人牙髓细胞的ALPase活性(P<0.05 )。并与相应单独使用rhBMP2 的各浓度组相比ALPase活性有所增强(P<0.05 )。各浓度组之间ALPase活性均有差异 (P<0.05 )。说明rhBMP2与rhTGF-β1联合应用时，两者可能存在着一定的协同作 用，这一作用的机理可能是： 两者联合应用时，rhTGF-β1作为牙髓细胞的 丝裂原，在牙髓细胞的分化中发挥了积极的诱导作用，rhBMP2在诱导牙髓成纤维细胞分化的 同时受到rhTGF-β1的作用，二者共同作用的结果使牙髓细胞的ALPase活性明显增加，且有 浓度依赖性，所以rhBMP2与rhTGF-β1联合应用时对人牙髓细胞的ALPase活性刺激增强，能 够更有效的作用于培养的细胞。由于细胞因子的作用是多项的，多种因子相互作用的机制非 常复杂，影响因素较多，本实验仅从ALPase的角度探讨rhBMP2和rhTGF-β1的相互作用，更 进一步的机理有待研究。
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【参考文献】
[1] Wlodarski KH, Reddi AH. Alkaline phosphatase as a amaarker of ost eo-inductive cells .Calc Tiss INT,1986,39:382
[2] 彭彬. 体外牙髓细胞的生物学特征. 国外口腔医学体外牙髓细胞分册， 1994,21:290
[3] 任卫红. rhBMP2对体外人牙髓细胞的增殖及碱性磷酸酶的影响. 现代口腔医 学杂志,1997,11(增刊):99
[4] 周廷冲, 主编. 多肽生长因子基础与临床. 北京：中国科学技术出版社，19 92. 240
[5] 陈筠. 牙髓碱性磷酸酶的提纯、cDNA克隆和氢氧化钙对其活性、表达的影 响：[学位论文]. 第四军医大学口腔医学院，1991
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[6] Shirakawa M, Shiba H, Nakanishi k, et al. Transforming growth- beta-1 reduces alakaline phosphatase mRNA and activity and stimulates cell proli feration in cultures of human pulp cells. J Dent Res,1994, 73:1509
[7] Begue-Kirn C,Smith AJ, Loriot M, et al. Comparative analysis o f TGFβs,BMPs IGF1 msx fibronectin, osteonectin and bone sailoprotein gene e xpressions during normal and in vitro induced odontoblast differentitation.I nt J Dev Biol,1994,38:405
收稿日期：1999-12-29
修回日期：2000-02-15, 百拇医药