高胆固醇血症小鼠脑缺血后神经行为及海马细胞改变的研究
作者：高志强 孙敬方 田小芸 孙桂勤
单位：210002 南京军区南京总医院
关键词：NJS小鼠；短暂性脑缺血；神经行为；海马
中国行为医学科学000312【摘要】 目的 观察近交系自发性高胆固醇血症(NJS)小鼠短暂性脑缺血(TIA)后的神经行为学和海马细胞改变的情况。方法 采用双侧颈总动脉夹闭后再灌注的方法制备TIA模型。观察术前及术后小鼠的探究行为、平衡功能，统计术后小鼠出现肢体瘫痪的概率和海马神经元的坏死情况，并与ICR小鼠的测定结果相比较。结果 NJS小鼠TIA后出现肢体瘫痪的概率高(P=0.026)，海马细胞坏死的数量多，其中左侧CA1区、CA3区和齿状核细胞坏死较对照组有统计学差异(P<0.05)。肢体瘫痪恢复后探究活动仍较缺血前差(P<0.05)。结论 NJS小鼠TIA后可出现海马神经元坏死和神经行为学改变，对其机制的进一步探讨将有助于对部分人群的缺血性脑血管病的神经行为学研究。
, 百拇医药
Study of the neurobehavior and the changes of hippocampus in an inbred mouse strain with a situation of hypercholesterolemia after cerebral ischemia
Gao Zhiqiang, Sun Jingfang, Tian Xiaoyun, et al. Department of Neurology, Nanjing Military Region Hospital, Nanjing, 210002
【Abstract】 Objective To evaluate the changes of neurobehavior and hippocampus in inbred strain mouse with a situation of hypercholesterolemia after transitory cerebral ischemia attack (TIA) . Methods The model of TIA was established by means of reperfusion following transitory clipping of both carotid artery. To estimate the abilities of inquisition and balance,to calculate the ratios of paralysis and the numbers of neuronal death of hippocampus after operation, the results were compared with the other strain of ICR mouse.Results The ratios of paralysis were high (P=0.026) in NJS mice, but there was no more changes about the balance. The numbers of neuronal death of hippocampus were more in NJS mice, There were statistic significant in left CA1,CA3 and nuclear dentate (P<0.05), the ability of inquisition was also significantly descend (P<0.05) compared with it before cerebral ischemia when the paralysis was disappeared. Conclusion The NJS mouse can occur changes of neurobehavior and neuronal death of hippocampus after TIA. To explore the mechanisms about this changes maybe promote the study in the field of some kinds of ischemia cerebral disease in human being.
, 百拇医药
【Key words】 NJS mouse TIA Neurobehavior Hippocampus
自发性高胆固醇血症小鼠(NJS)是经高度近交培育出的品系，此种小鼠在正常配方普通食物喂养下血清胆固醇浓度即明显高于正常小鼠，具有易发冠状动脉粥样硬化的生化及行为特征[1～3]。为进一步了解NJS小鼠对脑缺血的反应，我们观察了该种小鼠短暂性脑缺血(TIA)后海马神经元的变化及部分神经行为特征。
材料和方法
一、动物选择 选择8月龄的NJS小鼠和美国肿瘤研究学会培育的实验小鼠(ICR)各18只。其中雄性各10只，雌性各8只，实验小鼠由我院动物实验中心提供(苏动质字97001)。NJS小鼠的血清胆固醇浓度(5.65±0.83 mmol/L)为ICR小鼠的两倍左右。两种品系小鼠在相同的清洁级环境(苏动环字97001)饲养：采用普通配方全价颗粒饲料，人工光照(12h/d)，室温23.5±4.6℃，相对湿度50.9%±9.3%，噪音48dB，照度220lux。
, 百拇医药
二、脑缺血模型的选择
1.参照沙土鼠及小鼠前脑缺血模型的方法制作短暂脑缺血模型[4，5]，氯胺酮(100mg/kg)腹腔注射麻醉小鼠，颈部正中纵行切口，在气管两侧分离出双侧颈总动脉，夹闭10分钟后再恢复脑供血并缝合皮肤。
2.术中夹闭动脉后观察小鼠双侧眼球是否变苍白，术后2、4、6小时小鼠的肢体瘫痪情况。术前及术后三天称重。
3.术后3天断头取双侧大脑组织。10%中性福尔马林固定，一周后石腊包埋常规切片HE染色，光镜下统计双侧海马各区每个高倍视野(400倍)下正常和坏死细胞数。
三、神经行为学观察
1.旷场试验(open field method)，参照大鼠旷场试验箱制作50×50×30cm3的木箱，底面均匀摆置10×10×1 cm3的木块9块，观察小鼠一分钟内过障数(四肢均通过木块的数目)和沿器壁爬立次数。用于观察小鼠的探究行为。
, 百拇医药
2.斜板试验(inclined plane method) 将小鼠放在一平滑的木板上，头向持板者。将板逐渐抬高，速度约为4.5°/s，记下小鼠滑下时抬高的角度，重复5次，选取中位数。用于检查小鼠的运动平衡能力[5]。
四、统计分析：两种小鼠的海马正常细胞和坏死细胞计数对比分析、术前术后神经行为结果比较和体重减轻的克数采用成组资料t检验，术中出现眼球变白和术后出现瘫痪的概率采用精确概率法检验(fisher's exact test)。所有统计过程均在计算机上由SPSS8.0版完成。
结 果
一、术中出现心跳骤停死亡在NJS小鼠为4只，雌雄各2只，ICR小鼠2只，均为雄性。术后3天NJS小鼠体重下降较ICR小鼠明显(P<0.001)。
二、术中出现眼球变苍白在NJS小鼠明显多于ICR小鼠(P=0.014)，手术后2小时出现一侧肢体瘫痪，表现为行走时向一侧旋转，在NJS小鼠明显多于ICR小鼠(P=0.026)。随着时间推移，向一侧旋转现象逐渐消失，6小时以后两组小鼠瘫痪情况均消失。(详见表1)。
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表1 NJS小鼠与ICR小鼠短暂脑缺血后症状比较
NJS小鼠
ICR小鼠
P
眼球变苍白
11/14
5/16
0.014
2小时瘫痪
10/14
4/16
0.026
, 百拇医药
4小时瘫痪
3/14
1/16
0.315
6小时瘫痪
1/14
0/16
0.467
体重减少(克)
5.1±1.9
2.1±1.3
0.000
注：检验方法为Fisher's Exact Test，(体重减少一项为t Test).
, 百拇医药
三、术后72小时两组小鼠的探究行为和平衡功能，可见两组小鼠的探究行为能力下降，并以NJS小鼠的下降更为明显(P<0.05)。而平衡功能的改变则不显著。详见表2。
四、高倍光镜下检测短暂性脑缺血72小时后小鼠双侧海马细胞坏死情况，可见两种小鼠双侧海马均有细胞坏死，相比较而言NJS小鼠除CA4区为右侧海马坏死细胞多于左侧外，CA1、CA2、CA3、齿状核均为左侧坏死细胞数多于右侧，而在ICR小鼠则是所有各区均为右侧海马坏死细胞多于左侧。两种小鼠相比NJS小鼠细胞坏死数要多于ICR小鼠。其中左侧CA1、CA3和齿状核细胞坏死数量的差异有统计学意义。(详见表3)。
表2 两种小鼠短暂性脑缺血后神经行为学观察结果
NJS小鼠
P
ICR小鼠
, 百拇医药
P
术前
术后
术前
术后
过障数
13.7±3.0
10.5±1.9
0.002
9.6±4.8
7.7±5.3
0.27
爬壁数
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7.1±3.4
4.91±2.3
0.04
5.1±3.1
4.5±2.8
0.63
斜板角度
46.2±1.9
45.8±1.8
0.52
36.8±7.2
36.5±4.9
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0.89
注：检验方法为independent samples t test.表3 NJS小鼠与ICR小鼠短暂脑缺血后海马细胞改变的比较
正常细胞数
P
坏死细胞数
P
NJS
ICR
NJS
ICR
CA1左
101±33
, 百拇医药
102±7
0.25
23±23
8±3
0.03
CA1右
115±14
105±20
0.14
15±7
12±6
0.26
CA2左
, 百拇医药
114±36
124±20
0.36
17±21
10±6
0.16
CA2右
109±20
114±19
0.50
15±15
22±28
0.42
, 百拇医药
CA3左
81±38
101±14
0.06
31±28
12±10
0.02
CA3右
78±25
98±28
0.05
21±23
24±20
, 百拇医药
0.68
CA4左
81±13
85±17
0.47
19±14
15±15
0.45
CA4右
69±29
84±32
0.18
24±27
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31±35
0.57
齿状核左
390±55
406±14
0.27
109±110
41±41
0.03
齿状核右
387±50
384±62
0.87
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66±47
80±63
0.49
总 和
1525±159
1612±121
0.10
341±169
255±175
0.18
注：检验方法为independent samples t test.讨 论
NJS小鼠具有正常饲料喂养下自发性产生高胆醇血症的生物学特征，而且这种鼠具备了好奇、好动、好争斗、攻击性强等类似A型行为[7]，这两者都是心脑血管病的重要诱发因素[8，9]，因此探讨NJS小鼠脑缺血后神经元和神经行为学的改变具有重要的临床意义。
, 百拇医药
海马结构在解剖上易于辨认，并且与人和动物的记忆行为有关。既往在大鼠和沙土鼠的研究认为缺血再灌注后首先出现海马神经元变性坏死的是CA1区的神经元，3天以后整个海马区均可出现神经元迟发性变性坏死。本实验可见利用NJS小鼠行双颈总动脉夹闭再灌注的方法同样可出现类似的改变。此种手术方法简单易行，手术死亡率低，术后存活时间较长，易于进行神经行为学观察。不需要特殊的实验室条件。
从实验结果可以看出NJS小鼠脑循环对缺血的耐受性较ICR小鼠更差，表现在夹闭双侧颈总动脉时死亡的小鼠只数多、眼球变苍白的比例高(P=0.014)、手术后出现肢体瘫痪的概率高(两小时P=0.026)、术后体重下降明显(P<0.001)，另从缺血72小时后海马细胞坏死的情况看，NJS小鼠海马坏死数大于ICR小鼠，在部分海马区(CA1、CA3、左侧齿状核等)的差别有统计学意义等。
从探究活动和斜板实验可以看出，虽然手术后三天两种小鼠 运动功能基本恢复，没有明显的肢体瘫痪症象，但复杂的活动(探究)仍较术前有明显下降，尤以NJS小鼠的越障数降低最明显(P=0.002)。这可能与肢体功能未完全恢复有关，但更可能是与空间定向和思维判断能力降低有关，因为从斜板实验来看，术前术后的差异不大(P>0.05)。说明TIA后海马细胞坏死对探究活动有一定的影响。有关脑缺血的动物模型有很多，但对短暂性脑缺血后的神经行为能力的模型的研究较少，且这些脑梗塞模型比较接近脑栓塞的发病过程，而与部分人群在长期高血脂和动脉硬化的基础上产生的脑血栓形成或短暂性脑缺血发作的发病过程相去甚远。实验数据对临床上短暂性脑缺血发作后患者心理行为改变的研究尚有较大的差距。近来有采用SD大鼠永久性结扎双侧颈总脉来制作慢性脑缺血来研究大鼠的学习和记忆的影响的报道[10]。从本实验结果看NJS小鼠TIA后神经行为学和海马细胞的改变值得我们进一步探讨，其结果将有助于临床上高胆固醇血症病人脑供血不足发作后神经行为、心理方面的研究。
, 百拇医药
参考文献
1.孙敬方. NJS系小鼠的选育研究. Ⅰ、培育历史与建系方法. 上海实验动物学，1996，16(3，4)：131～133.
2.孙敬方.NJS系小鼠的选育研究.Ⅱ、近交过程中血清胆固醇含量的定向选择效应.畜牧与兽医，1997，29(4)：149～151.
3.Sun Jingfang. Breeding of inbred NJS strain mouse and its characteristics in atherosclerosis. Journal of Nanjing Normal University(Natural science),1996,19:8～11.
4.魏泓 主编. 医学实验动物学.成都：四川科学技术出版社，1998：335.
, http://www.100md.com
5.Himori N, Watanabe HM, Akaike N. Cerebral ischemia model with conscious mice: Involvement of NMDA receptor activation and derangement of learning and memory ability. J Pharmacol Meth, 1990，23:311～317.
6.徐淑云,卞如濂,陈修主编. 药理实验方法学. 第二版.北京：人民卫生出版社，1982:641～644.
7.高志强，田小芸，孙敬方.自发性高胆固醇血症小鼠神经行为学评估.中国行为医学科学， 1999，8(3)：180～181.
8.杨菊贤，张锡明主编. 实用心身疾病学.乌鲁木齐：新疆科技卫生出版社，1992：132～148.
9.Michael J. Strube. Type A Behavior. First sage printing, Sage Publications, London, 1991： 1～3.
10.谢元云，姚志彬.慢性脑缺血对青年和老年大鼠学习记忆的影响.中国行为医学科学，1998，7(4)：253～255.
(收稿日期：1999—12—04), 百拇医药
单位：210002 南京军区南京总医院
关键词：NJS小鼠；短暂性脑缺血；神经行为；海马
中国行为医学科学000312【摘要】 目的 观察近交系自发性高胆固醇血症(NJS)小鼠短暂性脑缺血(TIA)后的神经行为学和海马细胞改变的情况。方法 采用双侧颈总动脉夹闭后再灌注的方法制备TIA模型。观察术前及术后小鼠的探究行为、平衡功能，统计术后小鼠出现肢体瘫痪的概率和海马神经元的坏死情况，并与ICR小鼠的测定结果相比较。结果 NJS小鼠TIA后出现肢体瘫痪的概率高(P=0.026)，海马细胞坏死的数量多，其中左侧CA1区、CA3区和齿状核细胞坏死较对照组有统计学差异(P<0.05)。肢体瘫痪恢复后探究活动仍较缺血前差(P<0.05)。结论 NJS小鼠TIA后可出现海马神经元坏死和神经行为学改变，对其机制的进一步探讨将有助于对部分人群的缺血性脑血管病的神经行为学研究。
, 百拇医药
Study of the neurobehavior and the changes of hippocampus in an inbred mouse strain with a situation of hypercholesterolemia after cerebral ischemia
Gao Zhiqiang, Sun Jingfang, Tian Xiaoyun, et al. Department of Neurology, Nanjing Military Region Hospital, Nanjing, 210002
【Abstract】 Objective To evaluate the changes of neurobehavior and hippocampus in inbred strain mouse with a situation of hypercholesterolemia after transitory cerebral ischemia attack (TIA) . Methods The model of TIA was established by means of reperfusion following transitory clipping of both carotid artery. To estimate the abilities of inquisition and balance,to calculate the ratios of paralysis and the numbers of neuronal death of hippocampus after operation, the results were compared with the other strain of ICR mouse.Results The ratios of paralysis were high (P=0.026) in NJS mice, but there was no more changes about the balance. The numbers of neuronal death of hippocampus were more in NJS mice, There were statistic significant in left CA1,CA3 and nuclear dentate (P<0.05), the ability of inquisition was also significantly descend (P<0.05) compared with it before cerebral ischemia when the paralysis was disappeared. Conclusion The NJS mouse can occur changes of neurobehavior and neuronal death of hippocampus after TIA. To explore the mechanisms about this changes maybe promote the study in the field of some kinds of ischemia cerebral disease in human being.
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【Key words】 NJS mouse TIA Neurobehavior Hippocampus
自发性高胆固醇血症小鼠(NJS)是经高度近交培育出的品系，此种小鼠在正常配方普通食物喂养下血清胆固醇浓度即明显高于正常小鼠，具有易发冠状动脉粥样硬化的生化及行为特征[1～3]。为进一步了解NJS小鼠对脑缺血的反应，我们观察了该种小鼠短暂性脑缺血(TIA)后海马神经元的变化及部分神经行为特征。
材料和方法
一、动物选择 选择8月龄的NJS小鼠和美国肿瘤研究学会培育的实验小鼠(ICR)各18只。其中雄性各10只，雌性各8只，实验小鼠由我院动物实验中心提供(苏动质字97001)。NJS小鼠的血清胆固醇浓度(5.65±0.83 mmol/L)为ICR小鼠的两倍左右。两种品系小鼠在相同的清洁级环境(苏动环字97001)饲养：采用普通配方全价颗粒饲料，人工光照(12h/d)，室温23.5±4.6℃，相对湿度50.9%±9.3%，噪音48dB，照度220lux。
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二、脑缺血模型的选择
1.参照沙土鼠及小鼠前脑缺血模型的方法制作短暂脑缺血模型[4，5]，氯胺酮(100mg/kg)腹腔注射麻醉小鼠，颈部正中纵行切口，在气管两侧分离出双侧颈总动脉，夹闭10分钟后再恢复脑供血并缝合皮肤。
2.术中夹闭动脉后观察小鼠双侧眼球是否变苍白，术后2、4、6小时小鼠的肢体瘫痪情况。术前及术后三天称重。
3.术后3天断头取双侧大脑组织。10%中性福尔马林固定，一周后石腊包埋常规切片HE染色，光镜下统计双侧海马各区每个高倍视野(400倍)下正常和坏死细胞数。
三、神经行为学观察
1.旷场试验(open field method)，参照大鼠旷场试验箱制作50×50×30cm3的木箱，底面均匀摆置10×10×1 cm3的木块9块，观察小鼠一分钟内过障数(四肢均通过木块的数目)和沿器壁爬立次数。用于观察小鼠的探究行为。
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2.斜板试验(inclined plane method) 将小鼠放在一平滑的木板上，头向持板者。将板逐渐抬高，速度约为4.5°/s，记下小鼠滑下时抬高的角度，重复5次，选取中位数。用于检查小鼠的运动平衡能力[5]。
四、统计分析：两种小鼠的海马正常细胞和坏死细胞计数对比分析、术前术后神经行为结果比较和体重减轻的克数采用成组资料t检验，术中出现眼球变白和术后出现瘫痪的概率采用精确概率法检验(fisher's exact test)。所有统计过程均在计算机上由SPSS8.0版完成。
结 果
一、术中出现心跳骤停死亡在NJS小鼠为4只，雌雄各2只，ICR小鼠2只，均为雄性。术后3天NJS小鼠体重下降较ICR小鼠明显(P<0.001)。
二、术中出现眼球变苍白在NJS小鼠明显多于ICR小鼠(P=0.014)，手术后2小时出现一侧肢体瘫痪，表现为行走时向一侧旋转，在NJS小鼠明显多于ICR小鼠(P=0.026)。随着时间推移，向一侧旋转现象逐渐消失，6小时以后两组小鼠瘫痪情况均消失。(详见表1)。
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表1 NJS小鼠与ICR小鼠短暂脑缺血后症状比较
NJS小鼠
ICR小鼠
P
眼球变苍白
11/14
5/16
0.014
2小时瘫痪
10/14
4/16
0.026
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4小时瘫痪
3/14
1/16
0.315
6小时瘫痪
1/14
0/16
0.467
体重减少(克)
5.1±1.9
2.1±1.3
0.000
注：检验方法为Fisher's Exact Test，(体重减少一项为t Test).
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三、术后72小时两组小鼠的探究行为和平衡功能，可见两组小鼠的探究行为能力下降，并以NJS小鼠的下降更为明显(P<0.05)。而平衡功能的改变则不显著。详见表2。
四、高倍光镜下检测短暂性脑缺血72小时后小鼠双侧海马细胞坏死情况，可见两种小鼠双侧海马均有细胞坏死，相比较而言NJS小鼠除CA4区为右侧海马坏死细胞多于左侧外，CA1、CA2、CA3、齿状核均为左侧坏死细胞数多于右侧，而在ICR小鼠则是所有各区均为右侧海马坏死细胞多于左侧。两种小鼠相比NJS小鼠细胞坏死数要多于ICR小鼠。其中左侧CA1、CA3和齿状核细胞坏死数量的差异有统计学意义。(详见表3)。
表2 两种小鼠短暂性脑缺血后神经行为学观察结果
NJS小鼠
P
ICR小鼠
, 百拇医药
P
术前
术后
术前
术后
过障数
13.7±3.0
10.5±1.9
0.002
9.6±4.8
7.7±5.3
0.27
爬壁数
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7.1±3.4
4.91±2.3
0.04
5.1±3.1
4.5±2.8
0.63
斜板角度
46.2±1.9
45.8±1.8
0.52
36.8±7.2
36.5±4.9
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0.89
注：检验方法为independent samples t test.表3 NJS小鼠与ICR小鼠短暂脑缺血后海马细胞改变的比较
正常细胞数
P
坏死细胞数
P
NJS
ICR
NJS
ICR
CA1左
101±33
, 百拇医药
102±7
0.25
23±23
8±3
0.03
CA1右
115±14
105±20
0.14
15±7
12±6
0.26
CA2左
, 百拇医药
114±36
124±20
0.36
17±21
10±6
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CA2右
109±20
114±19
0.50
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0.42
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CA3左
81±38
101±14
0.06
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CA4左
81±13
85±17
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CA4右
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0.57
齿状核左
390±55
406±14
0.27
109±110
41±41
0.03
齿状核右
387±50
384±62
0.87
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66±47
80±63
0.49
总 和
1525±159
1612±121
0.10
341±169
255±175
0.18
注：检验方法为independent samples t test.讨 论
NJS小鼠具有正常饲料喂养下自发性产生高胆醇血症的生物学特征，而且这种鼠具备了好奇、好动、好争斗、攻击性强等类似A型行为[7]，这两者都是心脑血管病的重要诱发因素[8，9]，因此探讨NJS小鼠脑缺血后神经元和神经行为学的改变具有重要的临床意义。
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海马结构在解剖上易于辨认，并且与人和动物的记忆行为有关。既往在大鼠和沙土鼠的研究认为缺血再灌注后首先出现海马神经元变性坏死的是CA1区的神经元，3天以后整个海马区均可出现神经元迟发性变性坏死。本实验可见利用NJS小鼠行双颈总动脉夹闭再灌注的方法同样可出现类似的改变。此种手术方法简单易行，手术死亡率低，术后存活时间较长，易于进行神经行为学观察。不需要特殊的实验室条件。
从实验结果可以看出NJS小鼠脑循环对缺血的耐受性较ICR小鼠更差，表现在夹闭双侧颈总动脉时死亡的小鼠只数多、眼球变苍白的比例高(P=0.014)、手术后出现肢体瘫痪的概率高(两小时P=0.026)、术后体重下降明显(P<0.001)，另从缺血72小时后海马细胞坏死的情况看，NJS小鼠海马坏死数大于ICR小鼠，在部分海马区(CA1、CA3、左侧齿状核等)的差别有统计学意义等。
从探究活动和斜板实验可以看出，虽然手术后三天两种小鼠 运动功能基本恢复，没有明显的肢体瘫痪症象，但复杂的活动(探究)仍较术前有明显下降，尤以NJS小鼠的越障数降低最明显(P=0.002)。这可能与肢体功能未完全恢复有关，但更可能是与空间定向和思维判断能力降低有关，因为从斜板实验来看，术前术后的差异不大(P>0.05)。说明TIA后海马细胞坏死对探究活动有一定的影响。有关脑缺血的动物模型有很多，但对短暂性脑缺血后的神经行为能力的模型的研究较少，且这些脑梗塞模型比较接近脑栓塞的发病过程，而与部分人群在长期高血脂和动脉硬化的基础上产生的脑血栓形成或短暂性脑缺血发作的发病过程相去甚远。实验数据对临床上短暂性脑缺血发作后患者心理行为改变的研究尚有较大的差距。近来有采用SD大鼠永久性结扎双侧颈总脉来制作慢性脑缺血来研究大鼠的学习和记忆的影响的报道[10]。从本实验结果看NJS小鼠TIA后神经行为学和海马细胞的改变值得我们进一步探讨，其结果将有助于临床上高胆固醇血症病人脑供血不足发作后神经行为、心理方面的研究。
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参考文献
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(收稿日期：1999—12—04), 百拇医药