Ig融合蛋白临床应用前景
作者：孙凯 冯琦 金伯泉
单位：孙凯(第四军医大学西京医院肝胆外科 西安 710032)；冯琦(西就医院血液内科)；金伯泉(第四军医大学免疫教研室)
关键词：免疫球蛋白；融合蛋白；临床应用
中国肿瘤生物治疗杂志000322 摘 要 免疫球蛋白融合蛋白是指在基因水平将目的蛋白基因同Ig部分片段基因相连而表达的重组蛋白，由于同时具有目的蛋白及免疫球蛋白的结构域，使重组蛋白获得了许多新的特性。在感染性疾病、自身免疫性疾病及移植排斥反应的治疗方面有极好的临床应用前景。
《中国图书资料分类法》分类号 R392.11; R967
免疫球蛋白(immunoglobulin, Ig)融合蛋白是指在基因水平将目的蛋白基因同Ig部分片段基因相连，并在真核或原核细胞中表达出的具有上述2部分结构域的重组蛋白。Ig融合蛋白具有许多特性，如①引入重链稳定区，使融合蛋白半衰期明显延长，更适合于重组蛋白在体内应用。②Fc段具有穿过胎盘、结合补体并介导补体依赖的细胞毒作用、结合Fc受体并介导ADCC效应等。③IgG,IgM和IgA的Fc结构域可形成多聚分子，使重组蛋白具有更强的抗原结合力。上述新特性使融合蛋白在下列领域有广泛的临床应用前景。
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1 细菌感染性疾病
1.1 感染性休克的治疗
TNF是机体抵御细菌感染的重要介质，但其过度表达是导致急性肺损伤、心血管系统及其它脏器功能衰竭、死亡的主要原因。文献报道采用TNF mAb治疗能改善上述症状，但仍有较高的死亡率。Ashkenazi等构建了Ⅰ型TNFR和IgG的融合蛋白TNFR/Ig，其二聚体分子与TNF的亲和力较天然TNFR高6～8倍。体外实验中，融合蛋白阻断TNF裂解细胞的能力较可溶性TNFR高24倍，较中和性TNF mAb高4倍。在小鼠接受内毒素半小时前给予融合蛋白能完全预防内毒素诱导的死亡，在接受内毒素后1 h给予融合蛋白仍有明显的保护作用[1]。
在狒狒模型中，接受致死剂量大肠杆菌前注射Ⅰ型TNFR/Ig可使其死亡率由88%降低至12%。在所有实验中，血浆TNF均被中和，在血浆中，仅能检测到无活性的TNF/融合蛋白复合物存在。融合蛋白治疗以剂量依赖方式减轻组织的损伤程度，表现为降低全身性炎症反应，缩短粒细胞减少的时间[2]。上述结果显示了融合蛋白在感染性休克防治中的应用前景。
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IL-10是一种很有潜力的抗炎症因子，但由于其体内半衰期较短而使其在临床中的应用受到限制。通过将IL-10基因与Ig基因重组制备IL-10/IgG2Fc融合蛋白，能明显延长IL-10的半衰期，并保持了IL-10的生物学活性。为避免融合蛋白介导的抗体依赖细胞毒作用及补体的直接细胞毒作用，Zheng等将Fc段进行了突变，突变后的融合蛋白对感染性休克的治疗作用明显强于rIL-10。作者认为无细胞毒作用的IL-10/IgG为深入研究IL-10体内作用提供了有力的工具，并具有治疗感染性休克的应用价值[3]。
1.2 急性肺损伤的治疗
小鼠急性肺损伤模型的病理改变类似成人呼吸窘迫综合征。乳酸脱氢酶水平及肺髓样过氧化物酶水平在急性肺损伤后16 h急剧增高。模型制备前2 h给予TNFR/Ig能有效阻止乳酸脱氢酶、蛋白及肺髓样过氧化物酶水平的升高。组化分析表明，急性肺损伤过程中的血管内白细胞聚集及血管周和支气管周组织损伤由于融合蛋白的应用而明显减轻。在融合蛋白治疗组小鼠的肺组织匀浆中未发现有TNF的生物学活性[4]。
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在大鼠急性肺损伤模型中，Gater比较了Ⅰ型TNFR/Ig和地塞米松的治疗效果。急性肺损伤后24～72 h，支气管肺泡灌洗液中白细胞总数明显增加。预先使用融合蛋白或地塞米松均能抑制24 h的中性粒细胞增多。在72 h，融合蛋白能明显抑制嗜中性粒细胞进入支气管肺泡灌洗液，但对嗜酸性粒细胞数量无抑制作用。而地塞米松对中性粒细胞及嗜酸性粒细胞进入支气管肺泡灌洗液均有抑制作用。上述结果表明，TNF在急性肺损伤时中性粒细胞的募集过程中发挥重要作用[5]。
2 病毒感染性疾病
2.1 HIV的治疗研究
人类免疫缺陷病毒HIV能通过CD4分子胞膜外区第一个V样区进行病毒感染过程，并最终导致获得性免疫缺陷综合征AIDS。因此，封闭CD4有可能达到抑制病毒感染的目的。为了将CD4用于HIV治疗，Chamow等制备了CD4/IgG，包括CD4的V1，V2结构域、人Ig重链绞链区及Fc段。CD4/IgG在体外实验中能与HIV的gp120蛋白结合，阻断HIV的感染过程。此融合蛋白半衰期较长，能通过Fc活化补体，介导抗体依赖细胞介导的细胞毒作用，并能有效穿过胎盘对胎儿起到防护作用。CD4/Ig治疗AIDS已进入Ⅰ期临床验证[6]。
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Allaway等将人IgG2重链及轻链可变区用CD4分子V1和V2结构域替换，此四聚体能以nM级亲和力结合gp120蛋白，其体内半衰期在1 d以上，而sCD4的半衰期仅为15 min。同IgG1融合蛋白相比，CD4/IgG2不能与细胞膜Fc段受体结合，因此它不会产生抗体依赖的增强病毒感染的作用。细胞融合实验证实，同sCD4相比，四聚体CD4/IgG2能有效抑制合胞体形成，抑制细胞间病毒的感染。CD4/IgG2在较低浓度下即能有效中和多种HIV病毒株，有进一步应用于体内的可能性[7]。CD4/IgM抑制HIV病毒的能力较CD4/IgG2强1 000倍以上，且融合蛋白获得了结合Fc受体、结合补体Clq的功能。
嗜碱性粒细胞及肥大细胞是IgE介导的Ⅰ型变态反应的主要效应细胞，它们参与抗寄生虫、病毒及抗细菌免疫。Krauss等构建了CD4/IgE，包括CD4氨基端的2个结构域及IgE重链的CH2～4结构域。重组CD4/IgE同天然IgE对受体的亲和力相同，融合蛋白中CD4结构域同gp120的结合特性也与天然CD4相似。在实验中发现，用CD4/IgE“武装”的嗜碱性粒细胞能在HIV病毒或HIV感染细胞的诱导下释放介质。作者进一步证实HIV结合的嗜碱性粒细胞使易感性T细胞内病毒的复制减弱，上述结果表明，Ⅰ型超敏反应的效应细胞及CD4/IgE有希望应用于HIV的治疗[8]。Batra等将细菌外毒素PE40引入CD4分子，并引入IgG1重链结构域以增加其半衰期。作者分别制备了CD4-CH2-PE40，CD4-CH3-PE40，CD4-CH1-CH2-PE40及CD4-CH2-CH3-PE40融合蛋白。插入的IgG1稳定区对CD4-PE40的毒性无影响。这些融合蛋白对表达gp120蛋白的细胞具有相同的毒性，并具有较长的半衰期，其中，CD4-CH2-PE40半衰期最长，为115 min[9]。
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2.2 鼻病毒感染
粘附分子ICAM-1是90%的人类鼻病毒的受体。文献报道sICAM-1能阻止体外鼻病毒感染的细胞病理变化。Martin将2～5个ICAM-1分子胞膜外结构域与IgA，IgM或IgG1的稳定区相连构建不同的融合蛋白。IgA，IgG融合蛋白表达后为2聚体，IgM融合蛋白为10聚体。其中，含5个ICAM-1氨基端结构域的IgA融合蛋白中和病毒的能力比sICAM-1高150倍。含ICAM-1氨基端2个结构域的IgA或IgM融合蛋白比sICAM-1中和病毒的能力高5倍。结果表明，多价ICAM-1融合蛋白具有更高的中和病毒能力，有应用于鼻病毒感染临床防治的潜力[10]。
3 自身免疫性疾病
3.1 B细胞增殖性疾病
多种肾小球肾炎是由于自身抗体产生引起的。正常情况下，B细胞产生抗体需要T细胞膜表面的CD40L提供共刺激信号。Biancone等通过CD40/Ig干扰CD40/CD40L的相互作用，观察了CD40/Ig对小鼠膜型肾小球肾炎模型的治疗作用。给小鼠注射兔抗鼠肾小管抗体后，能诱导膜型肾小球肾炎。但同时注射CD40/Ig则只有迟发的自身反应，而没有膜型肾小球肾炎损伤。结果提示，干扰CD40/CD40L共刺激信号通路能通过抑制T细胞依赖的抗体产生来阻止膜型肾小球肾炎的发生[11]。
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Chen等用CD40/Ig研究CD40/CD40L相互作用对人/鼠SCID嵌合模型中体液反应的影响。首先，将人外周血淋巴细胞移植入SCID小鼠制备人/鼠SCID嵌合模型，当注射CD40/Ig、特异性抗CD40或CD40L中和抗体后，小鼠多克隆体液免疫反应明显受到抑制。移植人淋巴细胞的同时注射上述中和试剂，可以抑制人抗鼠红细胞抗体及总Ig水平维持10周。上述试剂有望用于抑制人类抗原特异性体液免疫反应，如自身免疫病或过敏反应等[12]。
3.2 自身免疫性关节炎
TNF作为炎症因子参与了类风湿性关节炎的发病机理，其拮抗剂能降低类风湿性关节炎的活动性。Moreland等采用Ⅱ型TNFR/Ig对180个顽固性类风湿性关节炎患者进行了双盲实验。结果3个月后，融合蛋白治疗明显减轻了疾病的活动性，治疗效果呈剂量相关。患者关节肿胀及触痛明显减轻。诊疗过程中无严重毒副作用，未发现抗融合蛋白抗体产生[13]。
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Mori等通过腺病毒载体对大鼠胶原诱导的关节炎动物模型进行了基因治疗实验，给关节炎大鼠注射含TNFR/Ig融合基因的复制缺陷型腺病毒载体。通过检测血清TNFR的表达证实基因转染成功。血清TNFR表达在基因转染8 d后即可检测到，关节炎病损程度明显受到TNFR/Ig基因转染的抑制[14]。对DBA/1小鼠关节炎动物模型，注射Ⅰ型TNFR/IgG1可抑制动物体内TNF活性。在发病早期注射融合蛋白能抑制关节炎模型的发生。在TNFR缺陷小鼠中，关节炎模型发生率较低，即使发生症状也较轻。作者认为Ⅰ型TNFR是TNF炎症作用的主要传导者，但关节炎的发展与Ⅰ型TNFR无关[15]。
Williams等检测了Ⅰ型TNFR/IgG单独或与CD4 mAb合用治疗自身免疫性关节炎的效果。单独Ⅰ型TNFR/IgG能抑制小鼠足垫及四肢的肿胀，将指节间关节末端糜烂的发生率由92%降至50%，采用TNF mAb治疗时的发生率为41%。使用氢化可的松能减轻炎症的临床症状，但对降低糜烂的发生率无影响。Ⅰ型TNFR/IgG与抗CD4 mAb联合能使糜烂的发生率降为17%。结果表明,Ⅰ型TNFR/IgG通过抑制TNF对自身免疫性关节炎具有治疗作用[16]。
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3.3 自身免疫性脑脊髓炎
TNF在自身免疫性疾病发病中的作用可能包括调节血管粘附分子的表达，使白细胞能进入组织，或直接作用导致组织损伤。在试验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)动物实验中，通过注射Ⅰ型TNFR/IgG阻止了脑脊髓炎临床症状的出现。实验表明，Ⅰ型TNFR/IgG能阻止临床症状的产生，但不影响自身反应性T细胞进入并停留于中枢神经系统。在制备EAE模型的同时,使用Ⅰ型TNFR/IgG能阻止动物模型的形成。在制备动物模型时提前注射TNFR/IgG能完全阻止或减轻神经方面的损伤。在TNFR/IgG预处理的大鼠中枢神经系统中，活化T细胞表达正常或稍高水平的VLA4,MHCⅡ类分子及CD25，中枢神经系统中的炎症白细胞减少，活化状态降低。因此，TNFR/IgG起到了抑制活化T细胞及其它炎症白细胞的作用，而正是这些细胞导致了神经系统的损伤[17]。
在慢性复发的实验性过敏性脑脊髓炎(CREAE)动物模型血清中检测不到TNF的生物学活性，但在中枢神经系统中可以检测到TNF-α，颅内注射TNF mAb或TNFR/Ig较全身注射更加有效，提示中枢神经系统可能是TNF特异性的免疫调节部位。在CREAE动物模型中，通过注射TNF mAb或二价TNFR/Ig能明显抑制TNF的活性。预先使用TNF mAb能抑制疾病的发展，即使在出现临床症状时应用TNF mAb亦有治疗效果。上述结果表明,针对TNF，尤其是在中枢神经系统，能抑制CREAE的病情发展[18]。
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4 抗移植排斥反应
共刺激信号分子在T细胞活化中起关键性作用，通过抑制共刺激信号有可能起到抑制T细胞活化的作用。由于CD28与CTLA-4高度同源，因此，大量文献均采用CTLA4/Ig融合蛋白代替CD28进行共刺激信号分子的研究。重组CTLA4/Ig能以高亲和力结合于B7分子，通过CTLA4/Ig阻断CD28/B7的反应能在体内及体外抑制T细胞的活化。在MHC匹配的小鼠角膜移植模型中应用CTLA4/Ig能明显延长移植物的存活[19]。
在器官移植前对供体器官进行基因修饰可能是抑制或控制移植物抗宿主病的一个有效方法。Oral等通过重组腺病毒载体对角膜细胞进行了CTLA-4/Ig基因转染，转染后28 d仍能检测到角膜细胞培养上清中融合蛋白的表达。表达的融合蛋白具有生物学活性，能结合CD80分子。在噬齿类模型中，通过CTLA4/Ig抑制T细胞共刺激信号能延长异体移植物的存活时间，阻断CD40/CD40L反应的mAb与CTLA4/Ig具有协同作用。在恒河猴模型中，CTLA4/Ig与CD40L mAb协同作用要比它们单独作用效率高100倍以上。在肾移植实验中，对照组排斥反应时间为5～8 d，单独应用CTLA4/Ig或CD40L mAb组延长至20～98 d，而两者联合应用组延长至150 d以上[20]。
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5 结 语
上面简要介绍了Ig融合蛋白在感染性疾病、自身免疫性疾病和移植排斥反应中的研究概况。除此以外，Ig融合蛋白还应用于胰岛素抵抗、迟发型变态反应、抗寄生虫免疫等方面的治疗研究。由于,融合蛋白的许多新特性，使其在疾病治疗中同某些天然分子相比具有优越性，并且与免疫球蛋白融合使目的蛋白更易表达，具有更高的产率，有较好的临床应用前景。
本课题受国家自然科学基金(39700065)资助
参 考 文 献
1，Ashkenazi A, Marsters SA, Capon DJ, et al. Protection against endotoxic shock by a tumor necrosis factor receptor immunoadhesin. Proc Natl Acad Sci USA, 1991， 88: 10535
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2，van Zee KJ, Moldawer LL, Oldenburg HS, et al. Protection against lethal Escherichia coli bacteremia in baboons (Papio anubis) by pretreatment with a 55-kDa TNF receptor (CD120a)-Ig fusion protein, Ro 45-2081. J Immunol， 1996， 156: 2221
3，Zheng XX, Steele AW, Nickerson PW, et al. Administration of noncytolytic IL-10/Fc in murine models of lipopolysaccharide-induced septic shock and allogeneic islet transplantation. J Immunol， 1995， 154: 5590
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4，Denis M, Guojian L, Widmer M, et al. A mouse model of lung injury induced by microbial products: Implication of tumor necrosis factor. Am J Respir Cell Mol Biol， 1994， 10: 658
5，Gater PR, Wasserman MA, Paciorek PM, et al. Inhibition of Sephadex-induced lung injury in the rat by Ro 45-2081, a tumor necrosis factor receptor fusion protein. Am J Respir Cell Mol Biol， 1996， 14: 454
6，Chamow SM, Duliege AM, Ammann A, et al. CD4 immunoadhesins in anti-HIV therapy: New developments. Int J Cancer (Suppl), 1992, 7: 69
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7，Allaway GP, Davis-Bruno KL, Beaudry GA, et al. Expression and characterization of CD4-IgG2, a novel heterotetramer that neutralizes primary HIV type 1 isolates. AIDS Res Hum Retroviruses， 1995, 11: 533
8，Krauss S, Kufer P, Federle C, et al. Recombinant CD4-IgE, a novel hybrid molecule, inducing basophils to respond to human immunodeficiency virus (HIV) and HIV-infected target cells. Eur J Immunol， 1995, 25: 192
9，Batra JK, Kasturi S, Gallo MG, et al. Insertion of constant region domains of human IgG1 into CD4-PE40 increases its plasma half-life. Mol Immunol， 1993, 30: 379
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11，Biancone L, Andres G, Ahn H, et al. Inhibition of the CD40-CD40 ligand pathway prevents murine membranous glomerulonephritis. Kidney Int， 1995, 48: 458
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15，Mori L, Iselin S, De Libero G, et al. Attenuation of collagen-induced arthritis in 55 kD TNF receptor type 1 (TNFR1)-IgG1-treated and TNFR1-deficient mice. J Immunol， 1996, 157: 3178
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18，Baker D, Butler D, Scallon BJ, et al. Control of established experimental allergic encephalomyelitis by inhibition of tumor necrosis factor (TNF) activity within the central nervous system using monoclonal antibodies and TNF receptor-immunoglobulin fusion proteins. Eur J Immunol， 1994, 24: 2040
19，Hoffmann F, Zhang EP, Pohl T, et al. Inhibition of corneal allograft reaction by CTLA4-Ig. Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol， 1997, 235: 535
20，Kirk AD, Harlan DM, Armstrong NN, et al. CTLA4-Ig and anti-CD40 ligand prevent renal allograft rejection in primates. Proc Natl Acad Sci USA， 1997, 94: 8789
(1999-08-01收稿； 1999-10-24修回), 百拇医药
单位：孙凯(第四军医大学西京医院肝胆外科 西安 710032)；冯琦(西就医院血液内科)；金伯泉(第四军医大学免疫教研室)
关键词：免疫球蛋白；融合蛋白；临床应用
中国肿瘤生物治疗杂志000322 摘 要 免疫球蛋白融合蛋白是指在基因水平将目的蛋白基因同Ig部分片段基因相连而表达的重组蛋白，由于同时具有目的蛋白及免疫球蛋白的结构域，使重组蛋白获得了许多新的特性。在感染性疾病、自身免疫性疾病及移植排斥反应的治疗方面有极好的临床应用前景。
《中国图书资料分类法》分类号 R392.11; R967
免疫球蛋白(immunoglobulin, Ig)融合蛋白是指在基因水平将目的蛋白基因同Ig部分片段基因相连，并在真核或原核细胞中表达出的具有上述2部分结构域的重组蛋白。Ig融合蛋白具有许多特性，如①引入重链稳定区，使融合蛋白半衰期明显延长，更适合于重组蛋白在体内应用。②Fc段具有穿过胎盘、结合补体并介导补体依赖的细胞毒作用、结合Fc受体并介导ADCC效应等。③IgG,IgM和IgA的Fc结构域可形成多聚分子，使重组蛋白具有更强的抗原结合力。上述新特性使融合蛋白在下列领域有广泛的临床应用前景。
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1 细菌感染性疾病
1.1 感染性休克的治疗
TNF是机体抵御细菌感染的重要介质，但其过度表达是导致急性肺损伤、心血管系统及其它脏器功能衰竭、死亡的主要原因。文献报道采用TNF mAb治疗能改善上述症状，但仍有较高的死亡率。Ashkenazi等构建了Ⅰ型TNFR和IgG的融合蛋白TNFR/Ig，其二聚体分子与TNF的亲和力较天然TNFR高6～8倍。体外实验中，融合蛋白阻断TNF裂解细胞的能力较可溶性TNFR高24倍，较中和性TNF mAb高4倍。在小鼠接受内毒素半小时前给予融合蛋白能完全预防内毒素诱导的死亡，在接受内毒素后1 h给予融合蛋白仍有明显的保护作用[1]。
在狒狒模型中，接受致死剂量大肠杆菌前注射Ⅰ型TNFR/Ig可使其死亡率由88%降低至12%。在所有实验中，血浆TNF均被中和，在血浆中，仅能检测到无活性的TNF/融合蛋白复合物存在。融合蛋白治疗以剂量依赖方式减轻组织的损伤程度，表现为降低全身性炎症反应，缩短粒细胞减少的时间[2]。上述结果显示了融合蛋白在感染性休克防治中的应用前景。
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IL-10是一种很有潜力的抗炎症因子，但由于其体内半衰期较短而使其在临床中的应用受到限制。通过将IL-10基因与Ig基因重组制备IL-10/IgG2Fc融合蛋白，能明显延长IL-10的半衰期，并保持了IL-10的生物学活性。为避免融合蛋白介导的抗体依赖细胞毒作用及补体的直接细胞毒作用，Zheng等将Fc段进行了突变，突变后的融合蛋白对感染性休克的治疗作用明显强于rIL-10。作者认为无细胞毒作用的IL-10/IgG为深入研究IL-10体内作用提供了有力的工具，并具有治疗感染性休克的应用价值[3]。
1.2 急性肺损伤的治疗
小鼠急性肺损伤模型的病理改变类似成人呼吸窘迫综合征。乳酸脱氢酶水平及肺髓样过氧化物酶水平在急性肺损伤后16 h急剧增高。模型制备前2 h给予TNFR/Ig能有效阻止乳酸脱氢酶、蛋白及肺髓样过氧化物酶水平的升高。组化分析表明，急性肺损伤过程中的血管内白细胞聚集及血管周和支气管周组织损伤由于融合蛋白的应用而明显减轻。在融合蛋白治疗组小鼠的肺组织匀浆中未发现有TNF的生物学活性[4]。
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在大鼠急性肺损伤模型中，Gater比较了Ⅰ型TNFR/Ig和地塞米松的治疗效果。急性肺损伤后24～72 h，支气管肺泡灌洗液中白细胞总数明显增加。预先使用融合蛋白或地塞米松均能抑制24 h的中性粒细胞增多。在72 h，融合蛋白能明显抑制嗜中性粒细胞进入支气管肺泡灌洗液，但对嗜酸性粒细胞数量无抑制作用。而地塞米松对中性粒细胞及嗜酸性粒细胞进入支气管肺泡灌洗液均有抑制作用。上述结果表明，TNF在急性肺损伤时中性粒细胞的募集过程中发挥重要作用[5]。
2 病毒感染性疾病
2.1 HIV的治疗研究
人类免疫缺陷病毒HIV能通过CD4分子胞膜外区第一个V样区进行病毒感染过程，并最终导致获得性免疫缺陷综合征AIDS。因此，封闭CD4有可能达到抑制病毒感染的目的。为了将CD4用于HIV治疗，Chamow等制备了CD4/IgG，包括CD4的V1，V2结构域、人Ig重链绞链区及Fc段。CD4/IgG在体外实验中能与HIV的gp120蛋白结合，阻断HIV的感染过程。此融合蛋白半衰期较长，能通过Fc活化补体，介导抗体依赖细胞介导的细胞毒作用，并能有效穿过胎盘对胎儿起到防护作用。CD4/Ig治疗AIDS已进入Ⅰ期临床验证[6]。
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Allaway等将人IgG2重链及轻链可变区用CD4分子V1和V2结构域替换，此四聚体能以nM级亲和力结合gp120蛋白，其体内半衰期在1 d以上，而sCD4的半衰期仅为15 min。同IgG1融合蛋白相比，CD4/IgG2不能与细胞膜Fc段受体结合，因此它不会产生抗体依赖的增强病毒感染的作用。细胞融合实验证实，同sCD4相比，四聚体CD4/IgG2能有效抑制合胞体形成，抑制细胞间病毒的感染。CD4/IgG2在较低浓度下即能有效中和多种HIV病毒株，有进一步应用于体内的可能性[7]。CD4/IgM抑制HIV病毒的能力较CD4/IgG2强1 000倍以上，且融合蛋白获得了结合Fc受体、结合补体Clq的功能。
嗜碱性粒细胞及肥大细胞是IgE介导的Ⅰ型变态反应的主要效应细胞，它们参与抗寄生虫、病毒及抗细菌免疫。Krauss等构建了CD4/IgE，包括CD4氨基端的2个结构域及IgE重链的CH2～4结构域。重组CD4/IgE同天然IgE对受体的亲和力相同，融合蛋白中CD4结构域同gp120的结合特性也与天然CD4相似。在实验中发现，用CD4/IgE“武装”的嗜碱性粒细胞能在HIV病毒或HIV感染细胞的诱导下释放介质。作者进一步证实HIV结合的嗜碱性粒细胞使易感性T细胞内病毒的复制减弱，上述结果表明，Ⅰ型超敏反应的效应细胞及CD4/IgE有希望应用于HIV的治疗[8]。Batra等将细菌外毒素PE40引入CD4分子，并引入IgG1重链结构域以增加其半衰期。作者分别制备了CD4-CH2-PE40，CD4-CH3-PE40，CD4-CH1-CH2-PE40及CD4-CH2-CH3-PE40融合蛋白。插入的IgG1稳定区对CD4-PE40的毒性无影响。这些融合蛋白对表达gp120蛋白的细胞具有相同的毒性，并具有较长的半衰期，其中，CD4-CH2-PE40半衰期最长，为115 min[9]。
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2.2 鼻病毒感染
粘附分子ICAM-1是90%的人类鼻病毒的受体。文献报道sICAM-1能阻止体外鼻病毒感染的细胞病理变化。Martin将2～5个ICAM-1分子胞膜外结构域与IgA，IgM或IgG1的稳定区相连构建不同的融合蛋白。IgA，IgG融合蛋白表达后为2聚体，IgM融合蛋白为10聚体。其中，含5个ICAM-1氨基端结构域的IgA融合蛋白中和病毒的能力比sICAM-1高150倍。含ICAM-1氨基端2个结构域的IgA或IgM融合蛋白比sICAM-1中和病毒的能力高5倍。结果表明，多价ICAM-1融合蛋白具有更高的中和病毒能力，有应用于鼻病毒感染临床防治的潜力[10]。
3 自身免疫性疾病
3.1 B细胞增殖性疾病
多种肾小球肾炎是由于自身抗体产生引起的。正常情况下，B细胞产生抗体需要T细胞膜表面的CD40L提供共刺激信号。Biancone等通过CD40/Ig干扰CD40/CD40L的相互作用，观察了CD40/Ig对小鼠膜型肾小球肾炎模型的治疗作用。给小鼠注射兔抗鼠肾小管抗体后，能诱导膜型肾小球肾炎。但同时注射CD40/Ig则只有迟发的自身反应，而没有膜型肾小球肾炎损伤。结果提示，干扰CD40/CD40L共刺激信号通路能通过抑制T细胞依赖的抗体产生来阻止膜型肾小球肾炎的发生[11]。
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Chen等用CD40/Ig研究CD40/CD40L相互作用对人/鼠SCID嵌合模型中体液反应的影响。首先，将人外周血淋巴细胞移植入SCID小鼠制备人/鼠SCID嵌合模型，当注射CD40/Ig、特异性抗CD40或CD40L中和抗体后，小鼠多克隆体液免疫反应明显受到抑制。移植人淋巴细胞的同时注射上述中和试剂，可以抑制人抗鼠红细胞抗体及总Ig水平维持10周。上述试剂有望用于抑制人类抗原特异性体液免疫反应，如自身免疫病或过敏反应等[12]。
3.2 自身免疫性关节炎
TNF作为炎症因子参与了类风湿性关节炎的发病机理，其拮抗剂能降低类风湿性关节炎的活动性。Moreland等采用Ⅱ型TNFR/Ig对180个顽固性类风湿性关节炎患者进行了双盲实验。结果3个月后，融合蛋白治疗明显减轻了疾病的活动性，治疗效果呈剂量相关。患者关节肿胀及触痛明显减轻。诊疗过程中无严重毒副作用，未发现抗融合蛋白抗体产生[13]。
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Mori等通过腺病毒载体对大鼠胶原诱导的关节炎动物模型进行了基因治疗实验，给关节炎大鼠注射含TNFR/Ig融合基因的复制缺陷型腺病毒载体。通过检测血清TNFR的表达证实基因转染成功。血清TNFR表达在基因转染8 d后即可检测到，关节炎病损程度明显受到TNFR/Ig基因转染的抑制[14]。对DBA/1小鼠关节炎动物模型，注射Ⅰ型TNFR/IgG1可抑制动物体内TNF活性。在发病早期注射融合蛋白能抑制关节炎模型的发生。在TNFR缺陷小鼠中，关节炎模型发生率较低，即使发生症状也较轻。作者认为Ⅰ型TNFR是TNF炎症作用的主要传导者，但关节炎的发展与Ⅰ型TNFR无关[15]。
Williams等检测了Ⅰ型TNFR/IgG单独或与CD4 mAb合用治疗自身免疫性关节炎的效果。单独Ⅰ型TNFR/IgG能抑制小鼠足垫及四肢的肿胀，将指节间关节末端糜烂的发生率由92%降至50%，采用TNF mAb治疗时的发生率为41%。使用氢化可的松能减轻炎症的临床症状，但对降低糜烂的发生率无影响。Ⅰ型TNFR/IgG与抗CD4 mAb联合能使糜烂的发生率降为17%。结果表明,Ⅰ型TNFR/IgG通过抑制TNF对自身免疫性关节炎具有治疗作用[16]。
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3.3 自身免疫性脑脊髓炎
TNF在自身免疫性疾病发病中的作用可能包括调节血管粘附分子的表达，使白细胞能进入组织，或直接作用导致组织损伤。在试验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)动物实验中，通过注射Ⅰ型TNFR/IgG阻止了脑脊髓炎临床症状的出现。实验表明，Ⅰ型TNFR/IgG能阻止临床症状的产生，但不影响自身反应性T细胞进入并停留于中枢神经系统。在制备EAE模型的同时,使用Ⅰ型TNFR/IgG能阻止动物模型的形成。在制备动物模型时提前注射TNFR/IgG能完全阻止或减轻神经方面的损伤。在TNFR/IgG预处理的大鼠中枢神经系统中，活化T细胞表达正常或稍高水平的VLA4,MHCⅡ类分子及CD25，中枢神经系统中的炎症白细胞减少，活化状态降低。因此，TNFR/IgG起到了抑制活化T细胞及其它炎症白细胞的作用，而正是这些细胞导致了神经系统的损伤[17]。
在慢性复发的实验性过敏性脑脊髓炎(CREAE)动物模型血清中检测不到TNF的生物学活性，但在中枢神经系统中可以检测到TNF-α，颅内注射TNF mAb或TNFR/Ig较全身注射更加有效，提示中枢神经系统可能是TNF特异性的免疫调节部位。在CREAE动物模型中，通过注射TNF mAb或二价TNFR/Ig能明显抑制TNF的活性。预先使用TNF mAb能抑制疾病的发展，即使在出现临床症状时应用TNF mAb亦有治疗效果。上述结果表明,针对TNF，尤其是在中枢神经系统，能抑制CREAE的病情发展[18]。
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4 抗移植排斥反应
共刺激信号分子在T细胞活化中起关键性作用，通过抑制共刺激信号有可能起到抑制T细胞活化的作用。由于CD28与CTLA-4高度同源，因此，大量文献均采用CTLA4/Ig融合蛋白代替CD28进行共刺激信号分子的研究。重组CTLA4/Ig能以高亲和力结合于B7分子，通过CTLA4/Ig阻断CD28/B7的反应能在体内及体外抑制T细胞的活化。在MHC匹配的小鼠角膜移植模型中应用CTLA4/Ig能明显延长移植物的存活[19]。
在器官移植前对供体器官进行基因修饰可能是抑制或控制移植物抗宿主病的一个有效方法。Oral等通过重组腺病毒载体对角膜细胞进行了CTLA-4/Ig基因转染，转染后28 d仍能检测到角膜细胞培养上清中融合蛋白的表达。表达的融合蛋白具有生物学活性，能结合CD80分子。在噬齿类模型中，通过CTLA4/Ig抑制T细胞共刺激信号能延长异体移植物的存活时间，阻断CD40/CD40L反应的mAb与CTLA4/Ig具有协同作用。在恒河猴模型中，CTLA4/Ig与CD40L mAb协同作用要比它们单独作用效率高100倍以上。在肾移植实验中，对照组排斥反应时间为5～8 d，单独应用CTLA4/Ig或CD40L mAb组延长至20～98 d，而两者联合应用组延长至150 d以上[20]。
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5 结 语
上面简要介绍了Ig融合蛋白在感染性疾病、自身免疫性疾病和移植排斥反应中的研究概况。除此以外，Ig融合蛋白还应用于胰岛素抵抗、迟发型变态反应、抗寄生虫免疫等方面的治疗研究。由于,融合蛋白的许多新特性，使其在疾病治疗中同某些天然分子相比具有优越性，并且与免疫球蛋白融合使目的蛋白更易表达，具有更高的产率，有较好的临床应用前景。
本课题受国家自然科学基金(39700065)资助
参 考 文 献
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(1999-08-01收稿； 1999-10-24修回), 百拇医药