免疫球蛋白样分子在非淋巴细胞肿瘤中的表达
作者：汪泱 张叔人 何祖根 张友会
单位：汪泱 张叔人 何祖根 张友会(中国医学科学院中国协和医科大学肿瘤研究所 北京 100021)
关键词：Ig；非淋巴细胞肿瘤；异位表达
中国肿瘤生物治疗杂志000321 摘 要 Ig基因由三组不连锁的基因群编码：Igκ，Igλ和IgH基因群。传统免疫学理论认为Ig基因只有在B淋巴细胞中表达。然而，近几年的研究发现在非B细胞来源的恶性肿瘤细胞中也有可能存在Ig基因的转录与表达。这一发现将为我们研究肿瘤癌变机理及肿瘤的生物治疗提供新的理论依据和研究方向。
目前免疫学理论普遍认为，在正常机体内，免疫球蛋白基因只有在B淋巴细胞发育过程中，各基因节段进行选择性重排，转录翻译成有功能的免疫球蛋白，而在其他体细胞中并不发生，即Ig是B淋巴细胞的特有产物。然而，随着对肿瘤研究工作的深入，人们发现许多正常细胞癌变后可能出现基因的表达与调控异常，引起许多因子和激素的异位表达。近几年，国内外几个研究小组发现，非淋巴细胞性恶性肿瘤可能产生免疫球蛋白(Ig)或Ig样物质。
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1 Ig样物质在非淋巴细胞性恶性肿瘤中的发现
八十年代后期，张友会从卵巢癌病人腹水中分离出一种新的免疫抑制因子，而该组份的电泳图谱与人IgG完全一致。流式细胞仪分析显示，从同一份腹水分离的淋巴细胞组份无明显Ig表达，而肿瘤细胞组份却高表达Ig，推测这种Ig有可能来源于癌细胞。
同一时期，邱晓彦用免疫组化方法偶然发现乳癌组织中存在一种可与抗人Ig(包括重链、轻链)抗体发生特异性强阳性反应的物质，而周围残存的乳腺正常上皮及间质为阴性，并且这些间质中很少有浆细胞浸润，提示这种阳性物质是癌细胞产生的。以此为契机，用同样的方法对多种肿瘤组织(上皮来源的和非上皮来源的)及细胞系进行进一步探讨，发现这种阳性物质不但在乳癌、大肠癌、胃癌及肝癌等上皮性肿瘤细胞胞浆中表达，而且部分与恶性肿瘤发生密切相关的增生活跃的上皮组织也呈阳性反应。但在间叶组织的良恶性肿瘤中均未见阳性反应；并且，乳癌、大肠癌、宫颈癌等肿瘤传代细胞也呈阳性反应。为排除培养基中牛血清中的Ig与抗人Ig抗体发生交叉反应的可能性，又进行了无血清培养，进一步确认肿瘤细胞中确实存在一种与标准人IgG分子结构、抗原性相似的蛋白[1]。
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2 从基因水平上进一步证实Ig 样物质在非淋巴细胞恶性肿瘤中的表达
2.1 非淋巴细胞性恶性肿瘤Ig重排的检测
为从基因水平上进一步探讨，邱晓彦用PCR和Southern方法分析了乳癌、大肠癌等癌细胞基因组的Ig基因结构，均发现了Ig基因重排后的片段。其中HL-60(髓系白血病传代细胞)的重排方式与正常Ig基本相同，而MCF-7(乳癌)、HT-29(大肠癌)的重排方式与正常Ig 不同，呈V-J-J重排[2]。
2.2 非淋巴细胞恶性肿瘤中Ig 基因与转化基因Tx关系的探讨
九十年代初，曹亚从鼻咽癌细胞株中分离出转化基因Tx，经同源性比较分析发现，Tx基因中的一个长约2.8 kb、与转化作用有关的片段与人Igκ链C区基因1 209 bp序列高度同源，其同源性高达99.5%以上。其后对这两个片段的酶切图谱分析和Southern 印迹杂交分析均表明这两个基因就是同一种基因：Ig的κ轻链基因。从而提出非淋巴细胞性恶性肿瘤中Ig 基因可能与转化有关[3]。最近又对Tx基因的全序列进行了测序，发现Tx基因中存在与人Igκ链C区和J区高度同源的序列，但没有发现与V区同源的序列。Northern杂交分析表明，该长约2.8 kb的片段可在鼻咽癌细胞株中检测到1.3 kb的mRNA，经翻译成为游离的κ蛋白。而且经原位分子杂交显示这种表达在EB 病毒阳性的细胞中较强烈，提示Tx基因的表达与EB病毒之间存在着某种相关性[4]。最近，深入研究表明，LMP1(EB病毒膜潜伏蛋白)及其激活的转录因子NF-κB之间的相互作用中，LMP1能通过P65激活NF-κB，而NF-κB能调控κ链的表达。这为感染EBV的细胞中表达Igκ链提出了可能的调控机制。
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2.3 非淋巴细胞恶性肿瘤中存在Ig基因的转录
Kimoto在97和98年相继报道了用巢式RT-PCR的方法，在非血细胞来源的多种肿瘤细胞系中检测到免疫球蛋白5种基因重链恒定区部分外显子转录的基因片断[5]。此后，我室也对这种异位表达的Ig基因进行了检测。在MCF-7(乳癌)，PC3M(前列腺癌)中，检测到了Cδ基因外显子4与外显子5之间部分mRNA的转录本。在一定程度上，进一步证实了在非淋巴细胞恶性肿瘤中有可能存在Ig基因的转录。
3 引起Ig样物质表达可能的原因和意义
这种非淋巴细胞性恶性肿瘤中可能存在的Ig样物质的生物活性目前还不清楚。不同的实验室提出了不同的理解和认识。七十年代初，一些实验室已发现在恶性肿瘤患者血液内确实存在抗体升高的现象，用亲和层析的方法去除荷瘤动物及恶性肿瘤患者血浆中的Ig及Ig复合物，再将血浆回输给荷瘤动物及恶性肿瘤患者后，产生明显疗效。张友会发现从癌性腹水中分离出Ig蛋白组份有明显抑制淋巴细胞增殖的活性，提示这类非淋巴细胞恶性肿瘤中表达的Ig是肿瘤抑制淋巴细胞转化的免疫抑制因子之一。而曹亚通过对Tx转化基因与Igκ轻链的同源性比较，提出这种异位表达的Ig可能与肿瘤的恶性转化有关，而这种异位表达与EB病毒有一定的关系。
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但Kimoto对此有不同的看法，他用与上述同样的实验方法在肿瘤细胞中检测到了TCR-α基因的转录本，在淋巴细胞中检测到了粘蛋白基因等多种基因的非特异性转录本。在解释这种现象时，他认为这种异位表达是一种任一基因的低水平转录本，可能没有功能和分化意义[6]。但事实上，Kimoto的实验经过了五轮半巢式PCR，终产物在PAGE胶上依稀可见。而我室在检测该基因转录本时，用两轮半巢式PCR(PC3M仅用了一轮PCR)，终产物在琼脂糖凝胶上即清晰可辨。可见，这种Ig的表达似乎并不象Kimoto所述的那么低。而获得的Cδ片段分别来自不同的外显子，显然需转录和加工，似乎不是无效转录。这种差别是否反映了该异位表达的不稳定性还有待进一步研究。
Ig的表达是受多因素调控的复杂过程，肿瘤细胞为什么会出现这种异位表达的现象，不同的实验室有不同的推测，但无论是检测到了该基因的重排还是转录产物，都需要从Ig基因表达调控水平上去寻找发生这种异位表达现象的原因; IgH基因的转录和重排受到多种调节元件和调节因子的作用，从基因结构上分，主要由四部分组成：V 区5′端的promoter(PVH)；位于J 链及 C区之间的intronic enhancer及其邻近的DQ52 promoter/enhancer和位于C 区下游包含多个HS(高敏位点)的3′enhancer。其中，5′promoter及intronic enhancer，DQ52 promoter/enhancer 主要与B细胞发育早期V-D-J重排及IgH基因的转录密切相关，而3′enhancer与B 细胞对抗原的反应及重链基因的类别转换有关[7]。Ig基因的表达调控是一个十分复杂的过程。肿瘤细胞异位表达Ig的现象提示我们在肿瘤细胞中可能存在上述的调节元件的活化，但也有可能存在新的调控机制。
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目前，IgH 转录本的检测提示，重链恒定区的转录本较易检测到，而VDJ重排区较难测到。虽然目前检测到了IgH基因重链恒定区的片段，但其转录本是否完整？转录出的Ig与正常B 细胞的Ig有何不同？肿瘤细胞这种异位表达的Ig的生物学活性如何？这些问题都有待于进一步研究。探讨Ig在癌细胞中的表达将为癌变机理提供新的理论依据，进而为肿瘤治疗提供新的启示。
参 考 文 献
1，邱晓彦， 杨贵贞. 恶性肿瘤细胞内存在免疫球蛋白样物质. 白求恩医科大学学报， 1996， 6: 572
2，邱晓彦， 候春梅， 沈继铭. HL-60细胞Ig样蛋白的表达及IgH V-D-J序列分析. 中华血液杂志， 1999， 20: 6
3，曹 亚， 孙 毅， 黄周琪， 等. 对鼻咽癌恶性转化基因Tx表达的初步研究. 生物化学杂志， 1995， 11(4): 381
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4，胡维新， 曹 亚， 黎民敬， 等. 人类鼻咽癌细胞株CNE2的转化基因的一个EcoRⅠ片段的核苷酸序列分析. 生物化学杂志， 1993， 9(3): 331
5，Kimoto Y. Expression of heavy-chain constant region of Ig and T-cell receptor gene transcripts in human non-hematopoietic tumor cell lines. Genes Chromosomes Cancer， 1998， 22(1): 83
6，Kimoto Y. A single human cell express all messenger ribonucleic acids: The arrow of time in a cell. Mol Gen Genet， 1998， 258: 233
7，Magor BG， Ross DA， Pilstrom L， et al. Transcription enhancers and the evolution of the IgH locus. Immunol Today， 1999， 28: 13
(2000-01-24收稿； 2000-06-02修回), http://www.100md.com
单位：汪泱 张叔人 何祖根 张友会(中国医学科学院中国协和医科大学肿瘤研究所 北京 100021)
关键词：Ig；非淋巴细胞肿瘤；异位表达
中国肿瘤生物治疗杂志000321 摘 要 Ig基因由三组不连锁的基因群编码：Igκ，Igλ和IgH基因群。传统免疫学理论认为Ig基因只有在B淋巴细胞中表达。然而，近几年的研究发现在非B细胞来源的恶性肿瘤细胞中也有可能存在Ig基因的转录与表达。这一发现将为我们研究肿瘤癌变机理及肿瘤的生物治疗提供新的理论依据和研究方向。
目前免疫学理论普遍认为，在正常机体内，免疫球蛋白基因只有在B淋巴细胞发育过程中，各基因节段进行选择性重排，转录翻译成有功能的免疫球蛋白，而在其他体细胞中并不发生，即Ig是B淋巴细胞的特有产物。然而，随着对肿瘤研究工作的深入，人们发现许多正常细胞癌变后可能出现基因的表达与调控异常，引起许多因子和激素的异位表达。近几年，国内外几个研究小组发现，非淋巴细胞性恶性肿瘤可能产生免疫球蛋白(Ig)或Ig样物质。
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1 Ig样物质在非淋巴细胞性恶性肿瘤中的发现
八十年代后期，张友会从卵巢癌病人腹水中分离出一种新的免疫抑制因子，而该组份的电泳图谱与人IgG完全一致。流式细胞仪分析显示，从同一份腹水分离的淋巴细胞组份无明显Ig表达，而肿瘤细胞组份却高表达Ig，推测这种Ig有可能来源于癌细胞。
同一时期，邱晓彦用免疫组化方法偶然发现乳癌组织中存在一种可与抗人Ig(包括重链、轻链)抗体发生特异性强阳性反应的物质，而周围残存的乳腺正常上皮及间质为阴性，并且这些间质中很少有浆细胞浸润，提示这种阳性物质是癌细胞产生的。以此为契机，用同样的方法对多种肿瘤组织(上皮来源的和非上皮来源的)及细胞系进行进一步探讨，发现这种阳性物质不但在乳癌、大肠癌、胃癌及肝癌等上皮性肿瘤细胞胞浆中表达，而且部分与恶性肿瘤发生密切相关的增生活跃的上皮组织也呈阳性反应。但在间叶组织的良恶性肿瘤中均未见阳性反应；并且，乳癌、大肠癌、宫颈癌等肿瘤传代细胞也呈阳性反应。为排除培养基中牛血清中的Ig与抗人Ig抗体发生交叉反应的可能性，又进行了无血清培养，进一步确认肿瘤细胞中确实存在一种与标准人IgG分子结构、抗原性相似的蛋白[1]。
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2 从基因水平上进一步证实Ig 样物质在非淋巴细胞恶性肿瘤中的表达
2.1 非淋巴细胞性恶性肿瘤Ig重排的检测
为从基因水平上进一步探讨，邱晓彦用PCR和Southern方法分析了乳癌、大肠癌等癌细胞基因组的Ig基因结构，均发现了Ig基因重排后的片段。其中HL-60(髓系白血病传代细胞)的重排方式与正常Ig基本相同，而MCF-7(乳癌)、HT-29(大肠癌)的重排方式与正常Ig 不同，呈V-J-J重排[2]。
2.2 非淋巴细胞恶性肿瘤中Ig 基因与转化基因Tx关系的探讨
九十年代初，曹亚从鼻咽癌细胞株中分离出转化基因Tx，经同源性比较分析发现，Tx基因中的一个长约2.8 kb、与转化作用有关的片段与人Igκ链C区基因1 209 bp序列高度同源，其同源性高达99.5%以上。其后对这两个片段的酶切图谱分析和Southern 印迹杂交分析均表明这两个基因就是同一种基因：Ig的κ轻链基因。从而提出非淋巴细胞性恶性肿瘤中Ig 基因可能与转化有关[3]。最近又对Tx基因的全序列进行了测序，发现Tx基因中存在与人Igκ链C区和J区高度同源的序列，但没有发现与V区同源的序列。Northern杂交分析表明，该长约2.8 kb的片段可在鼻咽癌细胞株中检测到1.3 kb的mRNA，经翻译成为游离的κ蛋白。而且经原位分子杂交显示这种表达在EB 病毒阳性的细胞中较强烈，提示Tx基因的表达与EB病毒之间存在着某种相关性[4]。最近，深入研究表明，LMP1(EB病毒膜潜伏蛋白)及其激活的转录因子NF-κB之间的相互作用中，LMP1能通过P65激活NF-κB，而NF-κB能调控κ链的表达。这为感染EBV的细胞中表达Igκ链提出了可能的调控机制。
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2.3 非淋巴细胞恶性肿瘤中存在Ig基因的转录
Kimoto在97和98年相继报道了用巢式RT-PCR的方法，在非血细胞来源的多种肿瘤细胞系中检测到免疫球蛋白5种基因重链恒定区部分外显子转录的基因片断[5]。此后，我室也对这种异位表达的Ig基因进行了检测。在MCF-7(乳癌)，PC3M(前列腺癌)中，检测到了Cδ基因外显子4与外显子5之间部分mRNA的转录本。在一定程度上，进一步证实了在非淋巴细胞恶性肿瘤中有可能存在Ig基因的转录。
3 引起Ig样物质表达可能的原因和意义
这种非淋巴细胞性恶性肿瘤中可能存在的Ig样物质的生物活性目前还不清楚。不同的实验室提出了不同的理解和认识。七十年代初，一些实验室已发现在恶性肿瘤患者血液内确实存在抗体升高的现象，用亲和层析的方法去除荷瘤动物及恶性肿瘤患者血浆中的Ig及Ig复合物，再将血浆回输给荷瘤动物及恶性肿瘤患者后，产生明显疗效。张友会发现从癌性腹水中分离出Ig蛋白组份有明显抑制淋巴细胞增殖的活性，提示这类非淋巴细胞恶性肿瘤中表达的Ig是肿瘤抑制淋巴细胞转化的免疫抑制因子之一。而曹亚通过对Tx转化基因与Igκ轻链的同源性比较，提出这种异位表达的Ig可能与肿瘤的恶性转化有关，而这种异位表达与EB病毒有一定的关系。
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但Kimoto对此有不同的看法，他用与上述同样的实验方法在肿瘤细胞中检测到了TCR-α基因的转录本，在淋巴细胞中检测到了粘蛋白基因等多种基因的非特异性转录本。在解释这种现象时，他认为这种异位表达是一种任一基因的低水平转录本，可能没有功能和分化意义[6]。但事实上，Kimoto的实验经过了五轮半巢式PCR，终产物在PAGE胶上依稀可见。而我室在检测该基因转录本时，用两轮半巢式PCR(PC3M仅用了一轮PCR)，终产物在琼脂糖凝胶上即清晰可辨。可见，这种Ig的表达似乎并不象Kimoto所述的那么低。而获得的Cδ片段分别来自不同的外显子，显然需转录和加工，似乎不是无效转录。这种差别是否反映了该异位表达的不稳定性还有待进一步研究。
Ig的表达是受多因素调控的复杂过程，肿瘤细胞为什么会出现这种异位表达的现象，不同的实验室有不同的推测，但无论是检测到了该基因的重排还是转录产物，都需要从Ig基因表达调控水平上去寻找发生这种异位表达现象的原因; IgH基因的转录和重排受到多种调节元件和调节因子的作用，从基因结构上分，主要由四部分组成：V 区5′端的promoter(PVH)；位于J 链及 C区之间的intronic enhancer及其邻近的DQ52 promoter/enhancer和位于C 区下游包含多个HS(高敏位点)的3′enhancer。其中，5′promoter及intronic enhancer，DQ52 promoter/enhancer 主要与B细胞发育早期V-D-J重排及IgH基因的转录密切相关，而3′enhancer与B 细胞对抗原的反应及重链基因的类别转换有关[7]。Ig基因的表达调控是一个十分复杂的过程。肿瘤细胞异位表达Ig的现象提示我们在肿瘤细胞中可能存在上述的调节元件的活化，但也有可能存在新的调控机制。
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目前，IgH 转录本的检测提示，重链恒定区的转录本较易检测到，而VDJ重排区较难测到。虽然目前检测到了IgH基因重链恒定区的片段，但其转录本是否完整？转录出的Ig与正常B 细胞的Ig有何不同？肿瘤细胞这种异位表达的Ig的生物学活性如何？这些问题都有待于进一步研究。探讨Ig在癌细胞中的表达将为癌变机理提供新的理论依据，进而为肿瘤治疗提供新的启示。
参 考 文 献
1，邱晓彦， 杨贵贞. 恶性肿瘤细胞内存在免疫球蛋白样物质. 白求恩医科大学学报， 1996， 6: 572
2，邱晓彦， 候春梅， 沈继铭. HL-60细胞Ig样蛋白的表达及IgH V-D-J序列分析. 中华血液杂志， 1999， 20: 6
3，曹 亚， 孙 毅， 黄周琪， 等. 对鼻咽癌恶性转化基因Tx表达的初步研究. 生物化学杂志， 1995， 11(4): 381
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4，胡维新， 曹 亚， 黎民敬， 等. 人类鼻咽癌细胞株CNE2的转化基因的一个EcoRⅠ片段的核苷酸序列分析. 生物化学杂志， 1993， 9(3): 331
5，Kimoto Y. Expression of heavy-chain constant region of Ig and T-cell receptor gene transcripts in human non-hematopoietic tumor cell lines. Genes Chromosomes Cancer， 1998， 22(1): 83
6，Kimoto Y. A single human cell express all messenger ribonucleic acids: The arrow of time in a cell. Mol Gen Genet， 1998， 258: 233
7，Magor BG， Ross DA， Pilstrom L， et al. Transcription enhancers and the evolution of the IgH locus. Immunol Today， 1999， 28: 13
(2000-01-24收稿； 2000-06-02修回), http://www.100md.com