RT-PCR法检测恶性肿瘤细胞端粒酶RNA组分的研究
作者：周俊宜 罗超权
单位：周俊宜 罗超权(中山医科大学生化教研室 广州 510080)
关键词：端粒酶；RT-PCR；诱导分化
中国肿瘤生物治疗杂志000331 《中国图书资料分类法》分类号 Q756
自近年来,Morin等首次在癌细胞株中检测到端粒酶活性并进而研究统计出有85%以上的恶性肿瘤细胞中端粒酶活性为阳性而正常细胞和良性肿瘤中为阴性以后，端粒酶及其与恶性肿瘤的关系成为人们广泛关注的一个研究热点。本研究采用RT-PCR方法从恶性肿瘤细胞端粒酶粗提物中检测端粒酶RNA组分，反转录人端粒酶RNA组分获得成功；并进一步采用此法对ATRA诱导的癌细胞株进行RNA组分的检测，观察端粒酶RNA组分在恶性细胞诱导分化过程中的变化情况，对进一步探讨人端粒酶各组分在恶性肿瘤发生发展中的关系有重要意义。
将Hela细胞端粒酶粗提物用蛋白酶κ(10 mg/ml)于37℃消化1 h后作为RT-PCR第一链合成的模板，反转录反应条件为45℃作用45 min。PCR反应参数为94℃ 45 s，55℃ 45 s，72℃ 90 s，共循环35次，最后72℃ 10 min。以不加AWV-RTase为阴性对照组。引物序列如下：
5′端引物为：5′-CGAGAATTCTGGGAGGGGTGGTG GCCA，3′端引物为：5′-TCAGGATCCGTTATATCCTACTGCT CA。
培养大肠癌细胞Lovo株并以ATRA进行诱导分化。分别在加药后的第2，4，6天收集细胞，计数，TRAP法检测各阶段细胞端粒酶活性。对各阶段端粒酶粗提物用蛋白酶κ消化，取消化产物10 μl进行RT-PCR反应。
由实验结果可见，以TRAP法检测Hela细胞端粒酶活性，可见典型的梯形条带。Hela细胞及大肠癌诱导分化各阶段细胞端粒酶RNA组分的RT-PCR产物经5%的聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定，均可见到一条清晰条带，大小与预计的相符合。
ATRA诱导分化各阶段大肠癌细胞的端粒酶活性，第4，6天ATRA诱导细胞的检测结果，其活性均明显被抑制，尤其在第4天后条带明显减弱且有片段变小现象。
人端粒酶的RNA组分是端粒酶的重要组成部分，它在延伸端粒的过程中作为合成端粒的模板。本研究采用RT-PCR的方法从Hela细胞的提取液中扩增出端粒酶RNA组分的DNA片段，不仅进一步明确了端粒酶作为一种核糖核酸逆转录酶的组成特点，而且对更深入地探讨其RNA组分的组成结构以及与恶性肿瘤的关系均具有十分重要的意义。
全反式维甲酸(ATRA)能诱导恶性细胞向正常转化，本研究结果发现，诱导第2天端粒酶活性已开始减弱，第4，6天其活性均明显被抑制，条带减少且有片段变小现象。与此同时用RT-PCR的方法检测它们的RNA组分，在诱导分化的各阶段皆可扩增出端粒酶RNA 的特异性条带，与Hela细胞和未诱导分化的大肠癌细胞相比较并无差异，说明人端粒酶RNA组分与细胞恶性程度并无平行关系。
本课题为国家自然科学基金(39670715)资助项目
(1999-06-28收稿； 1999-09-17修回), 百拇医药
单位：周俊宜 罗超权(中山医科大学生化教研室 广州 510080)
关键词：端粒酶；RT-PCR；诱导分化
中国肿瘤生物治疗杂志000331 《中国图书资料分类法》分类号 Q756
自近年来,Morin等首次在癌细胞株中检测到端粒酶活性并进而研究统计出有85%以上的恶性肿瘤细胞中端粒酶活性为阳性而正常细胞和良性肿瘤中为阴性以后，端粒酶及其与恶性肿瘤的关系成为人们广泛关注的一个研究热点。本研究采用RT-PCR方法从恶性肿瘤细胞端粒酶粗提物中检测端粒酶RNA组分，反转录人端粒酶RNA组分获得成功；并进一步采用此法对ATRA诱导的癌细胞株进行RNA组分的检测，观察端粒酶RNA组分在恶性细胞诱导分化过程中的变化情况，对进一步探讨人端粒酶各组分在恶性肿瘤发生发展中的关系有重要意义。
将Hela细胞端粒酶粗提物用蛋白酶κ(10 mg/ml)于37℃消化1 h后作为RT-PCR第一链合成的模板，反转录反应条件为45℃作用45 min。PCR反应参数为94℃ 45 s，55℃ 45 s，72℃ 90 s，共循环35次，最后72℃ 10 min。以不加AWV-RTase为阴性对照组。引物序列如下：
5′端引物为：5′-CGAGAATTCTGGGAGGGGTGGTG GCCA，3′端引物为：5′-TCAGGATCCGTTATATCCTACTGCT CA。
培养大肠癌细胞Lovo株并以ATRA进行诱导分化。分别在加药后的第2，4，6天收集细胞，计数，TRAP法检测各阶段细胞端粒酶活性。对各阶段端粒酶粗提物用蛋白酶κ消化，取消化产物10 μl进行RT-PCR反应。
由实验结果可见，以TRAP法检测Hela细胞端粒酶活性，可见典型的梯形条带。Hela细胞及大肠癌诱导分化各阶段细胞端粒酶RNA组分的RT-PCR产物经5%的聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定，均可见到一条清晰条带，大小与预计的相符合。
ATRA诱导分化各阶段大肠癌细胞的端粒酶活性，第4，6天ATRA诱导细胞的检测结果，其活性均明显被抑制，尤其在第4天后条带明显减弱且有片段变小现象。
人端粒酶的RNA组分是端粒酶的重要组成部分，它在延伸端粒的过程中作为合成端粒的模板。本研究采用RT-PCR的方法从Hela细胞的提取液中扩增出端粒酶RNA组分的DNA片段，不仅进一步明确了端粒酶作为一种核糖核酸逆转录酶的组成特点，而且对更深入地探讨其RNA组分的组成结构以及与恶性肿瘤的关系均具有十分重要的意义。
全反式维甲酸(ATRA)能诱导恶性细胞向正常转化，本研究结果发现，诱导第2天端粒酶活性已开始减弱，第4，6天其活性均明显被抑制，条带减少且有片段变小现象。与此同时用RT-PCR的方法检测它们的RNA组分，在诱导分化的各阶段皆可扩增出端粒酶RNA 的特异性条带，与Hela细胞和未诱导分化的大肠癌细胞相比较并无差异，说明人端粒酶RNA组分与细胞恶性程度并无平行关系。
本课题为国家自然科学基金(39670715)资助项目
(1999-06-28收稿； 1999-09-17修回), 百拇医药