精氨酸酶对人APL原代细胞生长和分化的影响
作者：梁实
单位：梁实(香港驻军医院 深圳 518048)
关键词：精氨酸酶；白血病；早幼粒细胞；细胞分化
中国肿瘤生物治疗杂志000306 摘 要 目的： 了解精氨酸酶对人急性早幼粒白血病原代细胞生长和分化的影响。方法： 在RPMI 1640培养液中补加10%胎牛血清和精氨酸酶500 U/L，与对照组培养液同时置于37℃孵箱中孵育24 h，以活细胞密度5×108/L接种来自18例急性早幼粒白血病病人的原代白血病细胞，在37℃，5% CO2和饱和湿度下培养。结果： 培养4 d计数活细胞，发现其密度为起始密度的(64.28±3.12)%,而对照组为(108.56±12.27)% (P<0.001)；收集细胞行Wright-Giemsa、DNA、POX、NAE及NaF抑制试验、墨汁吞噬试验和NBT还原试验等细胞化学染色，油镜下观察发现，白血病细胞向成熟分叶核粒细胞分化。结论： 精氨酸酶对APL原代细胞有抑制生长和引导分化作用。
, 百拇医药
《中国图书资料分类法》分类号 R733.7
The Effects of Arginase on Human Primary APL Cell's Growth and Differentiation
Liang Shi
(Hong Kong Garrison Hospital of PLA, Shenzhen 518048)
Abstract Objective: To investigate the effects of arginase on human primary APL cell's growth and differentiation. Methods: Added 10% fetal calf sera and arginase 500 U/L into RPMI 1640 cell culture base,and incubated the test and the control culture bases at 37℃ for 24 hours,then inoculated the living cells at the density of 5×108/L, incubated the cells at 37℃,5%CO2 and saturation humidity for 4 days. Results: The living cell density became (64.28±3.12)% of the initial, but the control was (108.56±12.27)% of the initial(P<0.001). The cells were collected, smeard and stained with Wright-Giemsa,DNA,POX,NAE and NaF inhibition,gulping ink and NBT etc. cytochemical technology. It was found that the cells differentiated to mature lobocyte under the oil lens. Conclusion: Arginase can inhibit human primary APL cell's growth and induce it into lobocyte.
, 百拇医药
Key words arginase； leukemia； promyelocyte； cell differentiation
氨基酸(amino acid, AA)对白血病细胞生长和分化有重要影响，并且白血病细胞与正常细胞AA代谢有差异。为进一步探索精氨酸酶对人急性早幼粒白血病(acute promyelocyte leukemia,APL)原代细胞生长和分化的影响，进行了本研究。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 培养液
RPMI 1640培养基干粉(GIBCO)，用三蒸水按说明书配制，每升加青霉素和链霉素各10万单位，用0.22 μm微孔滤膜正压过滤，补加10%灭活胎牛血清(军事医学科学院)。按实验要求补加精氨酸酶(arginase，SIGMA)500 U/L，并和对照组(加同体积生理盐水)同时置37℃孵箱中孵育24 h，然后接种细胞。孵育24 h后，经BECKMAN 121 MB全自动AA分析仪检测，加精氨酸酶组，精氨酸浓度为18.276×10-8 μmol/L，对照组精氨酸浓度为1 400 μmol/L。
, 百拇医药
1.1.2 APL原代细胞
用淋巴细胞分离液(上海试剂二厂)分别提取18例未经治疗的APL病人外周血单个核细胞。
1.2 方法
1.2.1 培养条件
37℃，5%CO2，饱和湿度。
1.2.2 活细胞计数
每9滴细胞悬液加1滴4%台盼蓝溶液，3 min后计数拒染细胞。
1.2.3 细胞化学试验及染色
Wright-Giemsa、Peroxidase (POX)、α-Naphthyl Butyrate Esterase (NAE)及Sodium Floride (NaF)抑制试验、DNA染色和墨汁吞噬试验均按常规方法进行。 Nitroblue Tetrazolium(NBT)还原试验染色按文献[1]方法进行。
, 百拇医药
1.2.4 对细胞生长、分化情况的研究
分别在实验组和对照组培养液中接种细胞，起始活细胞密度为5×108/L，培养4 d计数活细胞密度，并制片、干燥、染色，于油镜下行细胞形态学观察。
2 结 果
作者对不同精氨酸酶浓度下U937，K562细胞生长的情况在另文中[3]已报道，当精氨酸酶浓度达500 U/L时即可有效地抑制其生长，再增加酶的浓度抑制率增加不明显，精氨酸酶在这一浓度下对正常人骨髓CFU-GM抑制率为12%。在不同精氨酸酶浓度下对APL原代细胞培养，取得了相似的剂量效应曲线，故本文的研究亦采用了这一浓度。培养18例病人的APL原代细胞4 d, 发现其活细胞密度为起始活细胞密度的(64.28±3.12)%，而对照组为(108.56±12.27)%(见表1),说明其生长受到抑制，抑制率为44.28%。
, 百拇医药
APL原代细胞呈典型早幼粒细胞形态，圆或椭圆形，胞浆中布满粗大噬天青颗粒，胞核圆或椭圆，可见核仁。经精氨酸酶500 U/L作用4 d，观察Wright-Giemsa染色涂片发现，细胞浆内粗大噬天青颗粒消失，代之以散在的细小粉红色颗粒，大部分细胞分化为成熟分叶核粒细胞和杆状核粒细胞，但其细胞核形态与人正常成熟粒细胞又有所不同，其折转盘曲，核突增多。DNA染色显示核型亦以分叶核及杆状核为主。其POX染色12例,4例,2例。NAE染色7例，+8例，阴性3例，氟化钠抑制试验除1例阳性外，其余均为阴性。墨汁吞噬阳性率(71.61±6.02)%与对照组(17.61±2.57)%相比有非常显著性(P<0.001)，NBT还原阳性率(88.39±21.50)%与对照组(9.56±1.25)% 相比有非常显著性(P<0.001)。
表1 精氨酸酶作用4 d对18例APL病人原代白血病细胞生长和分化的影响
Tab. 1 The growth and differentiation changes of primary APL cells from 18 patients
, 百拇医药
induced by arginase (500 U/L) for 4 days (%,
±s) Arginase
(U/L)
Ratio to initial
living cell number
Promyelocyte
& myelocyte
Metamyelocyte
Stab cell
Lobocyte
, 百拇医药
500
64.28±3.12△
7.94±2.67△
12.39±4.15△
18.55±3.45△
61.06±7.64△
Control
108.56±12.27
91.94±2.15
3.67±1.33
, 百拇医药
2.28±1.18
2.11±1.23
△ P<0.001,compared with the control
3 讨 论
作者曾观察到非淋巴白血病U937和K562细胞对精氨酸和谷氨酰胺消耗很大[2]，精氨酸酶或剥夺谷氨酰胺对这2种细胞有明显抑制作用和诱导分化作用[3～6]。Pilzer等[7]报道急性早幼粒白血病HL-60细胞在缺乏精氨酸等单一AA条件下，向成熟粒细胞方向分化；Nichols和Weinberg[8]报道HL-60细胞在缺乏精氨酸条件下，向成熟单核细胞方向分化。以上研究观察对象均为细胞株，尽管均来自人白血病细胞，但与原代细胞有差异。
本文对18例病人的APL原代细胞进行了研究，观察到精氨酸酶对细胞有明显抑制作用。经精氨酸酶500 U/L作用4 d，细胞在形态上向成熟粒细胞分化。其POX染色以强阳性为主，NAE染色以弱阳性为主，并且不被氟化钠所抑制，进一步说明细胞分化方向为粒系。墨汁吞噬试验阳性率明显高于对照组，NBT还原阳性率亦明显高于对照组，进一步说明细胞向成熟分化了。精氨酸酶对人APL原代细胞的作用可能与其使培养基中精氨酸降解有关，但本研究并不排除精氨酸酶本身的作用。
, 百拇医药
缺乏某些AA可以使白血病细胞生长及蛋白质合成受抑，这是否是导致细胞向成熟分化的直接原因？似乎是否定的。Pilzer等[7]发现，放线菌酮、嘌呤霉素、吐根碱等蛋白合成抑制剂及葡萄糖缺乏均可使HL-60细胞生长和蛋白质合成受抑，但均不能使之向成熟分化。组氨酚(histidinol)是组氨酸tRNA合成酶抑制剂，可导致非氨酰化(无负载)tRNA-His积聚，在培养基中加入1×10-8 mol/L组氨酚即可使HL-60细胞向成熟分化。无负载tRNA积聚可能与诱导分化过程中基因表达调节引起的mRNA识别的变化有关。在缺乏精氨酸时，其相应无负载tRNA同样会增多，可能会引起类似的效应。
梁实,男,37岁,副 主任医师,主要从事肿瘤和血液病专业的研究.
参 考 文 献
1，青木延雄， 柴田 昭. 血液学研究检查法. 孙素莲译. 北京: 科学出版社, 1986. 194
, http://www.100md.com
2，梁 实. 对U937、K562白血病细胞氨基酸代谢的研究. 解放军医学杂志, 1995, 20(2): 127
3，梁 实. 精氨酸酶对U937、K562细胞生长的抑制. 中国病理生理杂志, 1994, 10(7): 776
4，梁 实. 谷氨酰胺缺乏对U937、K562细胞生长的抑制. 营养学报, 1994, 16(2): 155
5，梁 实. Arginase和剥夺Gln对K562细胞的诱导分化. 营养学报, 1995, 17(2): 147
6，梁 实, 郭秀芝. 精氨酸酶对急性非淋巴白血病细胞的诱导分化. 营养学报, 1996, 18(2): 145
7，Pilzer RB, Berghe GVD, Bose RE. Induction of HL-60 cell differentiation by starvation for a single essential amino acid but not by protein inhibitor. J Clin Invest, 1987, 29(3): 1006
8，Nichols KE,Weinberg JB. Essential amino acid deprivation induces monocytic differentiation of the human HL-60 myeloid leukemia cell line. Blood, 1989, 73(5): 1298
(2000-01-23收稿； 2000-04-24修回), 百拇医药
单位：梁实(香港驻军医院 深圳 518048)
关键词：精氨酸酶；白血病；早幼粒细胞；细胞分化
中国肿瘤生物治疗杂志000306 摘 要 目的： 了解精氨酸酶对人急性早幼粒白血病原代细胞生长和分化的影响。方法： 在RPMI 1640培养液中补加10%胎牛血清和精氨酸酶500 U/L，与对照组培养液同时置于37℃孵箱中孵育24 h，以活细胞密度5×108/L接种来自18例急性早幼粒白血病病人的原代白血病细胞，在37℃，5% CO2和饱和湿度下培养。结果： 培养4 d计数活细胞，发现其密度为起始密度的(64.28±3.12)%,而对照组为(108.56±12.27)% (P<0.001)；收集细胞行Wright-Giemsa、DNA、POX、NAE及NaF抑制试验、墨汁吞噬试验和NBT还原试验等细胞化学染色，油镜下观察发现，白血病细胞向成熟分叶核粒细胞分化。结论： 精氨酸酶对APL原代细胞有抑制生长和引导分化作用。
, 百拇医药
《中国图书资料分类法》分类号 R733.7
The Effects of Arginase on Human Primary APL Cell's Growth and Differentiation
Liang Shi
(Hong Kong Garrison Hospital of PLA, Shenzhen 518048)
Abstract Objective: To investigate the effects of arginase on human primary APL cell's growth and differentiation. Methods: Added 10% fetal calf sera and arginase 500 U/L into RPMI 1640 cell culture base,and incubated the test and the control culture bases at 37℃ for 24 hours,then inoculated the living cells at the density of 5×108/L, incubated the cells at 37℃,5%CO2 and saturation humidity for 4 days. Results: The living cell density became (64.28±3.12)% of the initial, but the control was (108.56±12.27)% of the initial(P<0.001). The cells were collected, smeard and stained with Wright-Giemsa,DNA,POX,NAE and NaF inhibition,gulping ink and NBT etc. cytochemical technology. It was found that the cells differentiated to mature lobocyte under the oil lens. Conclusion: Arginase can inhibit human primary APL cell's growth and induce it into lobocyte.
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Key words arginase； leukemia； promyelocyte； cell differentiation
氨基酸(amino acid, AA)对白血病细胞生长和分化有重要影响，并且白血病细胞与正常细胞AA代谢有差异。为进一步探索精氨酸酶对人急性早幼粒白血病(acute promyelocyte leukemia,APL)原代细胞生长和分化的影响，进行了本研究。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 培养液
RPMI 1640培养基干粉(GIBCO)，用三蒸水按说明书配制，每升加青霉素和链霉素各10万单位，用0.22 μm微孔滤膜正压过滤，补加10%灭活胎牛血清(军事医学科学院)。按实验要求补加精氨酸酶(arginase，SIGMA)500 U/L，并和对照组(加同体积生理盐水)同时置37℃孵箱中孵育24 h，然后接种细胞。孵育24 h后，经BECKMAN 121 MB全自动AA分析仪检测，加精氨酸酶组，精氨酸浓度为18.276×10-8 μmol/L，对照组精氨酸浓度为1 400 μmol/L。
, 百拇医药
1.1.2 APL原代细胞
用淋巴细胞分离液(上海试剂二厂)分别提取18例未经治疗的APL病人外周血单个核细胞。
1.2 方法
1.2.1 培养条件
37℃，5%CO2，饱和湿度。
1.2.2 活细胞计数
每9滴细胞悬液加1滴4%台盼蓝溶液，3 min后计数拒染细胞。
1.2.3 细胞化学试验及染色
Wright-Giemsa、Peroxidase (POX)、α-Naphthyl Butyrate Esterase (NAE)及Sodium Floride (NaF)抑制试验、DNA染色和墨汁吞噬试验均按常规方法进行。 Nitroblue Tetrazolium(NBT)还原试验染色按文献[1]方法进行。
, 百拇医药
1.2.4 对细胞生长、分化情况的研究
分别在实验组和对照组培养液中接种细胞，起始活细胞密度为5×108/L，培养4 d计数活细胞密度，并制片、干燥、染色，于油镜下行细胞形态学观察。
2 结 果
作者对不同精氨酸酶浓度下U937，K562细胞生长的情况在另文中[3]已报道，当精氨酸酶浓度达500 U/L时即可有效地抑制其生长，再增加酶的浓度抑制率增加不明显，精氨酸酶在这一浓度下对正常人骨髓CFU-GM抑制率为12%。在不同精氨酸酶浓度下对APL原代细胞培养，取得了相似的剂量效应曲线，故本文的研究亦采用了这一浓度。培养18例病人的APL原代细胞4 d, 发现其活细胞密度为起始活细胞密度的(64.28±3.12)%，而对照组为(108.56±12.27)%(见表1),说明其生长受到抑制，抑制率为44.28%。
, 百拇医药
APL原代细胞呈典型早幼粒细胞形态，圆或椭圆形，胞浆中布满粗大噬天青颗粒，胞核圆或椭圆，可见核仁。经精氨酸酶500 U/L作用4 d，观察Wright-Giemsa染色涂片发现，细胞浆内粗大噬天青颗粒消失，代之以散在的细小粉红色颗粒，大部分细胞分化为成熟分叶核粒细胞和杆状核粒细胞，但其细胞核形态与人正常成熟粒细胞又有所不同，其折转盘曲，核突增多。DNA染色显示核型亦以分叶核及杆状核为主。其POX染色12例,4例,2例。NAE染色7例，+8例，阴性3例，氟化钠抑制试验除1例阳性外，其余均为阴性。墨汁吞噬阳性率(71.61±6.02)%与对照组(17.61±2.57)%相比有非常显著性(P<0.001)，NBT还原阳性率(88.39±21.50)%与对照组(9.56±1.25)% 相比有非常显著性(P<0.001)。
表1 精氨酸酶作用4 d对18例APL病人原代白血病细胞生长和分化的影响
Tab. 1 The growth and differentiation changes of primary APL cells from 18 patients
, 百拇医药
induced by arginase (500 U/L) for 4 days (%,
±s) Arginase(U/L)
Ratio to initial
living cell number
Promyelocyte
& myelocyte
Metamyelocyte
Stab cell
Lobocyte
, 百拇医药
500
64.28±3.12△
7.94±2.67△
12.39±4.15△
18.55±3.45△
61.06±7.64△
Control
108.56±12.27
91.94±2.15
3.67±1.33
, 百拇医药
2.28±1.18
2.11±1.23
△ P<0.001,compared with the control
3 讨 论
作者曾观察到非淋巴白血病U937和K562细胞对精氨酸和谷氨酰胺消耗很大[2]，精氨酸酶或剥夺谷氨酰胺对这2种细胞有明显抑制作用和诱导分化作用[3～6]。Pilzer等[7]报道急性早幼粒白血病HL-60细胞在缺乏精氨酸等单一AA条件下，向成熟粒细胞方向分化；Nichols和Weinberg[8]报道HL-60细胞在缺乏精氨酸条件下，向成熟单核细胞方向分化。以上研究观察对象均为细胞株，尽管均来自人白血病细胞，但与原代细胞有差异。
本文对18例病人的APL原代细胞进行了研究，观察到精氨酸酶对细胞有明显抑制作用。经精氨酸酶500 U/L作用4 d，细胞在形态上向成熟粒细胞分化。其POX染色以强阳性为主，NAE染色以弱阳性为主，并且不被氟化钠所抑制，进一步说明细胞分化方向为粒系。墨汁吞噬试验阳性率明显高于对照组，NBT还原阳性率亦明显高于对照组，进一步说明细胞向成熟分化了。精氨酸酶对人APL原代细胞的作用可能与其使培养基中精氨酸降解有关，但本研究并不排除精氨酸酶本身的作用。
, 百拇医药
缺乏某些AA可以使白血病细胞生长及蛋白质合成受抑，这是否是导致细胞向成熟分化的直接原因？似乎是否定的。Pilzer等[7]发现，放线菌酮、嘌呤霉素、吐根碱等蛋白合成抑制剂及葡萄糖缺乏均可使HL-60细胞生长和蛋白质合成受抑，但均不能使之向成熟分化。组氨酚(histidinol)是组氨酸tRNA合成酶抑制剂，可导致非氨酰化(无负载)tRNA-His积聚，在培养基中加入1×10-8 mol/L组氨酚即可使HL-60细胞向成熟分化。无负载tRNA积聚可能与诱导分化过程中基因表达调节引起的mRNA识别的变化有关。在缺乏精氨酸时，其相应无负载tRNA同样会增多，可能会引起类似的效应。
梁实,男,37岁,副 主任医师,主要从事肿瘤和血液病专业的研究.
参 考 文 献
1，青木延雄， 柴田 昭. 血液学研究检查法. 孙素莲译. 北京: 科学出版社, 1986. 194
, http://www.100md.com
2，梁 实. 对U937、K562白血病细胞氨基酸代谢的研究. 解放军医学杂志, 1995, 20(2): 127
3，梁 实. 精氨酸酶对U937、K562细胞生长的抑制. 中国病理生理杂志, 1994, 10(7): 776
4，梁 实. 谷氨酰胺缺乏对U937、K562细胞生长的抑制. 营养学报, 1994, 16(2): 155
5，梁 实. Arginase和剥夺Gln对K562细胞的诱导分化. 营养学报, 1995, 17(2): 147
6，梁 实, 郭秀芝. 精氨酸酶对急性非淋巴白血病细胞的诱导分化. 营养学报, 1996, 18(2): 145
7，Pilzer RB, Berghe GVD, Bose RE. Induction of HL-60 cell differentiation by starvation for a single essential amino acid but not by protein inhibitor. J Clin Invest, 1987, 29(3): 1006
8，Nichols KE,Weinberg JB. Essential amino acid deprivation induces monocytic differentiation of the human HL-60 myeloid leukemia cell line. Blood, 1989, 73(5): 1298
(2000-01-23收稿； 2000-04-24修回), 百拇医药