肢体缺血再灌注致肠损伤及甘露醇的保护作用
作者：陈建常 史振满 王乐农 卢开柏
单位：陈建常(兰州军区乌鲁木齐总医院全军骨科中心，新疆乌鲁木齐 830000)；史振满(兰州军区乌鲁木齐总医院全军骨科中心，新疆乌鲁木齐 830000)；王乐农(兰州军区乌鲁木齐总医院全军骨科中心，新疆乌鲁木齐 830000)；卢开柏(兰州军区乌鲁木齐总医院全军骨科中心，新疆乌鲁木齐 830000)
关键词：甘露醇；肢体；缺血再灌注；肠损伤；保护作用
中国急救医学000310 摘 要：目的 通过动物实验观察甘露醇对肢体缺血再灌注所致肠损伤的保护作用。方法 80只Wistar大白鼠随机分成正常对照组，缺血3小时和缺血3小时用甘露醇3个组。实验组于缺血、再灌注1、2、3和24小时取材光镜对比观察和组织学评估。结果 肢体缺血和再灌注后，实验组肠粘膜固有层毛细血管扩张、充血、大量多核白细胞浸润。大肠和小肠粘膜厚度和隐窝深度明显减少(P<0.01)，小肠绒毛高度相对增加(P<0.01)，隐窝细胞有变性坏死，用甘露醇组的病变明显轻于未用甘露醇组。结论 甘露醇能有效地减轻肢体缺血再灌注所致的肠损伤。
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分类号：R574.5；R 969.4 文献标识码：A
文章编号：1002-1949(2000)03-0153-02
Protective effect of mannitol on intestinal injury after lower limb ischemic reperfusion
CHEN Jian-chang,SHI Zhen-man,WANG Le-nong,et al.
Department of Orthopaedics Ulumqi General Hospital of Lan Zhou Command,Ulumqi,830000,China
Abstract：Objective An experimental study to observe protective effect of Mannitol on intestinal injury after lower limb ischemic reperfusion injury.Methods Eighty rats were divided into control group,ischemia 3 hours and ischemia 3 hours group treated with mannitol.The histological assessment of the bowel were undertaken at 0,1,2,3 and 24 hours after reperfusion.Result It was found that microvascular congestion aggregation of large amount of polymorphonuclear neutrophil(PMN) within the lamina propria was observed in experimental groups at the different times.The bowel showed a significant decreased in mucosal thickness and crypt depth,and a significant increased in villus height of small bowel compared with control.Degeneration and necrosis of crypt cells were found in experimental groups.There was a significant lessening of the injury in the group treated with Mannitol.Conclusion These data suggest that Mannitol can alleviat the intestinal injury after lower limb ischemic reperfusion.
, 百拇医药
Key words：Mannitol; Limb; Ischemic reperfusion; Intestinal injury; Protective effect▲
近年来，许多作者研究发现脓毒血症和多器官功能不全与肠结构破坏和屏障功能下降有关[1]，最近国外有人报道肢体缺血再灌注可导致肠粘膜结构和功能改变[2]，但对如何减轻和预防这种损伤尚无报告，为此我们用Wistar大鼠作为动物模型，并用甘露醇作为保护剂，观察了肢体缺血再灌注所致的肠形态学变化及甘露醇的保护作用。
1 材料与方法
1.1 动物与分组 健康Wistar大鼠80只，体重350～450 g，随机分成三个组，Ⅰ组：正常对照组(10只)，Ⅱ组：缺血3小时组(50只)，Ⅲ组：用甘露醇组(20只)，用于再灌注3小时和24小时作对比观察研究。
, 百拇医药
1.2 动物模型 术前12小时禁食，用质量分数3%戊巴比妥钠(40 mg/kg)腹腔麻醉，实验组后肢大腿中部用橡皮止血带环扎，制成双侧后肢缺血模型，用药组于肢体恢复血流前30分钟腹腔注射20%甘露醇(3 g/kg)，达肢体缺血时间后撤去止血带，恢复肢体血流，继续饲养和观察。
1.3 取材与观察 Ⅱ组于缺血，再灌1、2、3、24小时，Ⅲ组于再灌注3、24小时，用颈椎脱位法分批各处死10只鼠，在距回盲部0.5 cm回肠末端和结肠近端分别取回肠和结肠1 cm，生理盐水冲洗后浸入10%福尔马林48小时以上，脱水、包埋，5 μm切片，HE染色，光镜下对比观察。低倍显微镜下(100×)测量小肠粘膜厚度和隐窝深度。油镜下(1 000×)计算粘膜固有层每个高倍视野多核白细胞(PMN)数，每个动物分别随机测10个值，取平均值(
±s)作统计学t检验处理。
2 结果
, 百拇医药
2.1 组织形态学观察 Ⅱ组缺血期间小肠粘膜基底膜水肿，绒毛血管扩张、充血，PMN增多，隐窝变浅，绒毛变细且相对稍变长，再灌注后这种变化更加明显，可见隐窝细胞变性、坏死，部分绒毛顶部细胞有变性。而大肠无论在缺血期，还是在灌注期仅见粘膜固有层血管扩张、充血和少量PMN增加，无明显细胞变性坏死。而用甘露醇组(Ⅲ组)肠粘膜虽有病理变化，但明显轻于缺血3小时而未用甘露醇组(Ⅱ组)。
2.2 粘膜成分厚度测量 Ⅱ组缺血和再灌注后小肠粘膜厚度和隐窝深度较对照组明显减少(P<0.01)，绒毛除了变细外，其高度相对增加(P<0.01)，再灌注24小时这种改变最明显。大肠粘膜厚度和隐窝深度较对照组也明显减少(P<0.01)。用甘露醇组与未用甘露醇组相同时间点比较，这些病变相对明显减轻(P<0.01)。
2.3 粘膜PMN计数 高倍镜下粘膜固有层PMN计数，Ⅱ组大肠和小肠均明显多于对照组(P<0.01)，而缺血3小时用甘露醇组的PMN数则明显少于未用甘露醇组(P<0.01)。小肠粘膜固有层PMN的聚集明显多于大肠。
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3 讨论
本研究在光镜下对肠粘膜各成份组织结构和PMN数时行定量分析，与传统分级和打分的方法[3]相比较更敏感和更可靠，这种定量观察分析的方法对一些组织形态学变化不太明显的肠损伤评估意义更大。
本研究的定性和定量研究结果表明肢体缺血再灌注可致肠粘膜结构改变和隐窝细胞变性、坏死，其病变规律类似于肢体本身的缺血再灌注损伤，也是再灌注期重于缺血期。Yassin[2]研究发现病变主要集中于小肠，而大肠无明显变化。我们的观察虽说大肠粘膜变薄，隐窝变浅，但无细胞变性和坏死，其病理变化也主要集中在小肠，表明小肠比大肠更易受损伤。与肠局部缺血再灌注损伤相比，病变的部位不同，肠缺血再灌注损伤病变主要为绒毛细胞的变性坏死，一般从绒毛顶部向基底部扩展，不累及或很少累及隐窝[4]，而我们的观察发现病变主要集中在隐窝细胞的变性、坏死，绒毛细胞则很少受累。
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肢体缺血再灌注致远隔器官损伤的机理不十分清楚，一些作者认为与活性氧自由基有关[5]。肢体缺血恢复血流后，组织供氧和利用氧增加，许多氧在黄嘌呤氧化酶的作用下产生大量自由基，除造成肢体自身的缺血再灌注损伤外，还可通过血流转移到远隔组织器官引发脂质过氧化损伤，使一些远隔器官也受累，造成一种间接损伤。由于小肠比大肠易感性高，黄嘌呤氧化酶浓度也明显高于大肠，因此其损伤也明显重于大肠。中性白细胞的激活被认为是造成远隔器官损伤的另一原因[6]。我们的研究也发现肠粘膜固有层PMN明显增加，也证明了这一点。肢体缺血刺激白细胞活化，肢体恢复血流后，活化的中性白细胞随血流转移到远隔组织器官，引发“呼吸爆发”，加上自由基的作用远隔器官中大量中性白细胞聚集并被活化，反过来又产生大量自由基，并释放颗粒物质，自由基引发脂质过氧化反应，释放颗粒内的蛋白酶消化和分解弹性蛋白和胶原蛋白，造成组织损伤和血管通透性增加。另外还可能与自由基和前列腺素Ⅱ等细胞介质激活肥大细胞造成肠粘膜损伤有关。
甘露醇是一种高渗脱水剂和自由基清除剂，实验结果表明其对肢体缺血再灌注所致肠损伤有较好的保护作用，其作用机制主要有两个方面：①高渗脱水剂作用，减少水流入细胞内，维持细胞容积，防止组织细胞和血管内皮细胞损伤，从而改善微循环；②自由基清除剂作用，特别是对羟自由基的清除，减少了颗粒物质的释放和脂质过氧化反应对组织的损伤[7]。
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参考文献：
[1]Pape Hc,Dwenger A,Regel G,et al.Increased gut permeability after multiple trauma[J].Br J Surg,1994,8:850.
[2]Yassin MMI,Barros D SA AAB,Parks TG,et al.Lower limb ischemia-reperfusion injury alters gastrointestinal structure and function[J].Br J Surg,1997,8:1425.
[3]Illyes G,Hamar J.Sequence of morphological alteration in small intestinal ischemia-reperfusion model of anaesthetised rat.A light microscopy study[J].Int J Exp Pathol,1992,73:161.
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[4]Parks DA,Granger DN.Contribution of ischemia and reperfusion to mucosal lesion formation[J].AMJ Physiol,1986,250:G 749.
[5]Soong CV,Young IS,Lightbody JH,et al.Reduction of free radical generation minimises limb swelling following femoropoliteal[J].Eur J Vasc Surg,1994,8:435.
[6]Klausner JM,Anner H,Paterson IS,et al.Lower torso ischemia-induced lung injury is leukocyte dependent[J].Ann Surg,1988,208:761.
[7]Stewart JR,Blaker WH,Crute SL,et al.Prevention of myocardial ischemia/reperfusion injury with oxygen free-radical[J].Surgical Foun,1982,33:317.
收稿日期：1999-06-09
修稿日期：1999-09-21, http://www.100md.com
单位：陈建常(兰州军区乌鲁木齐总医院全军骨科中心，新疆乌鲁木齐 830000)；史振满(兰州军区乌鲁木齐总医院全军骨科中心，新疆乌鲁木齐 830000)；王乐农(兰州军区乌鲁木齐总医院全军骨科中心，新疆乌鲁木齐 830000)；卢开柏(兰州军区乌鲁木齐总医院全军骨科中心，新疆乌鲁木齐 830000)
关键词：甘露醇；肢体；缺血再灌注；肠损伤；保护作用
中国急救医学000310 摘 要：目的 通过动物实验观察甘露醇对肢体缺血再灌注所致肠损伤的保护作用。方法 80只Wistar大白鼠随机分成正常对照组，缺血3小时和缺血3小时用甘露醇3个组。实验组于缺血、再灌注1、2、3和24小时取材光镜对比观察和组织学评估。结果 肢体缺血和再灌注后，实验组肠粘膜固有层毛细血管扩张、充血、大量多核白细胞浸润。大肠和小肠粘膜厚度和隐窝深度明显减少(P<0.01)，小肠绒毛高度相对增加(P<0.01)，隐窝细胞有变性坏死，用甘露醇组的病变明显轻于未用甘露醇组。结论 甘露醇能有效地减轻肢体缺血再灌注所致的肠损伤。
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分类号：R574.5；R 969.4 文献标识码：A
文章编号：1002-1949(2000)03-0153-02
Protective effect of mannitol on intestinal injury after lower limb ischemic reperfusion
CHEN Jian-chang,SHI Zhen-man,WANG Le-nong,et al.
Department of Orthopaedics Ulumqi General Hospital of Lan Zhou Command,Ulumqi,830000,China
Abstract：Objective An experimental study to observe protective effect of Mannitol on intestinal injury after lower limb ischemic reperfusion injury.Methods Eighty rats were divided into control group,ischemia 3 hours and ischemia 3 hours group treated with mannitol.The histological assessment of the bowel were undertaken at 0,1,2,3 and 24 hours after reperfusion.Result It was found that microvascular congestion aggregation of large amount of polymorphonuclear neutrophil(PMN) within the lamina propria was observed in experimental groups at the different times.The bowel showed a significant decreased in mucosal thickness and crypt depth,and a significant increased in villus height of small bowel compared with control.Degeneration and necrosis of crypt cells were found in experimental groups.There was a significant lessening of the injury in the group treated with Mannitol.Conclusion These data suggest that Mannitol can alleviat the intestinal injury after lower limb ischemic reperfusion.
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Key words：Mannitol; Limb; Ischemic reperfusion; Intestinal injury; Protective effect▲
近年来，许多作者研究发现脓毒血症和多器官功能不全与肠结构破坏和屏障功能下降有关[1]，最近国外有人报道肢体缺血再灌注可导致肠粘膜结构和功能改变[2]，但对如何减轻和预防这种损伤尚无报告，为此我们用Wistar大鼠作为动物模型，并用甘露醇作为保护剂，观察了肢体缺血再灌注所致的肠形态学变化及甘露醇的保护作用。
1 材料与方法
1.1 动物与分组 健康Wistar大鼠80只，体重350～450 g，随机分成三个组，Ⅰ组：正常对照组(10只)，Ⅱ组：缺血3小时组(50只)，Ⅲ组：用甘露醇组(20只)，用于再灌注3小时和24小时作对比观察研究。
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1.2 动物模型 术前12小时禁食，用质量分数3%戊巴比妥钠(40 mg/kg)腹腔麻醉，实验组后肢大腿中部用橡皮止血带环扎，制成双侧后肢缺血模型，用药组于肢体恢复血流前30分钟腹腔注射20%甘露醇(3 g/kg)，达肢体缺血时间后撤去止血带，恢复肢体血流，继续饲养和观察。
1.3 取材与观察 Ⅱ组于缺血，再灌1、2、3、24小时，Ⅲ组于再灌注3、24小时，用颈椎脱位法分批各处死10只鼠，在距回盲部0.5 cm回肠末端和结肠近端分别取回肠和结肠1 cm，生理盐水冲洗后浸入10%福尔马林48小时以上，脱水、包埋，5 μm切片，HE染色，光镜下对比观察。低倍显微镜下(100×)测量小肠粘膜厚度和隐窝深度。油镜下(1 000×)计算粘膜固有层每个高倍视野多核白细胞(PMN)数，每个动物分别随机测10个值，取平均值(
±s)作统计学t检验处理。2 结果
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2.1 组织形态学观察 Ⅱ组缺血期间小肠粘膜基底膜水肿，绒毛血管扩张、充血，PMN增多，隐窝变浅，绒毛变细且相对稍变长，再灌注后这种变化更加明显，可见隐窝细胞变性、坏死，部分绒毛顶部细胞有变性。而大肠无论在缺血期，还是在灌注期仅见粘膜固有层血管扩张、充血和少量PMN增加，无明显细胞变性坏死。而用甘露醇组(Ⅲ组)肠粘膜虽有病理变化，但明显轻于缺血3小时而未用甘露醇组(Ⅱ组)。
2.2 粘膜成分厚度测量 Ⅱ组缺血和再灌注后小肠粘膜厚度和隐窝深度较对照组明显减少(P<0.01)，绒毛除了变细外，其高度相对增加(P<0.01)，再灌注24小时这种改变最明显。大肠粘膜厚度和隐窝深度较对照组也明显减少(P<0.01)。用甘露醇组与未用甘露醇组相同时间点比较，这些病变相对明显减轻(P<0.01)。
2.3 粘膜PMN计数 高倍镜下粘膜固有层PMN计数，Ⅱ组大肠和小肠均明显多于对照组(P<0.01)，而缺血3小时用甘露醇组的PMN数则明显少于未用甘露醇组(P<0.01)。小肠粘膜固有层PMN的聚集明显多于大肠。
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3 讨论
本研究在光镜下对肠粘膜各成份组织结构和PMN数时行定量分析，与传统分级和打分的方法[3]相比较更敏感和更可靠，这种定量观察分析的方法对一些组织形态学变化不太明显的肠损伤评估意义更大。
本研究的定性和定量研究结果表明肢体缺血再灌注可致肠粘膜结构改变和隐窝细胞变性、坏死，其病变规律类似于肢体本身的缺血再灌注损伤，也是再灌注期重于缺血期。Yassin[2]研究发现病变主要集中于小肠，而大肠无明显变化。我们的观察虽说大肠粘膜变薄，隐窝变浅，但无细胞变性和坏死，其病理变化也主要集中在小肠，表明小肠比大肠更易受损伤。与肠局部缺血再灌注损伤相比，病变的部位不同，肠缺血再灌注损伤病变主要为绒毛细胞的变性坏死，一般从绒毛顶部向基底部扩展，不累及或很少累及隐窝[4]，而我们的观察发现病变主要集中在隐窝细胞的变性、坏死，绒毛细胞则很少受累。
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肢体缺血再灌注致远隔器官损伤的机理不十分清楚，一些作者认为与活性氧自由基有关[5]。肢体缺血恢复血流后，组织供氧和利用氧增加，许多氧在黄嘌呤氧化酶的作用下产生大量自由基，除造成肢体自身的缺血再灌注损伤外，还可通过血流转移到远隔组织器官引发脂质过氧化损伤，使一些远隔器官也受累，造成一种间接损伤。由于小肠比大肠易感性高，黄嘌呤氧化酶浓度也明显高于大肠，因此其损伤也明显重于大肠。中性白细胞的激活被认为是造成远隔器官损伤的另一原因[6]。我们的研究也发现肠粘膜固有层PMN明显增加，也证明了这一点。肢体缺血刺激白细胞活化，肢体恢复血流后，活化的中性白细胞随血流转移到远隔组织器官，引发“呼吸爆发”，加上自由基的作用远隔器官中大量中性白细胞聚集并被活化，反过来又产生大量自由基，并释放颗粒物质，自由基引发脂质过氧化反应，释放颗粒内的蛋白酶消化和分解弹性蛋白和胶原蛋白，造成组织损伤和血管通透性增加。另外还可能与自由基和前列腺素Ⅱ等细胞介质激活肥大细胞造成肠粘膜损伤有关。
甘露醇是一种高渗脱水剂和自由基清除剂，实验结果表明其对肢体缺血再灌注所致肠损伤有较好的保护作用，其作用机制主要有两个方面：①高渗脱水剂作用，减少水流入细胞内，维持细胞容积，防止组织细胞和血管内皮细胞损伤，从而改善微循环；②自由基清除剂作用，特别是对羟自由基的清除，减少了颗粒物质的释放和脂质过氧化反应对组织的损伤[7]。
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参考文献：
[1]Pape Hc,Dwenger A,Regel G,et al.Increased gut permeability after multiple trauma[J].Br J Surg,1994,8:850.
[2]Yassin MMI,Barros D SA AAB,Parks TG,et al.Lower limb ischemia-reperfusion injury alters gastrointestinal structure and function[J].Br J Surg,1997,8:1425.
[3]Illyes G,Hamar J.Sequence of morphological alteration in small intestinal ischemia-reperfusion model of anaesthetised rat.A light microscopy study[J].Int J Exp Pathol,1992,73:161.
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[4]Parks DA,Granger DN.Contribution of ischemia and reperfusion to mucosal lesion formation[J].AMJ Physiol,1986,250:G 749.
[5]Soong CV,Young IS,Lightbody JH,et al.Reduction of free radical generation minimises limb swelling following femoropoliteal[J].Eur J Vasc Surg,1994,8:435.
[6]Klausner JM,Anner H,Paterson IS,et al.Lower torso ischemia-induced lung injury is leukocyte dependent[J].Ann Surg,1988,208:761.
[7]Stewart JR,Blaker WH,Crute SL,et al.Prevention of myocardial ischemia/reperfusion injury with oxygen free-radical[J].Surgical Foun,1982,33:317.
收稿日期：1999-06-09
修稿日期：1999-09-21, http://www.100md.com