肝组织SOD、LPO水平与肝纤维化血清标志物的相关关系探讨
作者：扈晓宇 陈云凤 罗丽华 (指导)王再谟
单位：成都中医药大学，四川 成都 610075
关键词：肝组织；SOD；LPO；肝纤维化血清标志物
成都中医药大学学报000321 摘 要： 目的：研究肝组织SOD、LPO水平与肝纤维化血清标志物的相关关系。方法：采用CCL4复合因素复制肝纤维化动物模型，同时予以秋水仙碱、肝心宁灌胃治疗，观察对肝组织匀浆SOD(超氧化物岐化酶)、LPO(过氧化脂质)、血清HA(透明质酸)、LN(板层素)、PC-Ⅲ(Ⅲ型前胶原)、C-Ⅳ(Ⅳ型胶原)的影响，并分别做SOD、LPO与HA、LN、PC-Ⅲ、C-Ⅳ的相关回归分析。结果：肝组织SOD含量与ALT、C-Ⅳ呈负相关(P均<0.05)，与Alb呈正相关(P<0.05)；肝组织LPO值与LN、HA水平呈正相关(P<均0.01)。结论：肝组织SOD、LPO的含量与某些肝纤维化血清标志物水平密切相关。
, 百拇医药
中图分类号： R575.2 文献标识码：A 文章编号：1004-0668(2000)03-0040-02
近年来，自由基和质脂过氧化损伤在各种急慢性肝病发生、发展中的作用已受到重视[1]，但慢性肝损伤、肝纤维化是多因素参与的复杂过程，国内对氧化作用与肝纤维化关系的相关性研究较少，我们对肝组织SOD、LPO水平与肝纤维化血清标志物的相关关系进行了探讨，现将结果报告如下。
1 材料与方法
1.1 药品与试剂
肝心宁(GanXinNing. GXN)：由丹参、女贞子、何首乌、五味子、茵陈、连翘、甘草组成，由广汉市中草药研究所制成硫浸膏，批号：970420；秋水仙碱：匈牙利Laboratoyes Houde公司提供，批号：961113。分别用双蒸水稀释至适当浓度备用。HA、 LN试剂盒由上海海军医学研究所提供；C-IV试剂盒由北京化学试剂研究所提供；PC-III试剂盒由重庆肿瘤研究所提供， SOD、LPO试剂盒由南京建成生物工程研究所提供；硫代巴比妥酸，北京生化二厂产品，分析纯。其余试剂均为分析纯。
, 百拇医药
1.2 动物与药物的处理
SD大鼠，一级，雄性，体重：180 g±10 g，由四川省抗生素研究所提供。随机分成 5组：正常组、模型组、秋水仙碱组、GXN高剂量组、GXN低剂量组。除正常组外，均于造模的当天皮下注射CCL40.5 mL/100 g，以后每隔3 天注射40% CCL4橄榄油溶液0.3 mL/100 g，共13次。在整个实验过程中，正常组大鼠饲以全价颗粒料，自由饮用自来水，其余均以饲料配方I(79.5%纯玉米粉+0.5%胆固醇+20%猪油混合物压制成颗粒料)喂养2周，继之以饲料配方II(89.5%纯玉米粉+0.5%胆固醇+10%猪油混合物压制成颗粒料)喂养至第6周末，同时以25%乙醇为唯一饮料。
从实验的第2天起定时灌胃，每次给药量：GXN高剂量组0.19g.mL.100g， GXN低剂量组0.095g.mL.100g，秋水仙碱组16.7μg.mL.100 g，分别相当于临床日用量的20倍、10倍、10倍，正常组、模型组给以1g.mL.100g 蒸馏水，共给药42天，末次给24 h后，乙醚麻醉，从上腔静脉放血处死动物，并收集血液，取肝脏待测。
, 百拇医药
1.3 主要仪器
FJ-2008型自动γ-免疫计数器(上海原子能研究所产品)，Gibo Coring565型半自动生化分析仪(美国Gibo Coring公司产品)，721A型分光光度计(四川分析仪器厂产品)。
1.4 观察指标与方法
(1) 肝组织匀浆SOD活性、LPO含量的测定：将待测组织在冰浴状态下用匀浆器制成匀浆，用比色法测SOD、LPO值，再换算成肝组织SOD活性、LPO含量。
(2) HA、LN 、PC-III、C-IV的测定：放免法，具体见试剂盒说明书。
(3)肝组织SOD、LPO含量与肝功、HA、PC-III、LN 、C-IV水平的相关分析：采用计算机软件包处理。
, 百拇医药 1.5 统计处理方法
所有实验数据均以均数±标准差(
±s)表示，用SPSS 8.0软件包做数理统计、相关分析，计量资料的比较用t检验。
2 实验结果
2.1 对肝组织SOD活性、LPO含量的影
GXN高、低两剂量组与模型组比较，均可明显降低肝组织SOD的活性(t=2.8554， P<0.01；t=19.4499， P<0.001)，明显优于秋水仙碱组(t=2.4406， P<0.05;t=5.5955， P<0.001)；GXN高、低两剂量组与模型组比较，均可明显降低肝组织LPO的含量(t=4.4180， P<0.001；t=2.7097， P<0.001)，明显优于秋水仙碱组(t=6.4528， P<0.05；t=3.1505， P<0.001)详见表1。
, 百拇医药
表1 各组肝组织SOD活性、LPO含量的变化(±s) 组 别
n
SOD(Nu/g湿重)
LPO(nmol/g湿重)
正常组
8
477.72±5.99
47.28±49.55
模型组
8
420.81±19.39
, 百拇医药
206.96±49.55
秋水侧碱组
9
422.73±29.30
199.77±26.69
GXN低剂量组
8
499.14±25.77▲▲▲★★★
145.87±41.34▲▲★★
GXN高剂量组
11
, 百拇医药
460.64±40.94▲▲★
123.81±25.49▲▲▲★★★
与模型组比较：▲P<0.05，▲▲P<0.01，▲▲▲P<0.001；与秋水仙碱组比较:★P<0.01，★★P<0.05，★★★P<0.001
2.2 对血清HA、PC-III、LN 、C-IV的影响
各用药组HA 、PC-III 、LN 、C-IV的活性与模型组比较，均有不同程度的下降： GXN高、低两剂量组的均可明显降低HA 、PC-III 、C-IV的活性，疗效明显优于模型组(P均<0.01，高剂量组t＝3.26、14.41、2.5654、5.38， 低剂量组t＝18.11、10.70、2.2784、9.181)；GXN高、低两剂量组均可明显降低HA的活性，疗效明显优于秋水仙碱组(P均<0.05，t＝5.19、3.26)， GXN高剂量组可明显降低PC-III 、C-IV的活性，疗效明显优于秋水仙碱组(P均<0.01 t=7.15、5.68)，在降低LN方面，GXN两剂量组与秋水仙碱组无显著性差异。表明在升高SOD水平方面，肝心宁低剂量组优于高剂量组；在降低LPO水平方面，肝心宁高剂量组优于低剂量组。详见表2。
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表2 各组HA 、PC-III、C-IV的活性变化(±s) 组 别
n
HA(ng/dL)
PC-III(ng/dL)
LN(U/mL)
C-IV(ng/dL)
正常组
8
158.0303±19.60
73.25±222.13
, 百拇医药
60.88±10.00
35.00±9.62
模型组
8
463.00±32.82
222.13±30.17
93.50±12.22
104.5±27.71▲▲
秋水仙碱组
9
303.86±55.73▲▲
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130.75±10.75▲▲
79.88±15.66▲▲
54.63±9.32▲▲
GXN低剂量组
8
295.38±17.55★▲▲
134.75±9.53▲▲
89.25±16.40▲▲
53.63±15.41▲▲
, 百拇医药 GXN高剂量组
11
290.63±14.89★▲▲
95.63±15.68★★▲▲
76.13±10.64▲▲
35.00±9.62★★▲▲
与模型组比较：▲P<0.05，▲▲P<0.01；与秋水仙碱组比较★P<0.01，★★P<0.05
2.3 肝组织SOD、LPO含量与肝功、HA、PC-III、LN 、C-IV水平的相关分析
结果表明：肝组织SOD含量与ALT、C-IV呈负相关 (回归方程为YALT＝99.3524-0.0856X，YC-IV＝170.0294-0.2307X，RALT=-0.1853，RC-IV=-0.3290，P均<0.05) ，与Alb呈正相关(回归方程为YAlb＝-4.5024+0.0914X)；肝组织LPO值与LN、HA水平呈正相关 (回归方程为YLN=60.7594+0.1337X，YHA=104.0486+1.0341X，RLN=0.5317，RHA=0.4989，P均<0.01)。以上结果提示：肝组织中SOD水平越低则ALT、C-IV水平 越高；肝组织中LPO水平越高则血清LN 、HA含量也越高。另外还提示：肝脏PC-III的合成是一个多因素作用的结果，其与SOD、LPO的水平关系不大。
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3 讨论
实验结果显示模型组大鼠较正常组大鼠不仅出现肝功的损害及HA、PC-III、LN 、C-IV等肝纤维化血清标志物水平的增高，而且出现SOD水平的下降、LPO含量的上升，这与人类慢性肝纤维化、肝硬化的病理生理变化非常相似，适合进行防治肝纤维化的研究。自由基与肝纤维化的关系非常密切，本实验结果进一步显示大鼠肝脏中的SOD、LPO含量与部分肝纤维化血清标志物指标的水平密切相关，肝组织SOD值与ALT、C-IV呈负相关， 血清肝组织LPO值与LN、HA水平呈正相关，而LN、HA与肝纤维化、特别是肝血窦毛细血管化的关系非常密切。
现已证实，任何原因所致的自由基产生过多，清除相对或绝对不足自由基堆积，在自由基的作用下，生物膜发生脂质过氧化作用，使其对Ca2+的屏障作用减弱，导致Ca2+内流，肝细胞浆Ca2+超载，导致细胞内Ca2+依赖酶激活下降、细胞损伤，从而启动肝纤维化的过程，有研究认为急、慢性肝炎、肝硬化病人的肝穿刺标本和血清脂质过氧化物均高于正常人，认为肝损害与自由基的毒害作用密切相关[1]，另外，自由基反应的重要特点是连锁反应，加入少量的引发剂，反应可以启动；加入少量的清除剂就可以受到抑制，目前认为SOD是体内自由基重要的清除剂，丹参、五味子、甘草、女贞子、连翘、山楂等均具有抗氧化、抗自由基、防止过氧化脂质形成的作用[2，3]，这可能是肝心宁抗肝纤维化的重要机理之一，提示开发中药抗自由基制剂可望为抗肝纤维化的研究提供新的思路。
, 百拇医药
作者简介：扈晓宇，男，1969年10月生；在读博士研究生；研究方向：中医药治疗慢性肝病的实验与临床研究。
参考文献
1，韩德五.肝脏病理生理学[M].山西：太原.山西高校出版社，1992.69
2，金岚，金若敏 新编中药药理与临床应用[M].上海科学技术文献出版社，1995.16，249
3，王拥军，何士大.抗氧化中药的研究现状[J].中国中西结合杂志，1998，16(5)：312
(收稿日期：1999-10-28), 百拇医药
单位：成都中医药大学，四川 成都 610075
关键词：肝组织；SOD；LPO；肝纤维化血清标志物
成都中医药大学学报000321 摘 要： 目的：研究肝组织SOD、LPO水平与肝纤维化血清标志物的相关关系。方法：采用CCL4复合因素复制肝纤维化动物模型，同时予以秋水仙碱、肝心宁灌胃治疗，观察对肝组织匀浆SOD(超氧化物岐化酶)、LPO(过氧化脂质)、血清HA(透明质酸)、LN(板层素)、PC-Ⅲ(Ⅲ型前胶原)、C-Ⅳ(Ⅳ型胶原)的影响，并分别做SOD、LPO与HA、LN、PC-Ⅲ、C-Ⅳ的相关回归分析。结果：肝组织SOD含量与ALT、C-Ⅳ呈负相关(P均<0.05)，与Alb呈正相关(P<0.05)；肝组织LPO值与LN、HA水平呈正相关(P<均0.01)。结论：肝组织SOD、LPO的含量与某些肝纤维化血清标志物水平密切相关。
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中图分类号： R575.2 文献标识码：A 文章编号：1004-0668(2000)03-0040-02
近年来，自由基和质脂过氧化损伤在各种急慢性肝病发生、发展中的作用已受到重视[1]，但慢性肝损伤、肝纤维化是多因素参与的复杂过程，国内对氧化作用与肝纤维化关系的相关性研究较少，我们对肝组织SOD、LPO水平与肝纤维化血清标志物的相关关系进行了探讨，现将结果报告如下。
1 材料与方法
1.1 药品与试剂
肝心宁(GanXinNing. GXN)：由丹参、女贞子、何首乌、五味子、茵陈、连翘、甘草组成，由广汉市中草药研究所制成硫浸膏，批号：970420；秋水仙碱：匈牙利Laboratoyes Houde公司提供，批号：961113。分别用双蒸水稀释至适当浓度备用。HA、 LN试剂盒由上海海军医学研究所提供；C-IV试剂盒由北京化学试剂研究所提供；PC-III试剂盒由重庆肿瘤研究所提供， SOD、LPO试剂盒由南京建成生物工程研究所提供；硫代巴比妥酸，北京生化二厂产品，分析纯。其余试剂均为分析纯。
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1.2 动物与药物的处理
SD大鼠，一级，雄性，体重：180 g±10 g，由四川省抗生素研究所提供。随机分成 5组：正常组、模型组、秋水仙碱组、GXN高剂量组、GXN低剂量组。除正常组外，均于造模的当天皮下注射CCL40.5 mL/100 g，以后每隔3 天注射40% CCL4橄榄油溶液0.3 mL/100 g，共13次。在整个实验过程中，正常组大鼠饲以全价颗粒料，自由饮用自来水，其余均以饲料配方I(79.5%纯玉米粉+0.5%胆固醇+20%猪油混合物压制成颗粒料)喂养2周，继之以饲料配方II(89.5%纯玉米粉+0.5%胆固醇+10%猪油混合物压制成颗粒料)喂养至第6周末，同时以25%乙醇为唯一饮料。
从实验的第2天起定时灌胃，每次给药量：GXN高剂量组0.19g.mL.100g， GXN低剂量组0.095g.mL.100g，秋水仙碱组16.7μg.mL.100 g，分别相当于临床日用量的20倍、10倍、10倍，正常组、模型组给以1g.mL.100g 蒸馏水，共给药42天，末次给24 h后，乙醚麻醉，从上腔静脉放血处死动物，并收集血液，取肝脏待测。
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1.3 主要仪器
FJ-2008型自动γ-免疫计数器(上海原子能研究所产品)，Gibo Coring565型半自动生化分析仪(美国Gibo Coring公司产品)，721A型分光光度计(四川分析仪器厂产品)。
1.4 观察指标与方法
(1) 肝组织匀浆SOD活性、LPO含量的测定：将待测组织在冰浴状态下用匀浆器制成匀浆，用比色法测SOD、LPO值，再换算成肝组织SOD活性、LPO含量。
(2) HA、LN 、PC-III、C-IV的测定：放免法，具体见试剂盒说明书。
(3)肝组织SOD、LPO含量与肝功、HA、PC-III、LN 、C-IV水平的相关分析：采用计算机软件包处理。
, 百拇医药 1.5 统计处理方法
所有实验数据均以均数±标准差(
±s)表示，用SPSS 8.0软件包做数理统计、相关分析，计量资料的比较用t检验。2 实验结果
2.1 对肝组织SOD活性、LPO含量的影
GXN高、低两剂量组与模型组比较，均可明显降低肝组织SOD的活性(t=2.8554， P<0.01；t=19.4499， P<0.001)，明显优于秋水仙碱组(t=2.4406， P<0.05;t=5.5955， P<0.001)；GXN高、低两剂量组与模型组比较，均可明显降低肝组织LPO的含量(t=4.4180， P<0.001；t=2.7097， P<0.001)，明显优于秋水仙碱组(t=6.4528， P<0.05；t=3.1505， P<0.001)详见表1。
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表1 各组肝组织SOD活性、LPO含量的变化(
±s) 组 别n
SOD(Nu/g湿重)
LPO(nmol/g湿重)
正常组
8
477.72±5.99
47.28±49.55
模型组
8
420.81±19.39
, 百拇医药
206.96±49.55
秋水侧碱组
9
422.73±29.30
199.77±26.69
GXN低剂量组
8
499.14±25.77▲▲▲★★★
145.87±41.34▲▲★★
GXN高剂量组
11
, 百拇医药
460.64±40.94▲▲★
123.81±25.49▲▲▲★★★
与模型组比较：▲P<0.05，▲▲P<0.01，▲▲▲P<0.001；与秋水仙碱组比较:★P<0.01，★★P<0.05，★★★P<0.001
2.2 对血清HA、PC-III、LN 、C-IV的影响
各用药组HA 、PC-III 、LN 、C-IV的活性与模型组比较，均有不同程度的下降： GXN高、低两剂量组的均可明显降低HA 、PC-III 、C-IV的活性，疗效明显优于模型组(P均<0.01，高剂量组t＝3.26、14.41、2.5654、5.38， 低剂量组t＝18.11、10.70、2.2784、9.181)；GXN高、低两剂量组均可明显降低HA的活性，疗效明显优于秋水仙碱组(P均<0.05，t＝5.19、3.26)， GXN高剂量组可明显降低PC-III 、C-IV的活性，疗效明显优于秋水仙碱组(P均<0.01 t=7.15、5.68)，在降低LN方面，GXN两剂量组与秋水仙碱组无显著性差异。表明在升高SOD水平方面，肝心宁低剂量组优于高剂量组；在降低LPO水平方面，肝心宁高剂量组优于低剂量组。详见表2。
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表2 各组HA 、PC-III、C-IV的活性变化(
±s) 组 别n
HA(ng/dL)
PC-III(ng/dL)
LN(U/mL)
C-IV(ng/dL)
正常组
8
158.0303±19.60
73.25±222.13
, 百拇医药
60.88±10.00
35.00±9.62
模型组
8
463.00±32.82
222.13±30.17
93.50±12.22
104.5±27.71▲▲
秋水仙碱组
9
303.86±55.73▲▲
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130.75±10.75▲▲
79.88±15.66▲▲
54.63±9.32▲▲
GXN低剂量组
8
295.38±17.55★▲▲
134.75±9.53▲▲
89.25±16.40▲▲
53.63±15.41▲▲
, 百拇医药 GXN高剂量组
11
290.63±14.89★▲▲
95.63±15.68★★▲▲
76.13±10.64▲▲
35.00±9.62★★▲▲
与模型组比较：▲P<0.05，▲▲P<0.01；与秋水仙碱组比较★P<0.01，★★P<0.05
2.3 肝组织SOD、LPO含量与肝功、HA、PC-III、LN 、C-IV水平的相关分析
结果表明：肝组织SOD含量与ALT、C-IV呈负相关 (回归方程为YALT＝99.3524-0.0856X，YC-IV＝170.0294-0.2307X，RALT=-0.1853，RC-IV=-0.3290，P均<0.05) ，与Alb呈正相关(回归方程为YAlb＝-4.5024+0.0914X)；肝组织LPO值与LN、HA水平呈正相关 (回归方程为YLN=60.7594+0.1337X，YHA=104.0486+1.0341X，RLN=0.5317，RHA=0.4989，P均<0.01)。以上结果提示：肝组织中SOD水平越低则ALT、C-IV水平 越高；肝组织中LPO水平越高则血清LN 、HA含量也越高。另外还提示：肝脏PC-III的合成是一个多因素作用的结果，其与SOD、LPO的水平关系不大。
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3 讨论
实验结果显示模型组大鼠较正常组大鼠不仅出现肝功的损害及HA、PC-III、LN 、C-IV等肝纤维化血清标志物水平的增高，而且出现SOD水平的下降、LPO含量的上升，这与人类慢性肝纤维化、肝硬化的病理生理变化非常相似，适合进行防治肝纤维化的研究。自由基与肝纤维化的关系非常密切，本实验结果进一步显示大鼠肝脏中的SOD、LPO含量与部分肝纤维化血清标志物指标的水平密切相关，肝组织SOD值与ALT、C-IV呈负相关， 血清肝组织LPO值与LN、HA水平呈正相关，而LN、HA与肝纤维化、特别是肝血窦毛细血管化的关系非常密切。
现已证实，任何原因所致的自由基产生过多，清除相对或绝对不足自由基堆积，在自由基的作用下，生物膜发生脂质过氧化作用，使其对Ca2+的屏障作用减弱，导致Ca2+内流，肝细胞浆Ca2+超载，导致细胞内Ca2+依赖酶激活下降、细胞损伤，从而启动肝纤维化的过程，有研究认为急、慢性肝炎、肝硬化病人的肝穿刺标本和血清脂质过氧化物均高于正常人，认为肝损害与自由基的毒害作用密切相关[1]，另外，自由基反应的重要特点是连锁反应，加入少量的引发剂，反应可以启动；加入少量的清除剂就可以受到抑制，目前认为SOD是体内自由基重要的清除剂，丹参、五味子、甘草、女贞子、连翘、山楂等均具有抗氧化、抗自由基、防止过氧化脂质形成的作用[2，3]，这可能是肝心宁抗肝纤维化的重要机理之一，提示开发中药抗自由基制剂可望为抗肝纤维化的研究提供新的思路。
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作者简介：扈晓宇，男，1969年10月生；在读博士研究生；研究方向：中医药治疗慢性肝病的实验与临床研究。
参考文献
1，韩德五.肝脏病理生理学[M].山西：太原.山西高校出版社，1992.69
2，金岚，金若敏 新编中药药理与临床应用[M].上海科学技术文献出版社，1995.16，249
3，王拥军，何士大.抗氧化中药的研究现状[J].中国中西结合杂志，1998，16(5)：312
(收稿日期：1999-10-28), 百拇医药