儿宝颗粒对幼龄厌食大鼠下丘脑中β-内啡肽含量的影响
作者：史健 夏天 杜永平 吕葆真
单位：第四军医大学 西京医院，陕西 西安 710032
关键词：大鼠；小儿厌食症；β-内啡肽；免疫组化技术；图像分析技术
成都中医药大学学报000319 摘 要： 目的：研究β-内啡肽在幼龄厌食大鼠治疗前后下丘脑的含量变化及其与小儿厌食症的发病关系。方法：模拟小儿厌食症病因建立幼龄厌食大鼠模型，并用运脾方药治疗，用免疫组化方法观察正常组、模型组、治疗组下丘脑β-内啡肽的含量变化，结合图像分析技术测定其结果。结果：模型动物β-内啡肽低于对照组(P<0.05)，儿宝颗粒治疗组下丘脑中β-内啡肽的含量较模型组显著增高(P<0.01)。结论：下丘脑β-内啡肽的含量降低可能是幼龄厌食大鼠进食量降低的原因之一，儿宝颗粒有促进幼龄厌食大鼠下丘脑β-内啡肽分泌的作用，从而增加了摄食量。
中图分类号： R285.6；R723.19 文献标识码：A 文章编号：1004-0668(2000)03-0037-01
, 百拇医药
Study the Role of β-endorphin in Hypothalamic of Juvenile Rats
with Anorexia and the Effect of Erbao Granules on them
SHI Jian XIA Tian DU Yong-ping
Xijing Hospital, The Fourth Military Medicine University(Xi'an, 710032,China)
ABSTRACT:Objective：To study the role of β-EP( beta-endorphin) in hypothalamic of juvenile rats with anorexia and the effect of Erbao Granules on them. Methods: A model of juvenile rats with anorexia was established by imitating the cause of children anorexia. Immunohistochemistry and quantitation were used in experiment. Result: The neurone cell of β-EP in hypothalamic in the model group were lower than in the control group (P<0.05). The neurone cell of β-EP in hypothalamic in the therapy group significant increased than the model group (P<0.01). Conclusion: : The decreasing of β-EP in hypothalamic may be one of the factors causing anorexia in rats. Erbao granules can improve β-EP in hypothalamicof anorexia.
, 百拇医药
KEY WORDS:Rat; Erbao granules; children anorexia; β-endorphin; immunohistochemistry; quantiation
β-内啡肽在参与摄食调控的过程中，不仅作为肽类激素，而且作为肽能神经递质发挥着重要作用[1]。许多研究表明β-内啡肽在脑内的极微量的变化，就可影响动物的摄食行为[2]。我们模拟小儿厌食症的主要病因(饮食结构不合理)，建立了幼龄大鼠厌食模型[3]，并用运脾方药(儿宝颗粒)治疗，应用免疫组化技术ABC法，观察对照组 、模型组、治疗组下丘脑β-内啡肽含量的变化， 并用图像分析技术测定其结果。从而探讨β-内啡肽在小儿厌食症发病中的可能作用及儿宝颗粒的治疗作用。
1 材料与方法
1.1 动物与分组
, http://www.100md.com
SD 大鼠24只，日龄35～40天，体重60g±10g，随机分为对照组、模型组、治疗组，每组8只，对照组喂常规饲料(动物及常规饲料均由第四军医大学实验动物中心提供)，模型组及治疗组喂特制饲料(由奶粉、鱼粉、玉米粉、豆粉、鸡蛋按一定比例混合制成)[3]造模。第8天开始灌胃，治疗组用儿宝颗粒溶液灌胃(3.76 g/100 g)，对照组、模型组灌生理盐水。均单笼喂养。第28日20:00时起禁食，第29日处死。
1.2 试剂
儿宝颗粒由南京中医药大学植物药深加工中心提供，兔抗β-内啡肽IgG抗体由sigma公司提供。
1.3 灌注、切片和染色
10 mL/L戊巴比妥0.4 mL/100 g麻醉，经升主动脉插管，先灌入100 mL生理盐水，再以4%多聚甲醛(4℃)注入，先快后慢，1.5 h左右，取出下丘脑，后固定2 h，入30%蔗糖4℃过夜，冰冻，30um连续切片，切片用0.01 mol/LPBS漂洗，依次进入：(1)β-内啡肽(1∶2000)；(2)生物素标记的羊抗兔IgG(1∶200)；(3)ABC复合物，Ⅰ抗和Ⅱ抗用0.9%牛血清和0.3%TritonX-100的0.01MPBS稀释，ABC复合物用0.3%TritonX-100的0.01MPBS稀释。切片再用DAB和H2O2进行呈色20～30 min，最后用硫酸镍胺加强。
, 百拇医药
1.4 β-内啡肽免疫反应产物的定量分析
用Q-500图像分析系统(美国Leica公司)对3组的免疫反应产物的相对含量进行测定，在光镜下(×100)，每例随机取样测5个断面，10个单位面积，每组共测500个单位面积，计算出每个单位面积的β-内啡肽免疫反应产物的相对含量，用组间t检验方法作统计学处理。
2 结果
各组动物下丘脑的弓状核、腹内侧核均可见到β-内啡肽神经元细胞的分布，造模组下丘脑β-内啡肽细胞的相对含量低于对照组，且存在着显著性差异(P<0.05)，治疗组下丘脑β-内啡肽细胞的含量增高，与模型组存在着显著性差异(P<0.01)，见表1。
表1 各组β-内啡肽含量的变化比较 组 别
检测
, 百拇医药
例数
检测单
位面积
平均灰度值
β-内啡呔相对
含量/单位面积
对照组
8
50
113.0925±2.5935
0.1511±0.0092
模型组
8
, http://www.100md.com
50
128.5000±5.6580
0.0958±0.0197*
治疗组
8
50
105.9550±2.4069
0.1747±0.0198*△△
与对照组比*P<0.05，与模型组比，△△P<0.01
3 讨论
β-内啡肽在胃肠道和脑内双重分布，以往研究显示应用0.01～1.0nmol/L 的β-内啡肽注入脑室很快引起摄食增加，电刺激LH 引起鼠摄食时，外周应用纳洛酮(β-内啡肽的拮抗剂)，则可抑制其作用，提示中枢的β-内啡肽增加可促进摄食[4]。Kaye[5]对神经性厌食患者脑脊液中的β-内啡肽的研究也显示:在厌食患者体重低于正常时，β-内啡肽的含量明显低于正常对照组，同时也低于其经治疗3～4周体重恢复后的水平。而且，患者在体重恢复后β-内啡肽在脑脊液中的含量与对照组相似。说明中枢的β-内啡肽减少可降低摄食量，从而导致体重的减轻，当β-内啡肽升高时可以促进摄食而使体重恢复。
, 百拇医药
本实验结果显示：造模组动物下丘脑中弓状核、腹内侧核的β-内啡肽的含量显著低于对照组和儿宝颗粒治疗组的含量；治疗组下丘脑中β-内啡肽的含量高于对照组，但二者没有统计学差异。结果表明：造模组摄食量减少，体重降低，中枢的β-内啡肽含量降低;用药后β-内啡肽显著增加，同时摄食量增加，与以往的研究一致。说明饮食结构不合理可导致与摄食调控有关的肽类激素分泌失调，从而影响摄食行为。下丘脑中β-内啡肽的减少在小儿厌食的发病过程中可能起着重要的作用，当其含量降低时就影响摄食，减少了摄食量。运脾方药儿宝颗粒可以促进厌食动物中枢的β-内啡肽的分泌，从而促进厌食动物的摄食，治疗厌食症。
基金项目：国家自然科学基金资助课题(No.39670896)
作者简介：史健，女，1970年生；医学硕士；研究方向：中西医结合治疗小儿脾胃系疾病。
参考文献
, 百拇医药 1，Ubilluz R. Advances in gasteointestinal: cholecystokinin[J].Rev-Gastroenterol-Peru.1994，14:222
2，邓孔昭.食欲中枢与摄食的中枢调控.见：周吕主编，胃肠生理学[M].北京:科学出版社，1991.174
3，汪受传，张月萍.特制饲料喂养幼龄大鼠建立小儿厌食症模型[J].南京中医药大学学报，1999，15(3):140
4，Baile C.A.et al. Role of cholecystokinin and opioid peptides in control of food in intake[J]. Physilogical Reviews，1996，66:172
5，Kaye W.H.，Berrettini W.H.et al.Reduced cerebrospinal fluid levels of immunoreactive proopiomelanocortin related peptides in anorexia nervosa[J].Life Sci，1987，41：2147
(收稿日期：2000-05-16), http://www.100md.com
单位：第四军医大学 西京医院，陕西 西安 710032
关键词：大鼠；小儿厌食症；β-内啡肽；免疫组化技术；图像分析技术
成都中医药大学学报000319 摘 要： 目的：研究β-内啡肽在幼龄厌食大鼠治疗前后下丘脑的含量变化及其与小儿厌食症的发病关系。方法：模拟小儿厌食症病因建立幼龄厌食大鼠模型，并用运脾方药治疗，用免疫组化方法观察正常组、模型组、治疗组下丘脑β-内啡肽的含量变化，结合图像分析技术测定其结果。结果：模型动物β-内啡肽低于对照组(P<0.05)，儿宝颗粒治疗组下丘脑中β-内啡肽的含量较模型组显著增高(P<0.01)。结论：下丘脑β-内啡肽的含量降低可能是幼龄厌食大鼠进食量降低的原因之一，儿宝颗粒有促进幼龄厌食大鼠下丘脑β-内啡肽分泌的作用，从而增加了摄食量。
中图分类号： R285.6；R723.19 文献标识码：A 文章编号：1004-0668(2000)03-0037-01
, 百拇医药
Study the Role of β-endorphin in Hypothalamic of Juvenile Rats
with Anorexia and the Effect of Erbao Granules on them
SHI Jian XIA Tian DU Yong-ping
Xijing Hospital, The Fourth Military Medicine University(Xi'an, 710032,China)
ABSTRACT:Objective：To study the role of β-EP( beta-endorphin) in hypothalamic of juvenile rats with anorexia and the effect of Erbao Granules on them. Methods: A model of juvenile rats with anorexia was established by imitating the cause of children anorexia. Immunohistochemistry and quantitation were used in experiment. Result: The neurone cell of β-EP in hypothalamic in the model group were lower than in the control group (P<0.05). The neurone cell of β-EP in hypothalamic in the therapy group significant increased than the model group (P<0.01). Conclusion: : The decreasing of β-EP in hypothalamic may be one of the factors causing anorexia in rats. Erbao granules can improve β-EP in hypothalamicof anorexia.
, 百拇医药
KEY WORDS:Rat; Erbao granules; children anorexia; β-endorphin; immunohistochemistry; quantiation
β-内啡肽在参与摄食调控的过程中，不仅作为肽类激素，而且作为肽能神经递质发挥着重要作用[1]。许多研究表明β-内啡肽在脑内的极微量的变化，就可影响动物的摄食行为[2]。我们模拟小儿厌食症的主要病因(饮食结构不合理)，建立了幼龄大鼠厌食模型[3]，并用运脾方药(儿宝颗粒)治疗，应用免疫组化技术ABC法，观察对照组 、模型组、治疗组下丘脑β-内啡肽含量的变化， 并用图像分析技术测定其结果。从而探讨β-内啡肽在小儿厌食症发病中的可能作用及儿宝颗粒的治疗作用。
1 材料与方法
1.1 动物与分组
, http://www.100md.com
SD 大鼠24只，日龄35～40天，体重60g±10g，随机分为对照组、模型组、治疗组，每组8只，对照组喂常规饲料(动物及常规饲料均由第四军医大学实验动物中心提供)，模型组及治疗组喂特制饲料(由奶粉、鱼粉、玉米粉、豆粉、鸡蛋按一定比例混合制成)[3]造模。第8天开始灌胃，治疗组用儿宝颗粒溶液灌胃(3.76 g/100 g)，对照组、模型组灌生理盐水。均单笼喂养。第28日20:00时起禁食，第29日处死。
1.2 试剂
儿宝颗粒由南京中医药大学植物药深加工中心提供，兔抗β-内啡肽IgG抗体由sigma公司提供。
1.3 灌注、切片和染色
10 mL/L戊巴比妥0.4 mL/100 g麻醉，经升主动脉插管，先灌入100 mL生理盐水，再以4%多聚甲醛(4℃)注入，先快后慢，1.5 h左右，取出下丘脑，后固定2 h，入30%蔗糖4℃过夜，冰冻，30um连续切片，切片用0.01 mol/LPBS漂洗，依次进入：(1)β-内啡肽(1∶2000)；(2)生物素标记的羊抗兔IgG(1∶200)；(3)ABC复合物，Ⅰ抗和Ⅱ抗用0.9%牛血清和0.3%TritonX-100的0.01MPBS稀释，ABC复合物用0.3%TritonX-100的0.01MPBS稀释。切片再用DAB和H2O2进行呈色20～30 min，最后用硫酸镍胺加强。
, 百拇医药
1.4 β-内啡肽免疫反应产物的定量分析
用Q-500图像分析系统(美国Leica公司)对3组的免疫反应产物的相对含量进行测定，在光镜下(×100)，每例随机取样测5个断面，10个单位面积，每组共测500个单位面积，计算出每个单位面积的β-内啡肽免疫反应产物的相对含量，用组间t检验方法作统计学处理。
2 结果
各组动物下丘脑的弓状核、腹内侧核均可见到β-内啡肽神经元细胞的分布，造模组下丘脑β-内啡肽细胞的相对含量低于对照组，且存在着显著性差异(P<0.05)，治疗组下丘脑β-内啡肽细胞的含量增高，与模型组存在着显著性差异(P<0.01)，见表1。
表1 各组β-内啡肽含量的变化比较 组 别
检测
, 百拇医药
例数
检测单
位面积
平均灰度值
β-内啡呔相对
含量/单位面积
对照组
8
50
113.0925±2.5935
0.1511±0.0092
模型组
8
, http://www.100md.com
50
128.5000±5.6580
0.0958±0.0197*
治疗组
8
50
105.9550±2.4069
0.1747±0.0198*△△
与对照组比*P<0.05，与模型组比，△△P<0.01
3 讨论
β-内啡肽在胃肠道和脑内双重分布，以往研究显示应用0.01～1.0nmol/L 的β-内啡肽注入脑室很快引起摄食增加，电刺激LH 引起鼠摄食时，外周应用纳洛酮(β-内啡肽的拮抗剂)，则可抑制其作用，提示中枢的β-内啡肽增加可促进摄食[4]。Kaye[5]对神经性厌食患者脑脊液中的β-内啡肽的研究也显示:在厌食患者体重低于正常时，β-内啡肽的含量明显低于正常对照组，同时也低于其经治疗3～4周体重恢复后的水平。而且，患者在体重恢复后β-内啡肽在脑脊液中的含量与对照组相似。说明中枢的β-内啡肽减少可降低摄食量，从而导致体重的减轻，当β-内啡肽升高时可以促进摄食而使体重恢复。
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本实验结果显示：造模组动物下丘脑中弓状核、腹内侧核的β-内啡肽的含量显著低于对照组和儿宝颗粒治疗组的含量；治疗组下丘脑中β-内啡肽的含量高于对照组，但二者没有统计学差异。结果表明：造模组摄食量减少，体重降低，中枢的β-内啡肽含量降低;用药后β-内啡肽显著增加，同时摄食量增加，与以往的研究一致。说明饮食结构不合理可导致与摄食调控有关的肽类激素分泌失调，从而影响摄食行为。下丘脑中β-内啡肽的减少在小儿厌食的发病过程中可能起着重要的作用，当其含量降低时就影响摄食，减少了摄食量。运脾方药儿宝颗粒可以促进厌食动物中枢的β-内啡肽的分泌，从而促进厌食动物的摄食，治疗厌食症。
基金项目：国家自然科学基金资助课题(No.39670896)
作者简介：史健，女，1970年生；医学硕士；研究方向：中西医结合治疗小儿脾胃系疾病。
参考文献
, 百拇医药 1，Ubilluz R. Advances in gasteointestinal: cholecystokinin[J].Rev-Gastroenterol-Peru.1994，14:222
2，邓孔昭.食欲中枢与摄食的中枢调控.见：周吕主编，胃肠生理学[M].北京:科学出版社，1991.174
3，汪受传，张月萍.特制饲料喂养幼龄大鼠建立小儿厌食症模型[J].南京中医药大学学报，1999，15(3):140
4，Baile C.A.et al. Role of cholecystokinin and opioid peptides in control of food in intake[J]. Physilogical Reviews，1996，66:172
5，Kaye W.H.，Berrettini W.H.et al.Reduced cerebrospinal fluid levels of immunoreactive proopiomelanocortin related peptides in anorexia nervosa[J].Life Sci，1987，41：2147
(收稿日期：2000-05-16), http://www.100md.com