头风饮对实验性偏头痛动物模型c-fos、c-jun基因表达的影响
作者：任永欣 彭成 姚干
单位：成都中医药大学，四川 成都 610075
关键词：头风饮；偏头痛；疾病动物模型；基因表达
成都中医药大学学报000318 摘 要： 头风饮是中医治疗偏头痛的经典方剂。根据硝酸甘油、偏头痛、早快基因表达的内在联系，本研究在国内首次复制了硝酸甘油型实验性偏头痛动物模型，并用免疫组化方法观察早快基因c-fos、c-jun的表达。结果：硝酸甘油型实验性偏头痛大鼠脑干、下丘脑c-fos、c-jun基因表达明显增强；头风饮能显著抑制偏头痛大鼠脑干、下丘脑增强的c-fos、c-jun基因表达，与模型组比较有显著性或极显著性差异，与空白对照组、阳性药物麦角胺咖啡因组比较无显著性差异。提示头风饮具有治疗实验性偏头痛动物模型的作用。
中图分类号： R259；Q786 文献标识码：A 文章编号：1004-0668(2000)02-0034-03
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偏头痛是一种间断性反复发作的，以一侧头痛为主的搏动性头痛疾病。近年来该病发病率呈上升趋势，已成为常见病、多发病。祖国医学经几千年来的临床实践，积累了大量宝贵的偏头痛治疗经验，头风饮就是其中的代表方剂之一。
头风饮原方名为“大川芎丸”，由金元时代著名医家刘完素创立[1]，方中药物川芎可活血行气、天麻能熄风止痛，二者合用对瘀血阻滞、风阳上扰型偏头痛有良好的治疗效果。目前，由于实验性偏头痛动物模型的缺乏，头风饮的主要药效学研究、有效组分的确定、作用机制的探索，都受到了极大的阻碍。因此，建立实验性偏头痛动物模型，成为急待解决的关键问题，而国内在此领域的研究尚属空白。
近年来研究表明，伤害性刺激可诱发早快基因家族中c-fos、c-jun在中枢神经系统(CNS)内的表达增强[2]；而所谓伤害性刺激，是指凡能引起痛觉的刺激，故可认为疼痛能引起c-fos、c-jun在CNS内表达增强。在早快基因与偏头痛的关系研究中，Moskowitz发现：偏头痛期间，三叉神经核尾部内的c-fos基因表达增加[3]；Cristina观察到偏头痛期间，下丘脑室旁核，脑干蓝斑、臂旁核等处c-fos基因表达明显增强[4]。提示早快基因表达和偏头痛之间存在某种内在联系，根据这种联系，结合临床上硝酸甘油诱发人类偏头痛发作的现象，我们按照Cristina报道的方法，复制了大鼠实验性偏头痛模型，对头风饮治疗实验性偏头痛的作用进行了以下研究。
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1 材料
1.1 药物
(1) 受试药物：头风饮浸膏，每mL含原生药1.2g，由成都中医药大学科技中试中心提供，试验批号：980701。
(2) 造模药物:硝酸甘油注射液,每mL含硝酸甘油5 mg，由广州明兴制药厂生产，批准文号：粤卫药准字(1996)第103246号，生产批号980304。
(3)阳性药物:麦角胺咖啡因片，每片含酒石酸麦角胺1mg，由上海信谊药业有限公司生产，批准文号：沪卫药准字(1995)第0710号-007，生产批号：970401。
1.2 动物
SD大鼠，雌雄各半，体重300 g±30 g，由成都中医药大学动物研究中心提供，动物质量合格证号：川实动管质(97)第8号。检疫后备用。
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1.3 主要试剂：
兔抗c-fos、c-jun抗体，羊血清均由北京中山生物技术有限公司生产：Lot：C168，EXP：12/99为SANTA CRUZ产品；ABC免疫组化试剂，由中美合资华美生物工程公司生产，批号：6026-1。其他试剂均为进口分装或国产分析纯。
1.4 主要仪器
MICROW-500型恒冷箱切片机；电子天平PA2003型；PHS-3C精密酸度计；隔水式电热恒温培养箱；MIAS 97图象分析系统等。
2 方法
2.1 分组、造模、给药
根据Cristina Tassorelli等人报道的方法[7]，取SD大鼠60只，随机分成空白对照组、偏头痛模型组、阳性对照组，头风饮高、中、低剂量组，各组动物均为10只。除空白对照组外，其余各组动物皮下注射硝酸甘油注射剂10 mg/kg，复制实验性偏头痛动物模型。30 min后按组灌胃给药。空白对照组不作处理，偏头痛动物模型组灌胃蒸馏水10 mL/kg，阳性对照组灌胃麦角胺咖啡因药液10 mL/kg(相当于酒石酸麦角胺2mg)，头风饮高、中、低剂量组分别灌胃116.8%、58.4%、29.2%头风饮药液10 mL/kg，分别相当于原生药11.68 g/kg、5.84 g/kg、2.92 g/kg。
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2.2 灌注、取材、切片
造模4 h，即用1%戊巴比妥钠50 mg/kg麻醉动物，仰卧固定，开胸，主动脉插管，剪开右心耳。首先迅速灌注无菌生理盐水100 mL，然后灌注4%PFA磷酸盐缓冲液100 mL。灌注后取大鼠脑组织，在4%PFA磷酸盐缓冲液中固定24 h，然后放入20%蔗糖-PBS液中，至组织块下沉。以恒冷箱切片机-20℃对大鼠脑干、下丘脑连续切片10张[5]，片厚40 μm，切片放入20%蔗糖-PFA液中保存。
2.3 免疫组化反应(ABC法)[6]
切片入0.01MPBS中洗10 min×3次；0.3%Tritonx-100中30min；0.3%H2O2-PBS液中15 min；0.01MPBS中洗10 min×3次，入正常羊血清-0.01MPBS液(1∶60)中孵育20 min；进兔抗c-fos(c-jun)抗体(1∶1500)中孵育1 h；0.01MPBS液中洗10 min×3次；入生物素标记羊抗兔IgG中孵育0.5 h；0.01MPBS中洗10 min×3次；入ABC复合物中孵育0.5 h；0.01MPBS中洗0 min×3次；DAB染色15 min；重蒸水终止染色；用铬明胶将切片贴于载玻片上，过夜晾干；梯度酒精脱水；二甲苯透明2次，中性树胶封片。
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2.4 免疫组化对照试验
(1)非特异性对照：用正常羊血清代替c-fos(c-jun)抗体，其它步骤与ABC法程序相同。
(2)阴性对照：用PBS代替c-fos(c-jun)抗体，其它步骤与ABC法程序相同。
2.5 镜检、图像分析
XDS-1倒置显微镜下：切片背景为淡黄或无色，阳性细胞呈红棕或黄棕色，多为圆形或卵圆形，有聚集成线状、条块状者，也有零星散在者。观察每张切片左上、右上、左下、右下和中央部5个视场阳性细胞总数，利用MIAS97图象分析软件分析每张切片上每个视场阳性细胞的平均面积和平均灰度，PEMS统计软件处理试验数据。由于免疫组化非特异性对照组、阴性对照组阳性细胞极少，几乎没有，故未作统计。
3 结果
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3.1 一般状态观察
除空白对照组外，其余动物造模后30 min左右，均出现双耳发红、前肢频繁搔头，爬笼次数增多，烦躁不安现象。治疗组动物在给药后，上述现象逐渐消失，趋于正常。模型组动物上述现象持续约3小时，继而出现蜷卧，活动减少状态。
3.2 头风饮对实验性偏头痛动物模型c-fos、c-jun基因表达的影响
3.2.1 头风饮对实验性偏头痛动物模型c-fos、c-jun基因表达阳性细胞数的影响
实验性偏头痛动物模型组脑干、下丘脑c-fos、c-jun表达阳性细胞数明显增多，与空白对照组比较有极显著性差异(P<0.01)；头风饮高剂量组脑干、下丘脑c-fos阳性细胞数目明显减少，与模型组比较有极显著性差异(P<0.01)，与阳性对照组、空白对照组比较无显著性差异。头风饮高剂量组脑干、下丘脑c-jun阳性细胞数大大减少，与模型组比较有显著性差异(P<0.05)或极显著性差异(P<0.01)，与阳性对照组、空白对照组比较无显著性差异。试验数据详见表1。
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表1 头风饮对实验性偏头痛大鼠脑组织中c-fos、c-jun基因表达阳性细胞数的影响(
±S) 组 别
动物
(只)
剂量
(g/kg)
c-fos阳性细胞数(个)
c-jun阳性细胞数(个)
脑干切片
下丘脑切片
脑干切片
, 百拇医药
下丘脑切片
空白对照
10
66.76±61.15
95.86±75.64
62.21±57.97
55.21±44.61
模型对照
10
等容积
蒸馏水
329.51±242.71**
, 百拇医药
383.87±305.31**
253.78±121.26**
332.01±181.54**
阳性对照
10
0.002
80.31±61.28△△
86.85±66.73△△
100.98±90.29△
100.23±90.46△△
, 百拇医药
高剂量
11.68
10
86.21±78.39△△
113.01±95.81△△
123.97±71.97△
116.34±60.24△△
中剂量
5.84
10
221.68±138.11○
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128.66±113.01△△
138.12±88.34△
143.80±90.93△△
低剂量
2.29
10
174.36±717.45
128.76±105.12△△
199.68±146.11
159.92±150.54△△
, 百拇医药
与空白对照组比较：**P<0.01；与模型组比较：△P<0.05，△△P<0.01；与阳性对照组比较：○P<0.05。
3.2.2 头风饮对实验性偏头痛动物型c-fos、c-jun基因表达阳性细胞面积的影响
实验性偏头痛动物模型组脑干、下丘脑c-fos、c-jun表达阳性细胞面积明显增大，与空白对照组比较有极显著性差异(P<0.01)；头风饮高剂量组脑干、下丘脑阳性细胞面积大大减小，与模型组比较，有极显著性(P<0.01)或显著性差异(P<0.05)。与阳性对照组，空白对照组比较，均无显著性差异。头风饮高剂量组脑干、下丘脑c-jun阳性细胞面积明显缩小，与模型组比较有极显著性(P<0.01)或显著性差异(P<0.05)；与阳性对照组、空白对照组比较，无显著性差异。试验数据详见表2。
表2 头风饮对实验性偏头痛大鼠脑组织中c-fos、c-jun基因表达阳性细胞面积的影响(±S) 组别
, 百拇医药
动物
(只)
剂量
(g/kg)
c-fos阳性细胞数(个)
c-jun阳性细胞数(个)
脑干切片
下丘脑切片
脑干切片
下丘脑切片
空白对照
10
383.19±213.76
, 百拇医药
309.89±159.54
368.57±168.74
206.66±99.76
模型对照
10
等容积
蒸馏水
1516.87±827.97**
1164.84±486.88**
1085.36±727.48**
986.00±657.00**
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阳性对照
10
0.002
552.08±224.44△△
449.64±203.13△△
363.16±157.87△△
417.54±193.84△
高剂量
11.68
10
558.52±216.64△△
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677.30±358.76△
402.55±152.19△△
470.52±193.84△
中剂量
5.84
10
957.19±445.54○
991.50±113.01**○○
671.36±287.61△
847.18±642.23*
, 百拇医药
低剂量
2.29
10
624.74±316.72△
1064.52±497.39**○○
615.86±347.47△
727.68±674.77
与空白对照组比较：**P<0.05，*P<0.01；与模型组比较：△P<0.05，△△P<0.01；与阳性对照组比较：○P<0.05。
3.2.3 头风饮对实验性偏头痛动物模型c-fos、c-jun基因表达阳性细胞灰度的影响
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实验性偏头痛动物模型组脑干、下丘脑c-fos表达阳性细胞灰度有所减弱，与空白对照组比较有显著性差异(P<0.05)。头风饮治疗各组灰度与阳性对照组比较无显著性差异，c-jun表达阳性细胞的灰度各组间无显著性差异。试验数据详见表3。
表3 头风饮对实验性偏头痛大鼠脑组织中c-fos、c-jun基因表达阳性细胞灰度的影响(±S) 组 别
动物
(只)
剂量
(g/kg)
c-fos阳性细胞数(个)
c-jun阳性细胞数(个)
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脑干切片
下丘脑切片
脑干切片
下丘脑切片
空白对照
10
179.7±47.5
176.1±32.9
192.3±5.6
169.3±13.4
模型对照
10
, 百拇医药 等容积蒸馏水
144.7±20.2*
146.2±21.0*
170.2±5.9
160.9±34.5
阳性对照
10
0.002
142.6±27.2
152.6±21.5
171.1±3.5
, 百拇医药 175.4±3.1
高剂量
11.68
10
142.2±16.8
143.9±12.0
170.9±6.4
177.4±1.9
中剂量
5.84
10
145.1±17.4
, 百拇医药 157.0±13.0
176.4±3.6
175.9±5.2
低剂量
2.29
10
126.8±23.9
147.3±16.8
184.0±25.1
178.2±29.6
与空白对照组比较：P<0.05。
4 讨论
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4.1 硝酸甘油型实验性偏头痛动物模型的评价
目前，对偏头痛实验性动物模型的研究十分有限，主要的模型除硝酸甘油型偏头痛动物模型外，还有Moskowitz建立的大鼠与豚鼠硬脑膜神经炎症模型；Saxena复制的用放射活性微球测量小猪颈内动静脉吻合支血流的偏头痛动物模型[4]。综合考虑模型设计时应遵循的标准化、相似性、重复性、适用性、经济性原则，硝酸甘油型偏头痛动物模型具有动物易于获得、经济、简便、相似性好，适用性强等特点，故我们选择其进行研究。而实验动物模型的评价，则主要应从造模因素、模型症状表现与病理变化、反证治疗、模型稳定性等几方面进行判断[7]。
人们对硝酸甘油引起偏头痛的认识已有一个世纪。心绞痛病人应用0.3～0.4 mg硝酸甘油，50%以上病人可出现偏头痛性质的头痛；Olesen近来发现持续静脉注射硝酸甘油可引起健康人剂量依赖性的反复发作性头痛，而机体其它任何部位无疼痛[8]。可见，硝酸甘油是偏头痛的诱发因素之一，可以作为造模诱发因素。
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硝酸甘油造模后，动物出现的双耳发红，前肢频繁搔头，活动增多等表现，提示模型动物出现头部不适；其脑干、下丘脑早快基因c-fos、c-jun表达的异常增强，提示该部位神经元功能敏感。硝酸甘油诱发的这一系列模型表现与病理生化变化，与人类偏头痛发作时的表现及变化有一定的相似性。
偏头痛经典治疗药物麦角胺咖啡因能减轻或消除模型动物的症状表现，显著抑制脑内增强的c-fos、c-jun基因表达，显示了对硝酸甘油型实验性偏头痛动物模型的治疗作用，反证了模型的成立。
在我们的预试及多次反复实验中，硝酸甘油型实验性偏头痛动物模型症状表现相似，病理及生化数据稳定，具有可重复性。
根据疾病动物模型的造模原则和判断标准，进行判断分析，该模型的复制是成功的。
4.2 早快基因的异常表达与偏头痛的内在联系
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早快基因与疼痛关系的研究,自1987年开始以来发展极快，研究结果均证实了疼痛与早快基因表达存在某种内在联系。Moskowitz、Cristina分别于1992、1996年发现偏头痛期间脑内某些核团c-fos表达异常增强，提示早快基因表达与偏头痛之间也存在着一定的内在联系。我们研究发现，模型大鼠脑干、下丘脑c-fos、c-jun表达增强，而这种增强的基因表达只能或主要是由硝酸甘油引起的偏头痛所诱导，进一步证实了早快基因表达与偏头痛间确实存在某种内在联系。
至于偏头痛如何诱导中枢神经系统内早快基因c-fos、c-jun的异常表达，目前尚无定论。认为与神经元第二信使的激活密切相关。中枢神经元对疼痛作出应答反应的程序可能是，疼痛刺激→谷氨酸NMDA或其他受体激活→第二信使激活→第二信使诱导c-fos(c-jun)转录mRNA→mRNA在胞浆内翻译合成Fos(Jun)→Fos与Jun在胞核中形成复合物并与目的基因内的AP-1调节位点结合→进一步激活目的基因的表达而最终对该疼痛刺激作出反应[3]。可见c-fos与c-jun的表达是偶联的，Fos蛋白必须与c-jun转录mRNA编码的蛋白Jun结合，共同介导表达。
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因此，虽然对c-jun基因表达研究较少，但理论上c-jun与c-fos在痛觉调制上应该是功能相似的基因，我们研究发现，硝酸甘油诱导的偏头痛大鼠脑内c-jun表达与c-fos表达基本一致，也证实了这一点。
4.3 头风饮对硝酸甘油型偏头痛大鼠模型早快基因表达的影响
我们的研究结果显示头风饮高剂量组(相当于人用量20倍)与偏头痛动物模型组在下丘脑、脑干区域内的c-fos、c-jun基因表达阳性细胞数目、面积指标上，均有显著性或极显著性差异；与麦角胺咖啡因片组(相当于人用量20倍)，在下丘脑，脑干区域c-fos、c-jun基因表达阳性细胞数目、面积、灰度上，均无显著性差异，证明头风饮与麦角胺咖啡因片一样，能显著抑制增强的c-fos、c-jun表达，能有效地控制偏头痛发作，具有治疗偏头痛作用，且具有相当的强度。而头风饮中剂量组(相当于人用量的10倍)在某些指标上，如脑干区域c-fos表达阳性细胞数目等，与麦角胺咖啡因组有显著性差异；头风饮低剂量组(相当于人用量的5倍)，在下丘脑区域c-fos表达阳性细胞面积上，与麦角胺咖啡因组有极显著性差异；说明中、低剂量头风饮治疗效果不及麦角胺咖啡因片和高剂量头风饮。
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4.4 头风饮抗实验性偏头痛的作用机理探讨
由于硝酸甘油、实验性偏头痛、早快基因异常表达间的内在联系可能为：硝酸甘油在体内生成NO,NO通过强烈的扩张脑血管效应，造成无菌性炎症；另一方面NO具有神经毒性作用，可激发三叉神经一血管反射[9，10]，诱发实验性偏头痛；这一疼痛刺激激活了谷氨酸-NMDA受体或其他受体，进一步激活了神经元第二信使，如Ca2+等，诱导中枢神经系统内c-fos、c-jun基因表达异常增强。则头风饮抗实验性偏头痛的作用可能通过抑制上述联系中的某个环节而发挥。如可能通过激活5-HT受体，升高血中5-HT水平，收缩偏头痛发作时强烈扩张的脑血管；也可能通过阻滞钙通道，一方面抑制早快基因的表达，另一方面减轻了NO神经毒性效应，从而发挥作用。以上推测还待进一步的实验研究来证实。
基金项目：国家“九.五”攻关课题(95-903-0101)
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作者简介：任永欣，女，1974年4月生；在读博士研究生；研究方向：动物模型与中药抗炎免疫的药理研究。
参考文献
1，南京中医学院编.中医方剂大辞典[M].人民卫生出版社，1993.
2，吴希如，陈清棠.神经系统疾病的分子生物学基础[M].北京医科大学、中国协和医科大学联合出版社，1995.
3，陈丽娟，金国章.治疗偏头痛药物与5-HT受体[J].国外医学*药学分册，1995，22(1)∶20
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6，蔡文琴，王伯氵 云.实用免疫细胞化学[M].四川科技出版社，1988.
7，彭成，罗光宇.脾气虚脾不统血证候动物模型的研究思路[J]中医杂志，1996，37(4)：241
8，Olesen J et al[J]. Trends Pharmacol Sci, 1994；15(5)∶149
9，毛悦时.国外医学[J].神经病学神经外科学分册.1996；23(2)∶77
10，Olesen J. Iversen HK. Neuroreport[M]， 1993.4∶1027
(收稿日期：1999-09-24), 百拇医药
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近年来研究表明，伤害性刺激可诱发早快基因家族中c-fos、c-jun在中枢神经系统(CNS)内的表达增强[2]；而所谓伤害性刺激，是指凡能引起痛觉的刺激，故可认为疼痛能引起c-fos、c-jun在CNS内表达增强。在早快基因与偏头痛的关系研究中，Moskowitz发现：偏头痛期间，三叉神经核尾部内的c-fos基因表达增加[3]；Cristina观察到偏头痛期间，下丘脑室旁核，脑干蓝斑、臂旁核等处c-fos基因表达明显增强[4]。提示早快基因表达和偏头痛之间存在某种内在联系，根据这种联系，结合临床上硝酸甘油诱发人类偏头痛发作的现象，我们按照Cristina报道的方法，复制了大鼠实验性偏头痛模型，对头风饮治疗实验性偏头痛的作用进行了以下研究。
, 百拇医药
1 材料
1.1 药物
(1) 受试药物：头风饮浸膏，每mL含原生药1.2g，由成都中医药大学科技中试中心提供，试验批号：980701。
(2) 造模药物:硝酸甘油注射液,每mL含硝酸甘油5 mg，由广州明兴制药厂生产，批准文号：粤卫药准字(1996)第103246号，生产批号980304。
(3)阳性药物:麦角胺咖啡因片，每片含酒石酸麦角胺1mg，由上海信谊药业有限公司生产，批准文号：沪卫药准字(1995)第0710号-007，生产批号：970401。
1.2 动物
SD大鼠，雌雄各半，体重300 g±30 g，由成都中医药大学动物研究中心提供，动物质量合格证号：川实动管质(97)第8号。检疫后备用。
, http://www.100md.com
1.3 主要试剂：
兔抗c-fos、c-jun抗体，羊血清均由北京中山生物技术有限公司生产：Lot：C168，EXP：12/99为SANTA CRUZ产品；ABC免疫组化试剂，由中美合资华美生物工程公司生产，批号：6026-1。其他试剂均为进口分装或国产分析纯。
1.4 主要仪器
MICROW-500型恒冷箱切片机；电子天平PA2003型；PHS-3C精密酸度计；隔水式电热恒温培养箱；MIAS 97图象分析系统等。
2 方法
2.1 分组、造模、给药
根据Cristina Tassorelli等人报道的方法[7]，取SD大鼠60只，随机分成空白对照组、偏头痛模型组、阳性对照组，头风饮高、中、低剂量组，各组动物均为10只。除空白对照组外，其余各组动物皮下注射硝酸甘油注射剂10 mg/kg，复制实验性偏头痛动物模型。30 min后按组灌胃给药。空白对照组不作处理，偏头痛动物模型组灌胃蒸馏水10 mL/kg，阳性对照组灌胃麦角胺咖啡因药液10 mL/kg(相当于酒石酸麦角胺2mg)，头风饮高、中、低剂量组分别灌胃116.8%、58.4%、29.2%头风饮药液10 mL/kg，分别相当于原生药11.68 g/kg、5.84 g/kg、2.92 g/kg。
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2.2 灌注、取材、切片
造模4 h，即用1%戊巴比妥钠50 mg/kg麻醉动物，仰卧固定，开胸，主动脉插管，剪开右心耳。首先迅速灌注无菌生理盐水100 mL，然后灌注4%PFA磷酸盐缓冲液100 mL。灌注后取大鼠脑组织，在4%PFA磷酸盐缓冲液中固定24 h，然后放入20%蔗糖-PBS液中，至组织块下沉。以恒冷箱切片机-20℃对大鼠脑干、下丘脑连续切片10张[5]，片厚40 μm，切片放入20%蔗糖-PFA液中保存。
2.3 免疫组化反应(ABC法)[6]
切片入0.01MPBS中洗10 min×3次；0.3%Tritonx-100中30min；0.3%H2O2-PBS液中15 min；0.01MPBS中洗10 min×3次，入正常羊血清-0.01MPBS液(1∶60)中孵育20 min；进兔抗c-fos(c-jun)抗体(1∶1500)中孵育1 h；0.01MPBS液中洗10 min×3次；入生物素标记羊抗兔IgG中孵育0.5 h；0.01MPBS中洗10 min×3次；入ABC复合物中孵育0.5 h；0.01MPBS中洗0 min×3次；DAB染色15 min；重蒸水终止染色；用铬明胶将切片贴于载玻片上，过夜晾干；梯度酒精脱水；二甲苯透明2次，中性树胶封片。
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2.4 免疫组化对照试验
(1)非特异性对照：用正常羊血清代替c-fos(c-jun)抗体，其它步骤与ABC法程序相同。
(2)阴性对照：用PBS代替c-fos(c-jun)抗体，其它步骤与ABC法程序相同。
2.5 镜检、图像分析
XDS-1倒置显微镜下：切片背景为淡黄或无色，阳性细胞呈红棕或黄棕色，多为圆形或卵圆形，有聚集成线状、条块状者，也有零星散在者。观察每张切片左上、右上、左下、右下和中央部5个视场阳性细胞总数，利用MIAS97图象分析软件分析每张切片上每个视场阳性细胞的平均面积和平均灰度，PEMS统计软件处理试验数据。由于免疫组化非特异性对照组、阴性对照组阳性细胞极少，几乎没有，故未作统计。
3 结果
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3.1 一般状态观察
除空白对照组外，其余动物造模后30 min左右，均出现双耳发红、前肢频繁搔头，爬笼次数增多，烦躁不安现象。治疗组动物在给药后，上述现象逐渐消失，趋于正常。模型组动物上述现象持续约3小时，继而出现蜷卧，活动减少状态。
3.2 头风饮对实验性偏头痛动物模型c-fos、c-jun基因表达的影响
3.2.1 头风饮对实验性偏头痛动物模型c-fos、c-jun基因表达阳性细胞数的影响
实验性偏头痛动物模型组脑干、下丘脑c-fos、c-jun表达阳性细胞数明显增多，与空白对照组比较有极显著性差异(P<0.01)；头风饮高剂量组脑干、下丘脑c-fos阳性细胞数目明显减少，与模型组比较有极显著性差异(P<0.01)，与阳性对照组、空白对照组比较无显著性差异。头风饮高剂量组脑干、下丘脑c-jun阳性细胞数大大减少，与模型组比较有显著性差异(P<0.05)或极显著性差异(P<0.01)，与阳性对照组、空白对照组比较无显著性差异。试验数据详见表1。
, 百拇医药
表1 头风饮对实验性偏头痛大鼠脑组织中c-fos、c-jun基因表达阳性细胞数的影响(
±S) 组 别动物
(只)
剂量
(g/kg)
c-fos阳性细胞数(个)
c-jun阳性细胞数(个)
脑干切片
下丘脑切片
脑干切片
, 百拇医药
下丘脑切片
空白对照
10
66.76±61.15
95.86±75.64
62.21±57.97
55.21±44.61
模型对照
10
等容积
蒸馏水
329.51±242.71**
, 百拇医药
383.87±305.31**
253.78±121.26**
332.01±181.54**
阳性对照
10
0.002
80.31±61.28△△
86.85±66.73△△
100.98±90.29△
100.23±90.46△△
, 百拇医药
高剂量
11.68
10
86.21±78.39△△
113.01±95.81△△
123.97±71.97△
116.34±60.24△△
中剂量
5.84
10
221.68±138.11○
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128.66±113.01△△
138.12±88.34△
143.80±90.93△△
低剂量
2.29
10
174.36±717.45
128.76±105.12△△
199.68±146.11
159.92±150.54△△
, 百拇医药
与空白对照组比较：**P<0.01；与模型组比较：△P<0.05，△△P<0.01；与阳性对照组比较：○P<0.05。
3.2.2 头风饮对实验性偏头痛动物型c-fos、c-jun基因表达阳性细胞面积的影响
实验性偏头痛动物模型组脑干、下丘脑c-fos、c-jun表达阳性细胞面积明显增大，与空白对照组比较有极显著性差异(P<0.01)；头风饮高剂量组脑干、下丘脑阳性细胞面积大大减小，与模型组比较，有极显著性(P<0.01)或显著性差异(P<0.05)。与阳性对照组，空白对照组比较，均无显著性差异。头风饮高剂量组脑干、下丘脑c-jun阳性细胞面积明显缩小，与模型组比较有极显著性(P<0.01)或显著性差异(P<0.05)；与阳性对照组、空白对照组比较，无显著性差异。试验数据详见表2。
表2 头风饮对实验性偏头痛大鼠脑组织中c-fos、c-jun基因表达阳性细胞面积的影响(
±S) 组别, 百拇医药
动物
(只)
剂量
(g/kg)
c-fos阳性细胞数(个)
c-jun阳性细胞数(个)
脑干切片
下丘脑切片
脑干切片
下丘脑切片
空白对照
10
383.19±213.76
, 百拇医药
309.89±159.54
368.57±168.74
206.66±99.76
模型对照
10
等容积
蒸馏水
1516.87±827.97**
1164.84±486.88**
1085.36±727.48**
986.00±657.00**
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阳性对照
10
0.002
552.08±224.44△△
449.64±203.13△△
363.16±157.87△△
417.54±193.84△
高剂量
11.68
10
558.52±216.64△△
, http://www.100md.com
677.30±358.76△
402.55±152.19△△
470.52±193.84△
中剂量
5.84
10
957.19±445.54○
991.50±113.01**○○
671.36±287.61△
847.18±642.23*
, 百拇医药
低剂量
2.29
10
624.74±316.72△
1064.52±497.39**○○
615.86±347.47△
727.68±674.77
与空白对照组比较：**P<0.05，*P<0.01；与模型组比较：△P<0.05，△△P<0.01；与阳性对照组比较：○P<0.05。
3.2.3 头风饮对实验性偏头痛动物模型c-fos、c-jun基因表达阳性细胞灰度的影响
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实验性偏头痛动物模型组脑干、下丘脑c-fos表达阳性细胞灰度有所减弱，与空白对照组比较有显著性差异(P<0.05)。头风饮治疗各组灰度与阳性对照组比较无显著性差异，c-jun表达阳性细胞的灰度各组间无显著性差异。试验数据详见表3。
表3 头风饮对实验性偏头痛大鼠脑组织中c-fos、c-jun基因表达阳性细胞灰度的影响(
±S) 组 别动物
(只)
剂量
(g/kg)
c-fos阳性细胞数(个)
c-jun阳性细胞数(个)
, http://www.100md.com
脑干切片
下丘脑切片
脑干切片
下丘脑切片
空白对照
10
179.7±47.5
176.1±32.9
192.3±5.6
169.3±13.4
模型对照
10
, 百拇医药 等容积蒸馏水
144.7±20.2*
146.2±21.0*
170.2±5.9
160.9±34.5
阳性对照
10
0.002
142.6±27.2
152.6±21.5
171.1±3.5
, 百拇医药 175.4±3.1
高剂量
11.68
10
142.2±16.8
143.9±12.0
170.9±6.4
177.4±1.9
中剂量
5.84
10
145.1±17.4
, 百拇医药 157.0±13.0
176.4±3.6
175.9±5.2
低剂量
2.29
10
126.8±23.9
147.3±16.8
184.0±25.1
178.2±29.6
与空白对照组比较：P<0.05。
4 讨论
, 百拇医药
4.1 硝酸甘油型实验性偏头痛动物模型的评价
目前，对偏头痛实验性动物模型的研究十分有限，主要的模型除硝酸甘油型偏头痛动物模型外，还有Moskowitz建立的大鼠与豚鼠硬脑膜神经炎症模型；Saxena复制的用放射活性微球测量小猪颈内动静脉吻合支血流的偏头痛动物模型[4]。综合考虑模型设计时应遵循的标准化、相似性、重复性、适用性、经济性原则，硝酸甘油型偏头痛动物模型具有动物易于获得、经济、简便、相似性好，适用性强等特点，故我们选择其进行研究。而实验动物模型的评价，则主要应从造模因素、模型症状表现与病理变化、反证治疗、模型稳定性等几方面进行判断[7]。
人们对硝酸甘油引起偏头痛的认识已有一个世纪。心绞痛病人应用0.3～0.4 mg硝酸甘油，50%以上病人可出现偏头痛性质的头痛；Olesen近来发现持续静脉注射硝酸甘油可引起健康人剂量依赖性的反复发作性头痛，而机体其它任何部位无疼痛[8]。可见，硝酸甘油是偏头痛的诱发因素之一，可以作为造模诱发因素。
, 百拇医药
硝酸甘油造模后，动物出现的双耳发红，前肢频繁搔头，活动增多等表现，提示模型动物出现头部不适；其脑干、下丘脑早快基因c-fos、c-jun表达的异常增强，提示该部位神经元功能敏感。硝酸甘油诱发的这一系列模型表现与病理生化变化，与人类偏头痛发作时的表现及变化有一定的相似性。
偏头痛经典治疗药物麦角胺咖啡因能减轻或消除模型动物的症状表现，显著抑制脑内增强的c-fos、c-jun基因表达，显示了对硝酸甘油型实验性偏头痛动物模型的治疗作用，反证了模型的成立。
在我们的预试及多次反复实验中，硝酸甘油型实验性偏头痛动物模型症状表现相似，病理及生化数据稳定，具有可重复性。
根据疾病动物模型的造模原则和判断标准，进行判断分析，该模型的复制是成功的。
4.2 早快基因的异常表达与偏头痛的内在联系
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早快基因与疼痛关系的研究,自1987年开始以来发展极快，研究结果均证实了疼痛与早快基因表达存在某种内在联系。Moskowitz、Cristina分别于1992、1996年发现偏头痛期间脑内某些核团c-fos表达异常增强，提示早快基因表达与偏头痛之间也存在着一定的内在联系。我们研究发现，模型大鼠脑干、下丘脑c-fos、c-jun表达增强，而这种增强的基因表达只能或主要是由硝酸甘油引起的偏头痛所诱导，进一步证实了早快基因表达与偏头痛间确实存在某种内在联系。
至于偏头痛如何诱导中枢神经系统内早快基因c-fos、c-jun的异常表达，目前尚无定论。认为与神经元第二信使的激活密切相关。中枢神经元对疼痛作出应答反应的程序可能是，疼痛刺激→谷氨酸NMDA或其他受体激活→第二信使激活→第二信使诱导c-fos(c-jun)转录mRNA→mRNA在胞浆内翻译合成Fos(Jun)→Fos与Jun在胞核中形成复合物并与目的基因内的AP-1调节位点结合→进一步激活目的基因的表达而最终对该疼痛刺激作出反应[3]。可见c-fos与c-jun的表达是偶联的，Fos蛋白必须与c-jun转录mRNA编码的蛋白Jun结合，共同介导表达。
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因此，虽然对c-jun基因表达研究较少，但理论上c-jun与c-fos在痛觉调制上应该是功能相似的基因，我们研究发现，硝酸甘油诱导的偏头痛大鼠脑内c-jun表达与c-fos表达基本一致，也证实了这一点。
4.3 头风饮对硝酸甘油型偏头痛大鼠模型早快基因表达的影响
我们的研究结果显示头风饮高剂量组(相当于人用量20倍)与偏头痛动物模型组在下丘脑、脑干区域内的c-fos、c-jun基因表达阳性细胞数目、面积指标上，均有显著性或极显著性差异；与麦角胺咖啡因片组(相当于人用量20倍)，在下丘脑，脑干区域c-fos、c-jun基因表达阳性细胞数目、面积、灰度上，均无显著性差异，证明头风饮与麦角胺咖啡因片一样，能显著抑制增强的c-fos、c-jun表达，能有效地控制偏头痛发作，具有治疗偏头痛作用，且具有相当的强度。而头风饮中剂量组(相当于人用量的10倍)在某些指标上，如脑干区域c-fos表达阳性细胞数目等，与麦角胺咖啡因组有显著性差异；头风饮低剂量组(相当于人用量的5倍)，在下丘脑区域c-fos表达阳性细胞面积上，与麦角胺咖啡因组有极显著性差异；说明中、低剂量头风饮治疗效果不及麦角胺咖啡因片和高剂量头风饮。
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4.4 头风饮抗实验性偏头痛的作用机理探讨
由于硝酸甘油、实验性偏头痛、早快基因异常表达间的内在联系可能为：硝酸甘油在体内生成NO,NO通过强烈的扩张脑血管效应，造成无菌性炎症；另一方面NO具有神经毒性作用，可激发三叉神经一血管反射[9，10]，诱发实验性偏头痛；这一疼痛刺激激活了谷氨酸-NMDA受体或其他受体，进一步激活了神经元第二信使，如Ca2+等，诱导中枢神经系统内c-fos、c-jun基因表达异常增强。则头风饮抗实验性偏头痛的作用可能通过抑制上述联系中的某个环节而发挥。如可能通过激活5-HT受体，升高血中5-HT水平，收缩偏头痛发作时强烈扩张的脑血管；也可能通过阻滞钙通道，一方面抑制早快基因的表达，另一方面减轻了NO神经毒性效应，从而发挥作用。以上推测还待进一步的实验研究来证实。
基金项目：国家“九.五”攻关课题(95-903-0101)
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作者简介：任永欣，女，1974年4月生；在读博士研究生；研究方向：动物模型与中药抗炎免疫的药理研究。
参考文献
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2，吴希如，陈清棠.神经系统疾病的分子生物学基础[M].北京医科大学、中国协和医科大学联合出版社，1995.
3，陈丽娟，金国章.治疗偏头痛药物与5-HT受体[J].国外医学*药学分册，1995，22(1)∶20
4，Cristina Moskowitz Saxena et al Experimental Headche Models,1996.
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6，蔡文琴，王伯氵 云.实用免疫细胞化学[M].四川科技出版社，1988.
7，彭成，罗光宇.脾气虚脾不统血证候动物模型的研究思路[J]中医杂志，1996，37(4)：241
8，Olesen J et al[J]. Trends Pharmacol Sci, 1994；15(5)∶149
9，毛悦时.国外医学[J].神经病学神经外科学分册.1996；23(2)∶77
10，Olesen J. Iversen HK. Neuroreport[M]， 1993.4∶1027
(收稿日期：1999-09-24), 百拇医药