2-Cado对脑缺血再灌注后血清及皮质TNF-α含量的影响
作者：徐艳 张晓琴
单位：徐艳(430071 湖北医科大学附属第二医院神经科)；张晓琴(430071 湖北医科大学附属第二医院神经科)
关键词：2-Cado；脑缺血再灌注；肿瘤坏死因子-α
脑与神经疾病杂志000302
摘 要 目的：研究大鼠局灶性脑缺血再灌注后非选择性腺苷受体激动剂2-CAdo(2-Chloroadenosine)对血清及皮质肿瘤坏死因子-α(TNF-α)含量的影响， 从而进一步探讨腺苷受体激动剂的神经保护作用。 方法 采用线栓法制备大鼠局灶性脑缺血再灌注模型， 于缺血后即刻经静脉注射2-CAdo， 应用放射免疫法测定缺血1h再灌注6h后血清及皮质TNF-α的含量。 结果 2-CAdo能显著降低脑缺血再灌注后血清及皮质TNF-α的含量。 结论 2-CAdo可通过降低脑缺血再灌注后增高的TNF-α水平， 达到神经保护作用。
, 百拇医药
Influence of 2-CAdo on TNF-α levels in serum and cortex after focal cerebral ischemia-reperfusion
Xu Yan Zhang Xiaoqing
(Department of Neurology, The Second Affilated Hospital of Hubei Medical University, Wuhan, 430071)
Abstract Objective To study the effect of nonselective adenosine receptor agonist 2-chloroadenosine(2-CAdo) on trmor necrosis factor-alpha(TNF-α) levels in serum and cortex of rats after focal cerebral ischemia-reperfusion. So as to explore the neuroprotective mechanism of adensine receptor agonist. Methods We established the focal cerebral ischemia-reperfusion model with thread embolish of middle cerebral artery, injected 2-CAdo via vein as soon as ischemia, and determined the levels of TNF-α in serum and cortex after 1 hour ischemia and 6 hour reperfusion by RIA. Results 2-CAdo can decrease the levels of TNF-α in serum and cortex after focal cerebral ischemia-reperfusion. Conclusion 2-CAdo showed a potent neuroprotective effect through decreasing the increased TNF-α after cerebral ischemia-reperfusion.
, 百拇医药
Key words 2-Chloroadenosine Cerebral ischemia-reperfusion Tumor neurosis factor-alpha▲
腺苷是一种公认的脑保护剂。已经发现，它可通过抑制兴奋性氨基酸的释放、抑制氧自由基的产生、抑制一氧化氮的作用及改善脑血流、延迟缺氧性去极化的发生等减轻脑缺血再灌注损伤。但关于腺苷与炎症反应的关系则未见报道。本研究通过观察非选择性腺苷受体激动剂2-CAdo在大鼠局灶性脑缺血再灌注模型中对血清及皮质TNF-α含量的影响，以进一步探讨腺苷的神经保护作用。
材料与方法
一、动物与分组
SD大鼠15只，雌雄不限，体重200～250g，购自同济医科大学实验动物中心。随机分成假手术组(n=5)，生理盐水组(n=5)和2-CAdo治疗组(n=5)。
, 百拇医药
二、动物模型的建立
采用线栓法制备大鼠局灶性脑缺血再灌注模型。10%水合氯醛(300mg/kg)腹腔麻醉，经颈正中切口，暴露结扎右侧颈外动脉及其分支，经其残端插入头端烫圆的4～0单尼龙线，长度由分叉部计约18.5±0.5mm。再灌注时将线拔出。假手术组未将线插入。术中保持肛温在37℃～37.5℃。
三、实验方法
药物在缺血后即刻经静脉注入。2-CAdo(购自RBI公司)以12ml/kg经静脉注入，生理盐水组则注入等容的生理盐水。再灌6h后断头取脑。
四、标本处理
处死动物前行心脏采血留取血标本待检。按时快速断头取脑，于冰盘上迅速剥离皮质，称湿重，按脑湿重：HAc=100mg∶1ml的比例加入0.1MHAc，匀浆，100℃水浴10～15min，3000r/min离心10～15min，吸取上清，-70℃保存待测。
, 百拇医药
五、TNF-α测定
TNF-α测定采用放射免疫法(RIA)，试剂盒购自东亚免疫技术研究所，严格按试剂盒内说明操作。
六、统计方法
数据以均数和标准差(
±s)表示，不同组间比较采用方差分析，两样本比较采用t检验。
结 果
脑缺血1h再灌注6h后，血清及皮质TNF-α含量显著升高(P<0.01)。2-CAdo治疗组与生理盐水组比较，血清及皮质TNF-α含量显著下降(P<0.01)，与假手术组比较，统计学上无显著性差异(P>0.05)。三组缺血侧皮质与对侧皮质TNF-α含量比较，均显著高于对侧(P<0.01)。(见表1)
, 百拇医药
表1 各组血清及皮质TNF-α含量 组别
血 清
皮 质
缺血侧
非缺血侧
例数
TNF-α(ng/ml)
例数
TNF-α(ng/g wet)
例数
TNF-α(ng/g wet)
假手术组
, 百拇医药
5
2.026±0.156
5
7.280±1.443
5
4.670±0.764
生理盐水组
5
2.745±0.244*
5
15.738±3.183*
5
, 百拇医药
10.562±3.654*
2-CAdo治疗组
5
2.076±0.151△
5
7.544±0.931△
5
5.704±0.706△
*假手术组比较P<0.01 △与生理盐水组比较P<0.01
讨 论
, http://www.100md.com
近年来， 随着溶栓治疗的开展， 再灌注损伤日益受到重视。 而炎症反应参与脑缺血再灌注损伤。 TNF-α作为一种重要的炎性细胞因子， 已被证实在缺血再灌性脑损伤中具有重要作用。 缺血再灌注早期， 即可出现TNF-α水平的显著升高[1]。 Zhai等[2]采用RT-PCR发现， 大鼠局灶性脑缺血后缺血侧及对侧TNF-α表达均增加， 6h达峰值， 对侧的细胞因子与缺血侧有相同的过程变化， 但水平较低。 本研究采用放射免疫法观察到， 大鼠局灶性脑缺血1h再灌注6h， 血清及皮质TNF-α含量显著升高(P<0.01)， 缺血侧皮质与对侧皮质出现相同的变化， 但对侧皮质水平明显低于缺血侧， 这与以往研究结果一致， 表明TNF-α参与缺血再灌注脑损伤的发生、 发展过程。 TNF-α主要由神经元、 星形细胞、 室管膜细胞和小胶质细胞表达[3]。 产生的TNF-α通过以下途径引起脑损伤： ①经ICAM-1调节引起血管炎性反应。 ②与内皮细胞相互作用导致内皮细胞表面凝血和抗凝机制平衡失调， 出现凝血机制占优势而有促凝血作用。 ③影响血管舒缩活性物质的表达。 ④激活补体， 产生补体介导的细胞损伤。 ⑤诱导一氧化氮合酶的表达使NO合成释放增加， 刺激花生四烯酸代谢， 使自由基释放增多[4，5]。 采用各种措施拮抗TNF-α的表达， 将会减轻脑损伤。 已经证明， 抗TNF-α单克隆抗体、 TNF结合蛋白(TNFbp)、 MK801、 甲基强的松龙等都有该种作用。 腺苷是中枢神经系统的一种抑制性神经调质， 在大脑的能量储存及能量需求间提供信号， 使之达到一种平衡。 腺苷受体包括A1、 A2、 A3三种类型， 分别与不同的G蛋白相偶联， 激活/抑制不同受体， 对缺血性脑损伤发挥不同作用。 2-CAdo为一种非选择性腺苷受体激动剂， 其对三种受体的亲和力为A1>A3>A2。 Bouma等[6]的体外实验证明2-CAdo可以抑制培养的单核细胞产生TNF-α， 其最佳抑制浓度为100uM。 但关于2-CAdo对脑缺血再灌注时TNF-α表达的影响则未见报道。 本研究表明， 2-CAdo可以使局灶性脑缺血再灌注大鼠血清及皮质TNF-α表达降低， 明显低于生理盐水组(P<0.01)， 与假手术组无显著性差异(P>0.05)。 Bouma等[6]认为2-CAdo通过激活与Gs蛋白相偶联的A2受体活化AC， 使细胞内cAMP含量增加， 从而达到抑制TNF-α表达的作用。 而Sajjadi等[7]则有不同看法， 他们认为2-CAdo是通过激活A3受体来抑制TNF-α的表达， 是在翻译前水平发挥作用的。 尽管关于2-CAdo的作用机制目前尚未明了， 但本研究表明， 2-CAdo可以抑制脑缺血再灌注后TNF-α的表达， 这为临床治疗再灌注损伤提供了一条新的理论依据。
, 百拇医药
参 考 文 献
1，Wang, X, Yue TL, Barone FC, et al. Concomitant cortical expression of TNF-alpha and IL-1 beta mRANs follows early response gene expression in transient focal ischemia. Mol Chem Neuropathol, 1994,23∶103.
2，Zhai QH,Futrell N, Chen FJ. Gene expression of IL-10 in relationship to TNF-alpha, IL-1 beta and IL-2 in the rat brain following middle cerebral artery occlusion. J Neurol Sci, 1997,152∶119
, http://www.100md.com
3，Siven AL, Liu Y, Feuerstein G, et al. Increased release of tumor necrosis factor-α into the cerebro-spinal fluid and peripheral circulation of aged rats. Stroke, 1993,24∶880
4，Feurstein GZ, Liu T,Barone FC. Cytokines, inflammation and brain injury: role of tumor necrosis factor-alpha. Cerebrovasc Brain Metab Rev, 1994,6∶341
5，Klemm P, Warner TD, Hohlfeld T,et al. Endothelin-1 mediates exvivo coronary vasoconstriction caused by exogenous and endogenus cytokines. Proc-Natl-Acad-Sci USA,1995,92∶269
, 百拇医药
6，Bouma MG, R.K.Stad, F.A.M.van den Wildenberg, et al. Differential regulatory effects of adenosine on cytokine release by activated human monocytes. J Immunol, 1994,153∶4159
7，Sajjadi FG, Takabayashi K, Foster AC, et al. Inhibition of TNF-α expression by adenosine. Role of As adenosine receptors. J Immunol,1996,156∶3435
(1999-12-15 收稿), http://www.100md.com
单位：徐艳(430071 湖北医科大学附属第二医院神经科)；张晓琴(430071 湖北医科大学附属第二医院神经科)
关键词：2-Cado；脑缺血再灌注；肿瘤坏死因子-α
脑与神经疾病杂志000302
摘 要 目的：研究大鼠局灶性脑缺血再灌注后非选择性腺苷受体激动剂2-CAdo(2-Chloroadenosine)对血清及皮质肿瘤坏死因子-α(TNF-α)含量的影响， 从而进一步探讨腺苷受体激动剂的神经保护作用。 方法 采用线栓法制备大鼠局灶性脑缺血再灌注模型， 于缺血后即刻经静脉注射2-CAdo， 应用放射免疫法测定缺血1h再灌注6h后血清及皮质TNF-α的含量。 结果 2-CAdo能显著降低脑缺血再灌注后血清及皮质TNF-α的含量。 结论 2-CAdo可通过降低脑缺血再灌注后增高的TNF-α水平， 达到神经保护作用。
, 百拇医药
Influence of 2-CAdo on TNF-α levels in serum and cortex after focal cerebral ischemia-reperfusion
Xu Yan Zhang Xiaoqing
(Department of Neurology, The Second Affilated Hospital of Hubei Medical University, Wuhan, 430071)
Abstract Objective To study the effect of nonselective adenosine receptor agonist 2-chloroadenosine(2-CAdo) on trmor necrosis factor-alpha(TNF-α) levels in serum and cortex of rats after focal cerebral ischemia-reperfusion. So as to explore the neuroprotective mechanism of adensine receptor agonist. Methods We established the focal cerebral ischemia-reperfusion model with thread embolish of middle cerebral artery, injected 2-CAdo via vein as soon as ischemia, and determined the levels of TNF-α in serum and cortex after 1 hour ischemia and 6 hour reperfusion by RIA. Results 2-CAdo can decrease the levels of TNF-α in serum and cortex after focal cerebral ischemia-reperfusion. Conclusion 2-CAdo showed a potent neuroprotective effect through decreasing the increased TNF-α after cerebral ischemia-reperfusion.
, 百拇医药
Key words 2-Chloroadenosine Cerebral ischemia-reperfusion Tumor neurosis factor-alpha▲
腺苷是一种公认的脑保护剂。已经发现，它可通过抑制兴奋性氨基酸的释放、抑制氧自由基的产生、抑制一氧化氮的作用及改善脑血流、延迟缺氧性去极化的发生等减轻脑缺血再灌注损伤。但关于腺苷与炎症反应的关系则未见报道。本研究通过观察非选择性腺苷受体激动剂2-CAdo在大鼠局灶性脑缺血再灌注模型中对血清及皮质TNF-α含量的影响，以进一步探讨腺苷的神经保护作用。
材料与方法
一、动物与分组
SD大鼠15只，雌雄不限，体重200～250g，购自同济医科大学实验动物中心。随机分成假手术组(n=5)，生理盐水组(n=5)和2-CAdo治疗组(n=5)。
, 百拇医药
二、动物模型的建立
采用线栓法制备大鼠局灶性脑缺血再灌注模型。10%水合氯醛(300mg/kg)腹腔麻醉，经颈正中切口，暴露结扎右侧颈外动脉及其分支，经其残端插入头端烫圆的4～0单尼龙线，长度由分叉部计约18.5±0.5mm。再灌注时将线拔出。假手术组未将线插入。术中保持肛温在37℃～37.5℃。
三、实验方法
药物在缺血后即刻经静脉注入。2-CAdo(购自RBI公司)以12ml/kg经静脉注入，生理盐水组则注入等容的生理盐水。再灌6h后断头取脑。
四、标本处理
处死动物前行心脏采血留取血标本待检。按时快速断头取脑，于冰盘上迅速剥离皮质，称湿重，按脑湿重：HAc=100mg∶1ml的比例加入0.1MHAc，匀浆，100℃水浴10～15min，3000r/min离心10～15min，吸取上清，-70℃保存待测。
, 百拇医药
五、TNF-α测定
TNF-α测定采用放射免疫法(RIA)，试剂盒购自东亚免疫技术研究所，严格按试剂盒内说明操作。
六、统计方法
数据以均数和标准差(
±s)表示，不同组间比较采用方差分析，两样本比较采用t检验。结 果
脑缺血1h再灌注6h后，血清及皮质TNF-α含量显著升高(P<0.01)。2-CAdo治疗组与生理盐水组比较，血清及皮质TNF-α含量显著下降(P<0.01)，与假手术组比较，统计学上无显著性差异(P>0.05)。三组缺血侧皮质与对侧皮质TNF-α含量比较，均显著高于对侧(P<0.01)。(见表1)
, 百拇医药
表1 各组血清及皮质TNF-α含量 组别
血 清
皮 质
缺血侧
非缺血侧
例数
TNF-α(ng/ml)
例数
TNF-α(ng/g wet)
例数
TNF-α(ng/g wet)
假手术组
, 百拇医药
5
2.026±0.156
5
7.280±1.443
5
4.670±0.764
生理盐水组
5
2.745±0.244*
5
15.738±3.183*
5
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10.562±3.654*
2-CAdo治疗组
5
2.076±0.151△
5
7.544±0.931△
5
5.704±0.706△
*假手术组比较P<0.01 △与生理盐水组比较P<0.01
讨 论
, http://www.100md.com
近年来， 随着溶栓治疗的开展， 再灌注损伤日益受到重视。 而炎症反应参与脑缺血再灌注损伤。 TNF-α作为一种重要的炎性细胞因子， 已被证实在缺血再灌性脑损伤中具有重要作用。 缺血再灌注早期， 即可出现TNF-α水平的显著升高[1]。 Zhai等[2]采用RT-PCR发现， 大鼠局灶性脑缺血后缺血侧及对侧TNF-α表达均增加， 6h达峰值， 对侧的细胞因子与缺血侧有相同的过程变化， 但水平较低。 本研究采用放射免疫法观察到， 大鼠局灶性脑缺血1h再灌注6h， 血清及皮质TNF-α含量显著升高(P<0.01)， 缺血侧皮质与对侧皮质出现相同的变化， 但对侧皮质水平明显低于缺血侧， 这与以往研究结果一致， 表明TNF-α参与缺血再灌注脑损伤的发生、 发展过程。 TNF-α主要由神经元、 星形细胞、 室管膜细胞和小胶质细胞表达[3]。 产生的TNF-α通过以下途径引起脑损伤： ①经ICAM-1调节引起血管炎性反应。 ②与内皮细胞相互作用导致内皮细胞表面凝血和抗凝机制平衡失调， 出现凝血机制占优势而有促凝血作用。 ③影响血管舒缩活性物质的表达。 ④激活补体， 产生补体介导的细胞损伤。 ⑤诱导一氧化氮合酶的表达使NO合成释放增加， 刺激花生四烯酸代谢， 使自由基释放增多[4，5]。 采用各种措施拮抗TNF-α的表达， 将会减轻脑损伤。 已经证明， 抗TNF-α单克隆抗体、 TNF结合蛋白(TNFbp)、 MK801、 甲基强的松龙等都有该种作用。 腺苷是中枢神经系统的一种抑制性神经调质， 在大脑的能量储存及能量需求间提供信号， 使之达到一种平衡。 腺苷受体包括A1、 A2、 A3三种类型， 分别与不同的G蛋白相偶联， 激活/抑制不同受体， 对缺血性脑损伤发挥不同作用。 2-CAdo为一种非选择性腺苷受体激动剂， 其对三种受体的亲和力为A1>A3>A2。 Bouma等[6]的体外实验证明2-CAdo可以抑制培养的单核细胞产生TNF-α， 其最佳抑制浓度为100uM。 但关于2-CAdo对脑缺血再灌注时TNF-α表达的影响则未见报道。 本研究表明， 2-CAdo可以使局灶性脑缺血再灌注大鼠血清及皮质TNF-α表达降低， 明显低于生理盐水组(P<0.01)， 与假手术组无显著性差异(P>0.05)。 Bouma等[6]认为2-CAdo通过激活与Gs蛋白相偶联的A2受体活化AC， 使细胞内cAMP含量增加， 从而达到抑制TNF-α表达的作用。 而Sajjadi等[7]则有不同看法， 他们认为2-CAdo是通过激活A3受体来抑制TNF-α的表达， 是在翻译前水平发挥作用的。 尽管关于2-CAdo的作用机制目前尚未明了， 但本研究表明， 2-CAdo可以抑制脑缺血再灌注后TNF-α的表达， 这为临床治疗再灌注损伤提供了一条新的理论依据。
, 百拇医药
参 考 文 献
1，Wang, X, Yue TL, Barone FC, et al. Concomitant cortical expression of TNF-alpha and IL-1 beta mRANs follows early response gene expression in transient focal ischemia. Mol Chem Neuropathol, 1994,23∶103.
2，Zhai QH,Futrell N, Chen FJ. Gene expression of IL-10 in relationship to TNF-alpha, IL-1 beta and IL-2 in the rat brain following middle cerebral artery occlusion. J Neurol Sci, 1997,152∶119
, http://www.100md.com
3，Siven AL, Liu Y, Feuerstein G, et al. Increased release of tumor necrosis factor-α into the cerebro-spinal fluid and peripheral circulation of aged rats. Stroke, 1993,24∶880
4，Feurstein GZ, Liu T,Barone FC. Cytokines, inflammation and brain injury: role of tumor necrosis factor-alpha. Cerebrovasc Brain Metab Rev, 1994,6∶341
5，Klemm P, Warner TD, Hohlfeld T,et al. Endothelin-1 mediates exvivo coronary vasoconstriction caused by exogenous and endogenus cytokines. Proc-Natl-Acad-Sci USA,1995,92∶269
, 百拇医药
6，Bouma MG, R.K.Stad, F.A.M.van den Wildenberg, et al. Differential regulatory effects of adenosine on cytokine release by activated human monocytes. J Immunol, 1994,153∶4159
7，Sajjadi FG, Takabayashi K, Foster AC, et al. Inhibition of TNF-α expression by adenosine. Role of As adenosine receptors. J Immunol,1996,156∶3435
(1999-12-15 收稿), http://www.100md.com