益气通络丹含药血清对大鼠血管平滑肌细胞的影响引起腹泻念珠菌耐药状况分析
作者：黄伟毅 陈素云 邱幸生 朱成全
单位：黄伟毅(510010 广东省广州市,广州军区总医院中医科)；陈素云(第一军医大学中医系)；邱幸生(解放军157医院)；朱成全(第一军医大学研究生队)
关键词：益气通络丹；血管平滑肌；清药理学；MTT；一氧化氮
中国微循环000305
【摘要】 目的 观察益气通络丹(YQTLD)含药血清对培养SD大鼠胸主动脉平滑肌细胞(VSMC)的影响，探讨该药临床抗冠心病、脑梗塞等心脑血管疾病的作用机制。方法 血清药理学方法制备含药血清：MTT法测定含药血清对VSMC增殖活性的影响；NO试剂盒测定含药血清对VSMC作用与NO的关系。结果 YQTLD含药血清能显著降低培养的SD大鼠VSMC MTT法的OD值，与空白血清组有显著性差异(P<0.01)；YQTLD含药血清组培养基中NO含量明显增多，与空白血清组有显著性差异(P<0.01)。结论 YQTLD有抗VSMC增殖的作用，此作用可能与NO有关，YQTLD可能通过抗VSMC增殖活性，促进NO释放在临床治疗上发挥作用。
, 百拇医药
Effect of YQTLD on Rat's VSMC Using Serologic Pharmacological Test
Huang Weiyi,Chen Suyun,Qiu Xingsheng,et al.
(General Hospital of Guangzhou Unit,PLA，Guangzhou,510010)
【Abstract】Objective. To observe the effect of serum containing YQTLD on SD rat's culture VSMC.Methods Serum containing YQTLD was prepared by serum pharmacological method. VSMC culture was treated with the serum, the influence of YQTLD on proliferating activity of VSMC was determined by MTT test. The amount of NO tested by NO test kit. Results 1.Serum containing YQTLD could decrease the OD value of VSMC tested by MTT method, and there was singificant difference (P<0.01) compared with the control serum ;2.The amount of NO in the culture medium of serum containing YQTLD which could inhibit proliferation of VSMC increased remarkably, and there was significant difference(P<0.01) compared with the control serum. Conclusions 1.YQTLD could inhibit the proliferation of VSMC. 2.The mechanism might relate to the increasing of NO in the culture medium. 3. The mechanism of YQTLD’s effect on vascular disease, such as coronary heart disease, cerebral thrombosis might be in relation to the influence of inhibiting proliferation on VSMC.
, 百拇医药
【Key words】YQTLD Vascular smooth muscle cell Serum pharmacology MTT Nitric oxide
YQTLD是陈素云教授的经验方，临床上对冠心病、脑血栓等心脑血管疾病具有良好的疗效。本实验从抗VSMC增殖方面对其疗效机理作了探讨，报告如下。
材料与方法
1 材料
1.1 药物：
YQTLD药液：YQTLD由黄芪15g、赤芍20g、红花3g、川芎10g、地龙6g等组成(药材由广州药材公司提供)，按组方配制混合，煮取浓缩调节浓度至1.6g/ml(大剂量)、0.8g/ml(小剂量，按生药量大鼠与成人体表面积比换算)。
, http://www.100md.com 开博通药液(批号9707032)将药研成细末，用单蒸水配制，按大鼠与成人体表面积比换算，配成0.338g/ml。
1.2 动物：SD大鼠，体重160～220g，由第一军医大学动物研究所提供。
1.3 主要试剂：
DMEM粉(美国 Gibco公司)、 Hepes(德国 Boeringer mannheim公司)胎牛血清(杭州四季青)、MTT液(美国Sigma公司)、NO试剂盒(军事医学科学院放射医学研究所，A试剂：磺胺；B试剂：荼乙烯二胺盐酸盐；C试剂：硫酸锌；D试剂：氢氧化钠；E试剂：亚硝酸钠)、胰蛋白酶(英国Advanced技术工业公司)
1.4 主要仪器
CO2电热恒温培养箱(Heraeuse 公司)、超净工作台(Heraeuse公司)
, 百拇医药
倒置显微镜(日本OLYMPUS)、电子天平(美国SARTORIUS公司)、微量加样品(上海产)、细胞刮子(美国密理博公司)、不锈钢滤器(上海产)、∑960自动酶标仪(日本产)、UV-754紫外光分光光度计(上海产)
2 方法
2.1 含药血清的制备：
SD大鼠40只随机分为四组，每组10只。大剂量组：每日灌1.6g/ml的YQTLD药液；小剂量组：每日灌0.8g/ml的YQTLD药液；空白组：每日灌0.9%的生理盐水；西药组：每日灌0.338g/ml开博通药液。按文献方法[1]制备血清，56℃灭活30min，-20℃冰箱保存备用。
2.2 细胞培养及鉴定：细胞培养：取SD大鼠的胸主动脉血管平滑肌，按传统的组织贴块法培养。用0.1%胰蛋白酶和0.02%EDTA消化传代。本实验用5～8代细胞。
, 百拇医药
鉴定：相差显微镜观察：细胞呈梭形或长梭形，可重叠生长达多层，高低起伏，呈典型的“峰与谷”样生长，用抗肌动蛋白α-actin的单抗通过免疫化学方法鉴定平滑肌细胞的特异性肌动蛋白。
3 MTT法测定含药血清对平滑肌增殖的影响
3.1 同一浓度含药血清对VSMC增殖的影响：
分为四组：小剂量组、大剂量组、开博通组、空白组：各组在原培养基中加相应的含药血清。各组含药血清的终浓度均为5%，作用时间均为24h。
3.2 不同浓度的YQTLD含药血清对VSMC增殖的影响
分为六组：各组在原培养基中加大剂量组YQTLD含药血清，使其终浓度分别为1组：25%；2组：5%；3组：1%；4组：0.20%；5组：0.04%；6组：空白血清组。作用时间为24h。
, http://www.100md.com
3.3 MTT法实验操作：
3.3.1 细胞传代时，均匀接种至96孔板，每孔培养基总量200ul，按上述分组加入处理因素37℃、5%CO2培养24h后，加入MTT液(20ul/孔)，继续培养4h。
3.3.2 吸出孔内培养基后，加入二甲亚砜(DMSO)，室温下振荡10min，使结晶溶解。
3.3.3 ∑960自动酶标仪测定各孔OD值(λ=560nm)。记录结果，统计分析。
4 NO试剂盒测定含药血清抗VSMC增殖与NO的关系
4.1 含药血清对VSNC的NO释放的影响
分为四组：1组：大剂量组YQTLD含药血清；2组：小剂量组YQTLD含药血清；3组：开博通含药血清；4组：空白血清，各组分别在原培养基中加入响应的含药血清，终浓度均为5%，作用时间均为24h。
, 百拇医药
4.2 NO含量的测定：
细胞传代时，均匀接种至96孔板，每孔培养基总量200ul,按上述分组每组6瓶，37℃、5%CO2培养至相应时间，用军事科学院放射医学研究所NO试剂盒测试，按试剂盒操作步骤操作，用紫外光分光光度计在波长λ=545nm比色，读OD值。制作标准曲线，按测定说明书进行，得曲线方程：y=0.92+1117.8x,根据样品OD值计算NO含量并记录结果。
5 统计方法：采用SPSS软件进行方差分析，P<0.05有显著性意义。
结 果
1 含药血清对VSMC增殖活性的影响见表1。
表1 四组含药血清对VSMC增殖活性的影响(
±s)
, 百拇医药
分组
OD值
小剂量组
0.285±0.0712
大剂量组
0.205±0.0481*＃
开博通组
0.207±0.0319*＃
空白组
0.250±0.0660
注：*与空白组比较： P<0.01，＃与小剂量组比较： P<0.01(n=6)
, http://www.100md.com
2 不同浓度的YQTLD含药血清对VSMC增殖活性的影响见表2。
表2 不同浓度含药血清对VSMC增殖活性的影响(±s)
分组
OD值
25%组
0.072±0.215*
5%组
0.429±0.0384*＃
1%组
0.7175±0.111
, 百拇医药
0.2%组
0.781±0.1826
0.4%组
0.746±0.1311
空白组
0.64±0.241
注：*与空白组比较： P<0.01，＃与5%组比较： P<0.01(n=6)
3 各组含药血清作用时培养基中NO含量的情况见表3。
表3 各组含药血清作用时培养基中NO含量的情况(±s)
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分组
NO含量(umol/L)
小剂量组
5.675±0.975*＃
大剂量组
3.025±0.963
开博组
5.337±1.095*＃
空白组
3.163±1.216
注：*与空白组比较： P<0.01，＃与小剂量YQTLD组比较： P<0.01(n=8)
, 百拇医药
讨论
YQTLD是补阳还五汤的化裁方，具有益气活血，补肾通络，化痰止痛的功效。以往的动物实验研究表明：其临床疗效可能与该药降低血浆中脂质过氧化物形成，提高T-SOD、CU-Zn-SOD活性，促进血浆中NO释放增多，改善缺血后血流灌注，降低血液粘滞度，抗血小板聚集等多种作用有关[2,3]。
血清药理学是近年来提出的一种针对中药复方研究的新的药理学方法，尤其在体外实验中考虑了体内代谢的因素，排除了中药粗制剂杂质的影响，因此，为中药复方的研究提供了新的思路[4]。
已经证实：VSMC的增殖与冠心病、脑血栓以及高血压的主要病理基础密切相关。因此，寻找抑制VSMC生长的因素和途径，延缓AS的发生、发展将是当今心血管病学研究的重要课题[5]。
本实验结果显示：大剂量组YQTLD与开搏通含药血清组有明显降低作用细胞中的OD值，而小剂量与空白组无显著性差异。大剂量组YQTLD含药血清作用有随浓度递增而增强趋势。这表明益气通络丹含药血清中可能含有某种直接或间接可抑制VSMC增殖的活性物质，该物质是益气通络丹经过体内复杂的代谢过程产生的，其具体有效成分有待进一步实验研究。
, 百拇医药
NO对多种病理因素引起的SMC增殖均有明显的抑制作用[7]，是抗心脑血管疾病的因子。本实验结果显示：大剂量YQTLD含药血清及开搏通含药血清组培养基内的NO含量显著增多，且两者之间无显著性差异(P>0.05)。两者与小剂量YQTLD含药血清组及空白组有显著性差异(P<0.05), 而小剂量YQTLD含药血清组与空白组之间无显著性差异。这表明：益气通络丹含药血清和开搏通含药血清对VSMC增殖活性的抑制作用与NO含量的增多有关，这与近年有关开搏通的文献研究相符[6]。因此，YQTLD可能通过抑制VSMC增殖活性、促进NO的释放，在冠心病、脑血栓等心脑血管疾病中发挥治疗和保护作用。
致谢：在本文的写作过程中得到广州军区总医院中医科沈鹰主任的审校和指导，特此感谢。
参考文献
1，王伟.精制血府胶囊刺激缺氧缺糖心肌细胞RNA及蛋白质合成的研究.北京中医药大学学报.1997，20(2)：17
, 百拇医药
2，沈剑刚，陈素云，郭志刚.益气通络丹对心肌缺血再灌注损伤脂质过氧化及纤溶活性的影响.中国病理生理杂志.1996；12(2)：130
3，徐文学，陈素云.益气通络丹对应激诱发大鼠血小板聚集性血浆血栓素B2和6-酮-前列腺素F1a变化的影响.中国病理生理杂志.1995,11(3):321
4，崔晓兰.中药药理研究的新思路-中药血清药理学.中国中医药科技.1997，4(4)：239
5，黄伟毅，陈素云，邱辛生.抗动脉粥样硬化的中医药研究进展.中医药研究.1998,14(5):58
6，Uchara Y, Unmabc A, Kawabata Y，et al. Inhibition of protein synthesis and antiproliferative effect of the angitotersin converting enzyme inhibitor trandolaprilat in rat vascular smooth muscle cells. J hypertens.1993,13:1073
, 百拇医药
7，Scott-Burden T, Vanhoutte PM. The endothelium as a regulator of vascular smooth muscle proliferation. Circulation.1993,87(supplv):51
(收稿：1999-08-30
修回：1999-12-17)
中国微生态学杂志 2000年第4期第12卷 临床研究
引起腹泻念珠菌耐药状况分析
作者：王明丽 潘亚萍
单位：王明丽(浙江省肿瘤医院，310022)；潘亚萍(杭州市红会医院)
关键词：, 百拇医药
单位：黄伟毅(510010 广东省广州市,广州军区总医院中医科)；陈素云(第一军医大学中医系)；邱幸生(解放军157医院)；朱成全(第一军医大学研究生队)
关键词：益气通络丹；血管平滑肌；清药理学；MTT；一氧化氮
中国微循环000305
【摘要】 目的 观察益气通络丹(YQTLD)含药血清对培养SD大鼠胸主动脉平滑肌细胞(VSMC)的影响，探讨该药临床抗冠心病、脑梗塞等心脑血管疾病的作用机制。方法 血清药理学方法制备含药血清：MTT法测定含药血清对VSMC增殖活性的影响；NO试剂盒测定含药血清对VSMC作用与NO的关系。结果 YQTLD含药血清能显著降低培养的SD大鼠VSMC MTT法的OD值，与空白血清组有显著性差异(P<0.01)；YQTLD含药血清组培养基中NO含量明显增多，与空白血清组有显著性差异(P<0.01)。结论 YQTLD有抗VSMC增殖的作用，此作用可能与NO有关，YQTLD可能通过抗VSMC增殖活性，促进NO释放在临床治疗上发挥作用。
, 百拇医药
Effect of YQTLD on Rat's VSMC Using Serologic Pharmacological Test
Huang Weiyi,Chen Suyun,Qiu Xingsheng,et al.
(General Hospital of Guangzhou Unit,PLA，Guangzhou,510010)
【Abstract】Objective. To observe the effect of serum containing YQTLD on SD rat's culture VSMC.Methods Serum containing YQTLD was prepared by serum pharmacological method. VSMC culture was treated with the serum, the influence of YQTLD on proliferating activity of VSMC was determined by MTT test. The amount of NO tested by NO test kit. Results 1.Serum containing YQTLD could decrease the OD value of VSMC tested by MTT method, and there was singificant difference (P<0.01) compared with the control serum ;2.The amount of NO in the culture medium of serum containing YQTLD which could inhibit proliferation of VSMC increased remarkably, and there was significant difference(P<0.01) compared with the control serum. Conclusions 1.YQTLD could inhibit the proliferation of VSMC. 2.The mechanism might relate to the increasing of NO in the culture medium. 3. The mechanism of YQTLD’s effect on vascular disease, such as coronary heart disease, cerebral thrombosis might be in relation to the influence of inhibiting proliferation on VSMC.
, 百拇医药
【Key words】YQTLD Vascular smooth muscle cell Serum pharmacology MTT Nitric oxide
YQTLD是陈素云教授的经验方，临床上对冠心病、脑血栓等心脑血管疾病具有良好的疗效。本实验从抗VSMC增殖方面对其疗效机理作了探讨，报告如下。
材料与方法
1 材料
1.1 药物：
YQTLD药液：YQTLD由黄芪15g、赤芍20g、红花3g、川芎10g、地龙6g等组成(药材由广州药材公司提供)，按组方配制混合，煮取浓缩调节浓度至1.6g/ml(大剂量)、0.8g/ml(小剂量，按生药量大鼠与成人体表面积比换算)。
, http://www.100md.com 开博通药液(批号9707032)将药研成细末，用单蒸水配制，按大鼠与成人体表面积比换算，配成0.338g/ml。
1.2 动物：SD大鼠，体重160～220g，由第一军医大学动物研究所提供。
1.3 主要试剂：
DMEM粉(美国 Gibco公司)、 Hepes(德国 Boeringer mannheim公司)胎牛血清(杭州四季青)、MTT液(美国Sigma公司)、NO试剂盒(军事医学科学院放射医学研究所，A试剂：磺胺；B试剂：荼乙烯二胺盐酸盐；C试剂：硫酸锌；D试剂：氢氧化钠；E试剂：亚硝酸钠)、胰蛋白酶(英国Advanced技术工业公司)
1.4 主要仪器
CO2电热恒温培养箱(Heraeuse 公司)、超净工作台(Heraeuse公司)
, 百拇医药
倒置显微镜(日本OLYMPUS)、电子天平(美国SARTORIUS公司)、微量加样品(上海产)、细胞刮子(美国密理博公司)、不锈钢滤器(上海产)、∑960自动酶标仪(日本产)、UV-754紫外光分光光度计(上海产)
2 方法
2.1 含药血清的制备：
SD大鼠40只随机分为四组，每组10只。大剂量组：每日灌1.6g/ml的YQTLD药液；小剂量组：每日灌0.8g/ml的YQTLD药液；空白组：每日灌0.9%的生理盐水；西药组：每日灌0.338g/ml开博通药液。按文献方法[1]制备血清，56℃灭活30min，-20℃冰箱保存备用。
2.2 细胞培养及鉴定：细胞培养：取SD大鼠的胸主动脉血管平滑肌，按传统的组织贴块法培养。用0.1%胰蛋白酶和0.02%EDTA消化传代。本实验用5～8代细胞。
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鉴定：相差显微镜观察：细胞呈梭形或长梭形，可重叠生长达多层，高低起伏，呈典型的“峰与谷”样生长，用抗肌动蛋白α-actin的单抗通过免疫化学方法鉴定平滑肌细胞的特异性肌动蛋白。
3 MTT法测定含药血清对平滑肌增殖的影响
3.1 同一浓度含药血清对VSMC增殖的影响：
分为四组：小剂量组、大剂量组、开博通组、空白组：各组在原培养基中加相应的含药血清。各组含药血清的终浓度均为5%，作用时间均为24h。
3.2 不同浓度的YQTLD含药血清对VSMC增殖的影响
分为六组：各组在原培养基中加大剂量组YQTLD含药血清，使其终浓度分别为1组：25%；2组：5%；3组：1%；4组：0.20%；5组：0.04%；6组：空白血清组。作用时间为24h。
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3.3 MTT法实验操作：
3.3.1 细胞传代时，均匀接种至96孔板，每孔培养基总量200ul，按上述分组加入处理因素37℃、5%CO2培养24h后，加入MTT液(20ul/孔)，继续培养4h。
3.3.2 吸出孔内培养基后，加入二甲亚砜(DMSO)，室温下振荡10min，使结晶溶解。
3.3.3 ∑960自动酶标仪测定各孔OD值(λ=560nm)。记录结果，统计分析。
4 NO试剂盒测定含药血清抗VSMC增殖与NO的关系
4.1 含药血清对VSNC的NO释放的影响
分为四组：1组：大剂量组YQTLD含药血清；2组：小剂量组YQTLD含药血清；3组：开博通含药血清；4组：空白血清，各组分别在原培养基中加入响应的含药血清，终浓度均为5%，作用时间均为24h。
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4.2 NO含量的测定：
细胞传代时，均匀接种至96孔板，每孔培养基总量200ul,按上述分组每组6瓶，37℃、5%CO2培养至相应时间，用军事科学院放射医学研究所NO试剂盒测试，按试剂盒操作步骤操作，用紫外光分光光度计在波长λ=545nm比色，读OD值。制作标准曲线，按测定说明书进行，得曲线方程：y=0.92+1117.8x,根据样品OD值计算NO含量并记录结果。
5 统计方法：采用SPSS软件进行方差分析，P<0.05有显著性意义。
结 果
1 含药血清对VSMC增殖活性的影响见表1。
表1 四组含药血清对VSMC增殖活性的影响(
±s), 百拇医药
分组
OD值
小剂量组
0.285±0.0712
大剂量组
0.205±0.0481*＃
开博通组
0.207±0.0319*＃
空白组
0.250±0.0660
注：*与空白组比较： P<0.01，＃与小剂量组比较： P<0.01(n=6)
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2 不同浓度的YQTLD含药血清对VSMC增殖活性的影响见表2。
表2 不同浓度含药血清对VSMC增殖活性的影响(
±s)分组
OD值
25%组
0.072±0.215*
5%组
0.429±0.0384*＃
1%组
0.7175±0.111
, 百拇医药
0.2%组
0.781±0.1826
0.4%组
0.746±0.1311
空白组
0.64±0.241
注：*与空白组比较： P<0.01，＃与5%组比较： P<0.01(n=6)
3 各组含药血清作用时培养基中NO含量的情况见表3。
表3 各组含药血清作用时培养基中NO含量的情况(
±s), http://www.100md.com
分组
NO含量(umol/L)
小剂量组
5.675±0.975*＃
大剂量组
3.025±0.963
开博组
5.337±1.095*＃
空白组
3.163±1.216
注：*与空白组比较： P<0.01，＃与小剂量YQTLD组比较： P<0.01(n=8)
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讨论
YQTLD是补阳还五汤的化裁方，具有益气活血，补肾通络，化痰止痛的功效。以往的动物实验研究表明：其临床疗效可能与该药降低血浆中脂质过氧化物形成，提高T-SOD、CU-Zn-SOD活性，促进血浆中NO释放增多，改善缺血后血流灌注，降低血液粘滞度，抗血小板聚集等多种作用有关[2,3]。
血清药理学是近年来提出的一种针对中药复方研究的新的药理学方法，尤其在体外实验中考虑了体内代谢的因素，排除了中药粗制剂杂质的影响，因此，为中药复方的研究提供了新的思路[4]。
已经证实：VSMC的增殖与冠心病、脑血栓以及高血压的主要病理基础密切相关。因此，寻找抑制VSMC生长的因素和途径，延缓AS的发生、发展将是当今心血管病学研究的重要课题[5]。
本实验结果显示：大剂量组YQTLD与开搏通含药血清组有明显降低作用细胞中的OD值，而小剂量与空白组无显著性差异。大剂量组YQTLD含药血清作用有随浓度递增而增强趋势。这表明益气通络丹含药血清中可能含有某种直接或间接可抑制VSMC增殖的活性物质，该物质是益气通络丹经过体内复杂的代谢过程产生的，其具体有效成分有待进一步实验研究。
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NO对多种病理因素引起的SMC增殖均有明显的抑制作用[7]，是抗心脑血管疾病的因子。本实验结果显示：大剂量YQTLD含药血清及开搏通含药血清组培养基内的NO含量显著增多，且两者之间无显著性差异(P>0.05)。两者与小剂量YQTLD含药血清组及空白组有显著性差异(P<0.05), 而小剂量YQTLD含药血清组与空白组之间无显著性差异。这表明：益气通络丹含药血清和开搏通含药血清对VSMC增殖活性的抑制作用与NO含量的增多有关，这与近年有关开搏通的文献研究相符[6]。因此，YQTLD可能通过抑制VSMC增殖活性、促进NO的释放，在冠心病、脑血栓等心脑血管疾病中发挥治疗和保护作用。
致谢：在本文的写作过程中得到广州军区总医院中医科沈鹰主任的审校和指导，特此感谢。
参考文献
1，王伟.精制血府胶囊刺激缺氧缺糖心肌细胞RNA及蛋白质合成的研究.北京中医药大学学报.1997，20(2)：17
, 百拇医药
2，沈剑刚，陈素云，郭志刚.益气通络丹对心肌缺血再灌注损伤脂质过氧化及纤溶活性的影响.中国病理生理杂志.1996；12(2)：130
3，徐文学，陈素云.益气通络丹对应激诱发大鼠血小板聚集性血浆血栓素B2和6-酮-前列腺素F1a变化的影响.中国病理生理杂志.1995,11(3):321
4，崔晓兰.中药药理研究的新思路-中药血清药理学.中国中医药科技.1997，4(4)：239
5，黄伟毅，陈素云，邱辛生.抗动脉粥样硬化的中医药研究进展.中医药研究.1998,14(5):58
6，Uchara Y, Unmabc A, Kawabata Y，et al. Inhibition of protein synthesis and antiproliferative effect of the angitotersin converting enzyme inhibitor trandolaprilat in rat vascular smooth muscle cells. J hypertens.1993,13:1073
, 百拇医药
7，Scott-Burden T, Vanhoutte PM. The endothelium as a regulator of vascular smooth muscle proliferation. Circulation.1993,87(supplv):51
(收稿：1999-08-30
修回：1999-12-17)
中国微生态学杂志 2000年第4期第12卷 临床研究
引起腹泻念珠菌耐药状况分析
作者：王明丽 潘亚萍
单位：王明丽(浙江省肿瘤医院，310022)；潘亚萍(杭州市红会医院)
关键词：, 百拇医药