α-蒎烯对白色念珠菌生物合成的影响
夏忠弟 余俊龙
用同位素掺入试验研究α-蒎烯对白色念珠菌生物合成的影响。结果发现：α-蒎烯能明显地抑制TdR,UR,亮氨酸和NaAc 4种标记前体的掺入。提示α-蒎烯对白色念珠菌的生物合成有显著的抑制作用，其抗菌机制为通过抑制白色念珠菌细胞膜中麦角固醇、胞壁中几丁质、多糖的合成及抑制核酸DNA、RNA的合成，从而起到杀菌作用。
关键词：α-蒎烯、白色念珠菌、生物合成、同位素标记
本研究采用同位素标记技术，从分子水平探讨α-蒎烯对白色念珠菌生物合成的影响，以阐明α-蒎烯抗真菌的作用机制，为α-蒎烯进一步药用开发及作为食品防腐防霉剂提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料
, 百拇医药
试剂：α-蒎烯由湖南省粮油研究所提供；菌种：白色念珠菌(ID16U)由中国医学科学院真菌保存中心提供；同位素：DL-(4，5-3H)亮氨酸(1mCi/ml，放射比强度：19Ci/mmol)，(methyl-3H) TdR(1mCi/ml,放射比强度：40.5Ci/mmol)，(5-3H) UR(0.9mCi/ml，放射比强度：22.6Ci/mmol)，(14C-NaAc) (2.0mCi/ml，放射比强度：65Ci/mmol)。以上同位素均由中国科学院上海核技术开发公司提供。
1.2 方法
以DL-(4，5-3H)亮氨酸，(methy1-3H)TdR,(5-3H) UR和(14C-NaAc)分别作掺入前体进行同位素掺入试验[1，2]，以观察α-蒎烯对白色念珠菌胞壁中几丁质、多糖及胞膜中麦角固醇、核酸DNA和RNA合成的影响。同位素标记前体最终浓度为3μCi。取1/2 MIC，MIC和2MIC的α-蒎烯分别作用于对数生长期的白色念珠菌，同时用生理盐水作对照，置28℃振荡培养30min，然后取各样品1ml，分别加入10%三氯醋酸5ml中作用30min，再通过whatman玻璃纤维滤纸过滤，用5%三氯醋酸10ml和蒸馏水10ml各洗3次，滤纸片于37℃烘干后置闪烁液中用Beckmon LS 3001液体闪烁计数器检测每分钟计数值(cpm)。计数实验组与对照组的cpm，再求出掺入抑制率[3]。
, 百拇医药
2 结果
1/2MIC，MIC和2MIC 3种不同浓度的α-蒎烯对白色念珠菌作用后，可见白色念珠菌对TdR、UR、亮氨酸及NaAc 4种标记前体的掺入均有明显的抑制作用，掺入抑制率均高，且其掺入抑制率与α-蒎烯的浓度成正相关(附表)
附表 α-蒎烯对白色念珠菌4种同位素标记前体的掺入抑制率(X±s，n=10)
α-蒎烯浓度
掺入抑制率(%)
TdR
UR
亮氨酸
NaAc
, http://www.100md.com
1/2MIC
38.45±2.83
40.36±3.88
39.17±3.64
74.08±4.80
MIC
46.42±3.62
54.16±4.02
50.68±6.02
80.47±4.63
2MIC
62.06±4.66
, http://www.100md.com
78.28±5.78
58.24±3.86
89.36±5.85
3 讨论 本试验显示，α-蒎烯能明显地抑制4种标记前体对白色念珠菌菌种的掺入，且掺入抑制率均高，证明4种标记前体的摄入同时受到抑制，尤其以UR和NaAc的摄入受阻更为明显。
真菌属真核细胞型微生物，结构较复杂[4]，最外层是细胞壁，它在维持真菌形态及胞内高渗状态起着极为重要的作用；细胞膜主要功能是物质转运与营养，呼吸及生物合成作用；核酸是真菌繁殖、遗传变异的物质基础，对真菌的生物合成起着极为重要的作用。真菌结构的化学组成也极为复杂，胞壁中主要成份为几丁质、葡萄糖和甘露聚糖，胞膜中的化学组成主要为麦角固醇，核酸主要为DNA，少量RNA，一旦这些成份合成被抑制，亦可导致菌细胞的死亡[5,6]。α-蒎烯明显地抑制了4种标记前体对白色念珠菌菌体的掺入，表明α-蒎烯对白色念珠菌胞壁中几丁质、多糖成份的合成，对胞膜中麦角固醇的合成及对核酸DNA和RNA的合成均有明显的抑制作用，其中抑制麦角固醇的合成更为明显。由此推测，α-蒎烯是通过抑制白色念珠菌胞壁中的几丁质、多糖及胞膜上麦角固醇和核酸DNA及RNA的生物合成而杀菌。■
, http://www.100md.com
作者单位：夏忠弟(湖南医科大学微生物学教研室 长沙 410078)
余俊龙(湖南医科大学微生物学教研室 长沙 410078)
参考文献：
[1]Benbrook DM,Miller RV.Effects of norfloxacin on DNA metabolism in pseudomonas aeruginosa.Antimicrob Agents Chemother,1986;29(1):1～6
[2]Tanaka H,Kawakita K,Suzuki H,et al.The mode of action of cervinomcycin in staphylococcus aureus.J Antibiot,1989;(3):431～439
, 百拇医药
[3]李沛涛，周 坚，查国章，等.山苍子油乳剂的抗菌机制研究.湖南医科大学学报，1994；19(6)：471～474
[4]Kuhn PJ,Trinic APJ,Jung MJ,et al.Biochemistry of cell walls and membranes in fugi.Germany,Berlin Heldberg:Spring Verlag,1997:61～63
[5]Georgopapadakou NH,Bertasso A.Effects of squalene epoxidase inhibitors on Candida albicans.Antimicrob Agents Chemoth,1992;36(8):1779～1781
[6]Calderone RA,Braun PC.Adherence and receptor relationships of Candida albicans.Microbiol Rev,1991;55(1):1～20, 百拇医药
用同位素掺入试验研究α-蒎烯对白色念珠菌生物合成的影响。结果发现：α-蒎烯能明显地抑制TdR,UR,亮氨酸和NaAc 4种标记前体的掺入。提示α-蒎烯对白色念珠菌的生物合成有显著的抑制作用，其抗菌机制为通过抑制白色念珠菌细胞膜中麦角固醇、胞壁中几丁质、多糖的合成及抑制核酸DNA、RNA的合成，从而起到杀菌作用。
关键词：α-蒎烯、白色念珠菌、生物合成、同位素标记
本研究采用同位素标记技术，从分子水平探讨α-蒎烯对白色念珠菌生物合成的影响，以阐明α-蒎烯抗真菌的作用机制，为α-蒎烯进一步药用开发及作为食品防腐防霉剂提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料
, 百拇医药
试剂：α-蒎烯由湖南省粮油研究所提供；菌种：白色念珠菌(ID16U)由中国医学科学院真菌保存中心提供；同位素：DL-(4，5-3H)亮氨酸(1mCi/ml，放射比强度：19Ci/mmol)，(methyl-3H) TdR(1mCi/ml,放射比强度：40.5Ci/mmol)，(5-3H) UR(0.9mCi/ml，放射比强度：22.6Ci/mmol)，(14C-NaAc) (2.0mCi/ml，放射比强度：65Ci/mmol)。以上同位素均由中国科学院上海核技术开发公司提供。
1.2 方法
以DL-(4，5-3H)亮氨酸，(methy1-3H)TdR,(5-3H) UR和(14C-NaAc)分别作掺入前体进行同位素掺入试验[1，2]，以观察α-蒎烯对白色念珠菌胞壁中几丁质、多糖及胞膜中麦角固醇、核酸DNA和RNA合成的影响。同位素标记前体最终浓度为3μCi。取1/2 MIC，MIC和2MIC的α-蒎烯分别作用于对数生长期的白色念珠菌，同时用生理盐水作对照，置28℃振荡培养30min，然后取各样品1ml，分别加入10%三氯醋酸5ml中作用30min，再通过whatman玻璃纤维滤纸过滤，用5%三氯醋酸10ml和蒸馏水10ml各洗3次，滤纸片于37℃烘干后置闪烁液中用Beckmon LS 3001液体闪烁计数器检测每分钟计数值(cpm)。计数实验组与对照组的cpm，再求出掺入抑制率[3]。
, 百拇医药
2 结果
1/2MIC，MIC和2MIC 3种不同浓度的α-蒎烯对白色念珠菌作用后，可见白色念珠菌对TdR、UR、亮氨酸及NaAc 4种标记前体的掺入均有明显的抑制作用，掺入抑制率均高，且其掺入抑制率与α-蒎烯的浓度成正相关(附表)
附表 α-蒎烯对白色念珠菌4种同位素标记前体的掺入抑制率(X±s，n=10)
α-蒎烯浓度
掺入抑制率(%)
TdR
UR
亮氨酸
NaAc
, http://www.100md.com
1/2MIC
38.45±2.83
40.36±3.88
39.17±3.64
74.08±4.80
MIC
46.42±3.62
54.16±4.02
50.68±6.02
80.47±4.63
2MIC
62.06±4.66
, http://www.100md.com
78.28±5.78
58.24±3.86
89.36±5.85
3 讨论 本试验显示，α-蒎烯能明显地抑制4种标记前体对白色念珠菌菌种的掺入，且掺入抑制率均高，证明4种标记前体的摄入同时受到抑制，尤其以UR和NaAc的摄入受阻更为明显。
真菌属真核细胞型微生物，结构较复杂[4]，最外层是细胞壁，它在维持真菌形态及胞内高渗状态起着极为重要的作用；细胞膜主要功能是物质转运与营养，呼吸及生物合成作用；核酸是真菌繁殖、遗传变异的物质基础，对真菌的生物合成起着极为重要的作用。真菌结构的化学组成也极为复杂，胞壁中主要成份为几丁质、葡萄糖和甘露聚糖，胞膜中的化学组成主要为麦角固醇，核酸主要为DNA，少量RNA，一旦这些成份合成被抑制，亦可导致菌细胞的死亡[5,6]。α-蒎烯明显地抑制了4种标记前体对白色念珠菌菌体的掺入，表明α-蒎烯对白色念珠菌胞壁中几丁质、多糖成份的合成，对胞膜中麦角固醇的合成及对核酸DNA和RNA的合成均有明显的抑制作用，其中抑制麦角固醇的合成更为明显。由此推测，α-蒎烯是通过抑制白色念珠菌胞壁中的几丁质、多糖及胞膜上麦角固醇和核酸DNA及RNA的生物合成而杀菌。■
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作者单位：夏忠弟(湖南医科大学微生物学教研室 长沙 410078)
余俊龙(湖南医科大学微生物学教研室 长沙 410078)
参考文献：
[1]Benbrook DM,Miller RV.Effects of norfloxacin on DNA metabolism in pseudomonas aeruginosa.Antimicrob Agents Chemother,1986;29(1):1～6
[2]Tanaka H,Kawakita K,Suzuki H,et al.The mode of action of cervinomcycin in staphylococcus aureus.J Antibiot,1989;(3):431～439
, 百拇医药
[3]李沛涛，周 坚，查国章，等.山苍子油乳剂的抗菌机制研究.湖南医科大学学报，1994；19(6)：471～474
[4]Kuhn PJ,Trinic APJ,Jung MJ,et al.Biochemistry of cell walls and membranes in fugi.Germany,Berlin Heldberg:Spring Verlag,1997:61～63
[5]Georgopapadakou NH,Bertasso A.Effects of squalene epoxidase inhibitors on Candida albicans.Antimicrob Agents Chemoth,1992;36(8):1779～1781
[6]Calderone RA,Braun PC.Adherence and receptor relationships of Candida albicans.Microbiol Rev,1991;55(1):1～20, 百拇医药