MK-801对大鼠感染性脑水肿的保护作用及机制探讨
机制探讨
尹飞 杨于嘉 虞佩兰 毛定安 陶永光
目的：了解MK-801对大鼠感染性脑水肿是否具有保护作用及可能的作用机制。方法：ELISA法与Griess法分别测大鼠感染性脑水肿模型脑组织匀浆中IL-1β、TNFα和NO含量。结果：MK-801预处理后能显著降低PB组大鼠的脑含水量、钠离子含量、IL-1β、TNFα及NO含量，增加钾离子含量。结论：MK-801对大鼠感染性脑水肿有保护作用。其作用机制可能是通过阻断NMDA受体后，减少IL-1β、TNFα及NO的生成量。
关键词：脑水肿 MK-801 细胞因子 神经保护
近年的研究表明，兴奋性氨基酸(EAA)的离子型受体在EAA所致的神经毒性作用中有极其重要的意义，尤其是N-甲基-D门冬氨酸受体(NMDA)与缺血或创伤性脑损伤关系密切[1～2]，同时作为重要的炎症前因子，IL-1β、TNFα也参与了脑损伤过程。在缺血性脑损伤时，其脑组织中有高水平IL-1β、TNFα mRNA的表达[3]。但在感染性脑水肿时细胞因子、一氧化氮(NO)的变化及它们与NMDA受体的关系研究较少。本文运用NMDA受体非竞争性拮抗剂MK-801阻断NMDA受体后，了解对大鼠感染性脑水肿是否具有保护作用以及可能的作用机制。
, 百拇医药
1 材料与方法
1.1 实验动物及分组
SD大鼠23只，雌雄不拘，体重210g左右。随机分成3组：生理盐水对照组(NS组n=8)；百日咳菌液模型组(PN n=7)；MK-801预处理百日咳菌液模型组(MK组n=8)。
1.2 模型制作
大鼠颈正中切口，分离左颈总动脉，颈外动脉，颈内动脉及分支，结扎翼腭动脉和枕动脉。夹闭颈外动脉后，用1ml注射器4.5＃针头于左颈总动脉穿刺向左颈内动脉注射百日咳菌液0.2ml/kg(含菌10.8×109/ml)，15s内注射完毕。NS组则用同法注射等量的无菌生理盐水。MK组在注百日咳菌液前48h每天腹腔注射MK-801 0.5mg/kg，连续2d。各组大鼠注菌或生理盐水 4h后断头处死。
, 百拇医药
1.3 脑含水量、Na+、K+含量测定
干湿法测定大鼠左大脑半球脑含水量；原子吸分光光度仪测相应干脑组织的Na+、K+含量(mmol/kg，干脑组织)。
1.4 大鼠脑组织匀浆制备
注菌液或生理盐水后4h大鼠断头处死，取出左侧大脑半球中部部分全层脑组织，称湿重后，按V/V为10∶1加入0.1MPBS，恒速匀浆，取匀浆液置离心管中，4℃15 00 r/min离心20min，收集上清液，-70℃保存待测。
1.5 IL-1β、TNFα及NO含量测定
ELISA法测大鼠脑组织匀浆中IL-1β、TNFα含量(pg/g脑组织)，Griess法测脑匀浆中NO含量(nmol/g脑组织)。
, 百拇医药
1.6 统计学处理
数据均采用Excel 5.0软件计算，计量数据均用x±s表示，组间比较用F检验。
2 结果
2.1 MK-801预处理对大鼠脑含水量及钠钾离子的影响
结果显示MK-801预处理后能显著降低百日咳菌液脑水肿大鼠的脑含水量及钠离子的含量，增加钾离子含量。表示MK-801预处理对大鼠感染性脑水肿有保护作用。详见表1。
表1 MK-801预处理后脑含水量和钠钾离子变化(x±s)
分组
动物数
, 百拇医药 脑含水量(%)
Na+(nmol/kg)
K+(nmol/kg)
NS
8
78.6±0.3
194.3±7.1
446.7±11.1
PB
7
82.2±0.31)
277.1±18.61)
, 百拇医药
358.4±25.11)
MPB
8
79.3±0.53)
205.9±29.73)
495.8±49.91)2)
注：与NS比较1)P<0.01
2)与NS比较P<0.05
3)与PB比较P<0.012.2 MK-801预处理后对细胞因子和NO含量的影响
经MK-801预处理后可显著降低PB组IL-1β、TNFα及NO含量(P<0.01)，表明阻断NMDA受体后，可减少IL-1β、TNFα及NO的生成量。见表2。
, 百拇医药
表2 MK-801预处理后大鼠脑组织IL-1β、TNFα及NO含量(x±s)
分组
IL-1β(pg/g)
TNFα(pg/g)
NO(nmol/g)
NS
242.0±67.1
334.0±76.5
72.9±8.0
PB
384.1±37.71)
, 百拇医药
762.2±84.91)
106.0±13.81)
MPB
303.3±41.82)3)
475.9±128.52)3)
82.0±5.72)3)
注：1)与NS组比较1)P<0.01
2)与NS组比较P<0.05
3)与PB组比较P<0.013 讨论
, 百拇医药
感染性脑水肿是内儿科最常见的危急重症之一，其发病机制十分复杂。内源性兴奋性氨基酸、细胞因子和NO对脑损伤的作用已为大家所公认[4～5]。本科业已证明大鼠百日咳菌液脑水肿脑组织中NMDA受体活性上调，突触体钙离子显著增高，表明感染性脑水肿与NMDA受体关系密切[6]，说明了EAA参与了感染性脑损伤的过程。本研究发现注菌后4 h大鼠脑含水量、Na+含量增加，K+含量降低，表明已成功的建立了大鼠感染性脑水肿模型。同时脑组织中IL-1β、TNFα及NO的含量增加，与相应NS对照组比较差异有极显著性(P<0.01)。提示它们与感染性脑水肿关系密切，上述因子的大量生成可能加重感染性脑损伤。
有研究结果表明，脑组织受到EAA的神经毒性作用时，IL-1β、TNFα mRNA的表达明显增强[7，8]。将NMDA注入大鼠脑组织内，神经细胞出现兴奋性毒性的同时，其IL-1β、TNFα mRNA的表达明显增高[9]。使用IL-1ra可明显减轻缺血性脑损害和EAA所导致的神经细胞兴奋性毒性作用[10]。显示NMDA受体激活后可促进IL-1β、TNFα生成，IL-1β、TNFα受体介导EAA的神经传递，而且当NO大量产生时，细胞内钙超载时，NO还介导着EAA的神经毒性作用。但在感染性脑水肿时，IL-1β、TNFα和NO的变化及它们与NMDA关系不清楚。未见类似报道。
, 百拇医药
本研究将大鼠经MK-801预处理后再制成感染性脑水肿模型，与未作预处理的大鼠感染性脑水肿模型比较，发现经预处理后的大鼠感染性脑水肿模型脑组织的IL-1β、TNFα及NO的含量明显下降，同时脑含水量，Na+含量降低，K+含量增加，与未作预处理的大鼠模型组比较，差异有极显著性(P<0.01)。说明MK-801阻断NMDA受体后，可减少IL-1β、TNFα及NO的生成量。对大鼠感染性脑水肿有保护作用。其保护机制可能是通过阻断NMDA受体后，减少IL-1β、TNFα及NO的生成量。提示IL-1β、TNFα及NO的大量生成可加重EAA的神经毒性作用，为我们防治感染性脑水肿提供了一种新的思路。
作者单位：尹飞(湖南医科大学附属湘雅医院儿科 长沙 410008)
杨于嘉(湖南医科大学附属湘雅医院儿科 长沙 410008)
虞佩兰(湖南医科大学附属湘雅医院儿科 长沙 410008)
, http://www.100md.com
毛定安(湖南医科大学附属湘雅医院儿科 长沙 410008)
陶永光(湖南医科大学附属湘雅医院儿科 长沙 410008)
参考文献：
[1]Faden AI,Demediuk P,Panter SS, et al.The role of excitatory amino acids and NMDA receptors in traumatic brain injury.Science, 1989;244:798～800
[2]江 涛，戴钦舜，刘恩重，等.脑缺血-再灌注损伤中兴奋性氨基酸的变化.中华神经外科杂志，1997；13：219～221
[3]Liu T,Mc Donnell PC, Young PR, et al.Interleukin-1 mRNA expression in ischemic rat cortex.Stroke, 1993;24:1746～1751
, 百拇医药
[4]Merrill JE, Benveniste EN.Cytokines in inflammatory brain lesions:helpful and harmful.Trends Neurosci, 1996;19:331～338
[5]Iadecola C.Bright and dark sides of nitric oxide in ischemic brain injury.Trends Neurosci, 1997;20:132～139
[6]陈 翔，杨于嘉，陈立华，等.N-甲基-D-天门冬氨酸受体及其调控的钙内流在大鼠感染性脑损伤中的变化.中华儿科杂志，1997；35：539～541
[7]Minami M,Kuraishi Y,Yamaguchi T, et al.Convulsants induce interleukin-1 beta mRNA in rat brain.Biochem Biophys Res Commun， 1990;171:832～837
, 百拇医药
[8]Minami M,Kuraishi Y,Satoh M.Effects of kainic acid on mRNA levels of IL-1β.IL-6.TNF α and LIF in the rat brain.Biochem biophys Res Commun，1991;176:593～598
[9]Szaflarski J,Burtrum D,Silverstein FS.Cerebral hypoxia-ischemia stimulates cytokine gene expression in perinatal rats.Stroke, 1995;26:1093～1100
[10]Relton JK, Pothwell NJ.Interleukin-1 receptor antagonist inhibits ischaemic and excitotoxic neuronal damage in the rat.Brain Res Bull，1992;29:243～346, 百拇医药
尹飞 杨于嘉 虞佩兰 毛定安 陶永光
目的：了解MK-801对大鼠感染性脑水肿是否具有保护作用及可能的作用机制。方法：ELISA法与Griess法分别测大鼠感染性脑水肿模型脑组织匀浆中IL-1β、TNFα和NO含量。结果：MK-801预处理后能显著降低PB组大鼠的脑含水量、钠离子含量、IL-1β、TNFα及NO含量，增加钾离子含量。结论：MK-801对大鼠感染性脑水肿有保护作用。其作用机制可能是通过阻断NMDA受体后，减少IL-1β、TNFα及NO的生成量。
关键词：脑水肿 MK-801 细胞因子 神经保护
近年的研究表明，兴奋性氨基酸(EAA)的离子型受体在EAA所致的神经毒性作用中有极其重要的意义，尤其是N-甲基-D门冬氨酸受体(NMDA)与缺血或创伤性脑损伤关系密切[1～2]，同时作为重要的炎症前因子，IL-1β、TNFα也参与了脑损伤过程。在缺血性脑损伤时，其脑组织中有高水平IL-1β、TNFα mRNA的表达[3]。但在感染性脑水肿时细胞因子、一氧化氮(NO)的变化及它们与NMDA受体的关系研究较少。本文运用NMDA受体非竞争性拮抗剂MK-801阻断NMDA受体后，了解对大鼠感染性脑水肿是否具有保护作用以及可能的作用机制。
, 百拇医药
1 材料与方法
1.1 实验动物及分组
SD大鼠23只，雌雄不拘，体重210g左右。随机分成3组：生理盐水对照组(NS组n=8)；百日咳菌液模型组(PN n=7)；MK-801预处理百日咳菌液模型组(MK组n=8)。
1.2 模型制作
大鼠颈正中切口，分离左颈总动脉，颈外动脉，颈内动脉及分支，结扎翼腭动脉和枕动脉。夹闭颈外动脉后，用1ml注射器4.5＃针头于左颈总动脉穿刺向左颈内动脉注射百日咳菌液0.2ml/kg(含菌10.8×109/ml)，15s内注射完毕。NS组则用同法注射等量的无菌生理盐水。MK组在注百日咳菌液前48h每天腹腔注射MK-801 0.5mg/kg，连续2d。各组大鼠注菌或生理盐水 4h后断头处死。
, 百拇医药
1.3 脑含水量、Na+、K+含量测定
干湿法测定大鼠左大脑半球脑含水量；原子吸分光光度仪测相应干脑组织的Na+、K+含量(mmol/kg，干脑组织)。
1.4 大鼠脑组织匀浆制备
注菌液或生理盐水后4h大鼠断头处死，取出左侧大脑半球中部部分全层脑组织，称湿重后，按V/V为10∶1加入0.1MPBS，恒速匀浆，取匀浆液置离心管中，4℃15 00 r/min离心20min，收集上清液，-70℃保存待测。
1.5 IL-1β、TNFα及NO含量测定
ELISA法测大鼠脑组织匀浆中IL-1β、TNFα含量(pg/g脑组织)，Griess法测脑匀浆中NO含量(nmol/g脑组织)。
, 百拇医药
1.6 统计学处理
数据均采用Excel 5.0软件计算，计量数据均用x±s表示，组间比较用F检验。
2 结果
2.1 MK-801预处理对大鼠脑含水量及钠钾离子的影响
结果显示MK-801预处理后能显著降低百日咳菌液脑水肿大鼠的脑含水量及钠离子的含量，增加钾离子含量。表示MK-801预处理对大鼠感染性脑水肿有保护作用。详见表1。
表1 MK-801预处理后脑含水量和钠钾离子变化(x±s)
分组
动物数
, 百拇医药 脑含水量(%)
Na+(nmol/kg)
K+(nmol/kg)
NS
8
78.6±0.3
194.3±7.1
446.7±11.1
PB
7
82.2±0.31)
277.1±18.61)
, 百拇医药
358.4±25.11)
MPB
8
79.3±0.53)
205.9±29.73)
495.8±49.91)2)
注：与NS比较1)P<0.01
2)与NS比较P<0.05
3)与PB比较P<0.012.2 MK-801预处理后对细胞因子和NO含量的影响
经MK-801预处理后可显著降低PB组IL-1β、TNFα及NO含量(P<0.01)，表明阻断NMDA受体后，可减少IL-1β、TNFα及NO的生成量。见表2。
, 百拇医药
表2 MK-801预处理后大鼠脑组织IL-1β、TNFα及NO含量(x±s)
分组
IL-1β(pg/g)
TNFα(pg/g)
NO(nmol/g)
NS
242.0±67.1
334.0±76.5
72.9±8.0
PB
384.1±37.71)
, 百拇医药
762.2±84.91)
106.0±13.81)
MPB
303.3±41.82)3)
475.9±128.52)3)
82.0±5.72)3)
注：1)与NS组比较1)P<0.01
2)与NS组比较P<0.05
3)与PB组比较P<0.013 讨论
, 百拇医药
感染性脑水肿是内儿科最常见的危急重症之一，其发病机制十分复杂。内源性兴奋性氨基酸、细胞因子和NO对脑损伤的作用已为大家所公认[4～5]。本科业已证明大鼠百日咳菌液脑水肿脑组织中NMDA受体活性上调，突触体钙离子显著增高，表明感染性脑水肿与NMDA受体关系密切[6]，说明了EAA参与了感染性脑损伤的过程。本研究发现注菌后4 h大鼠脑含水量、Na+含量增加，K+含量降低，表明已成功的建立了大鼠感染性脑水肿模型。同时脑组织中IL-1β、TNFα及NO的含量增加，与相应NS对照组比较差异有极显著性(P<0.01)。提示它们与感染性脑水肿关系密切，上述因子的大量生成可能加重感染性脑损伤。
有研究结果表明，脑组织受到EAA的神经毒性作用时，IL-1β、TNFα mRNA的表达明显增强[7，8]。将NMDA注入大鼠脑组织内，神经细胞出现兴奋性毒性的同时，其IL-1β、TNFα mRNA的表达明显增高[9]。使用IL-1ra可明显减轻缺血性脑损害和EAA所导致的神经细胞兴奋性毒性作用[10]。显示NMDA受体激活后可促进IL-1β、TNFα生成，IL-1β、TNFα受体介导EAA的神经传递，而且当NO大量产生时，细胞内钙超载时，NO还介导着EAA的神经毒性作用。但在感染性脑水肿时，IL-1β、TNFα和NO的变化及它们与NMDA关系不清楚。未见类似报道。
, 百拇医药
本研究将大鼠经MK-801预处理后再制成感染性脑水肿模型，与未作预处理的大鼠感染性脑水肿模型比较，发现经预处理后的大鼠感染性脑水肿模型脑组织的IL-1β、TNFα及NO的含量明显下降，同时脑含水量，Na+含量降低，K+含量增加，与未作预处理的大鼠模型组比较，差异有极显著性(P<0.01)。说明MK-801阻断NMDA受体后，可减少IL-1β、TNFα及NO的生成量。对大鼠感染性脑水肿有保护作用。其保护机制可能是通过阻断NMDA受体后，减少IL-1β、TNFα及NO的生成量。提示IL-1β、TNFα及NO的大量生成可加重EAA的神经毒性作用，为我们防治感染性脑水肿提供了一种新的思路。
作者单位：尹飞(湖南医科大学附属湘雅医院儿科 长沙 410008)
杨于嘉(湖南医科大学附属湘雅医院儿科 长沙 410008)
虞佩兰(湖南医科大学附属湘雅医院儿科 长沙 410008)
, http://www.100md.com
毛定安(湖南医科大学附属湘雅医院儿科 长沙 410008)
陶永光(湖南医科大学附属湘雅医院儿科 长沙 410008)
参考文献：
[1]Faden AI,Demediuk P,Panter SS, et al.The role of excitatory amino acids and NMDA receptors in traumatic brain injury.Science, 1989;244:798～800
[2]江 涛，戴钦舜，刘恩重，等.脑缺血-再灌注损伤中兴奋性氨基酸的变化.中华神经外科杂志，1997；13：219～221
[3]Liu T,Mc Donnell PC, Young PR, et al.Interleukin-1 mRNA expression in ischemic rat cortex.Stroke, 1993;24:1746～1751
, 百拇医药
[4]Merrill JE, Benveniste EN.Cytokines in inflammatory brain lesions:helpful and harmful.Trends Neurosci, 1996;19:331～338
[5]Iadecola C.Bright and dark sides of nitric oxide in ischemic brain injury.Trends Neurosci, 1997;20:132～139
[6]陈 翔，杨于嘉，陈立华，等.N-甲基-D-天门冬氨酸受体及其调控的钙内流在大鼠感染性脑损伤中的变化.中华儿科杂志，1997；35：539～541
[7]Minami M,Kuraishi Y,Yamaguchi T, et al.Convulsants induce interleukin-1 beta mRNA in rat brain.Biochem Biophys Res Commun， 1990;171:832～837
, 百拇医药
[8]Minami M,Kuraishi Y,Satoh M.Effects of kainic acid on mRNA levels of IL-1β.IL-6.TNF α and LIF in the rat brain.Biochem biophys Res Commun，1991;176:593～598
[9]Szaflarski J,Burtrum D,Silverstein FS.Cerebral hypoxia-ischemia stimulates cytokine gene expression in perinatal rats.Stroke, 1995;26:1093～1100
[10]Relton JK, Pothwell NJ.Interleukin-1 receptor antagonist inhibits ischaemic and excitotoxic neuronal damage in the rat.Brain Res Bull，1992;29:243～346, 百拇医药