丙型病毒性肝炎实验性疫苗研究进展
丙型病毒性肝炎实验性疫苗研究进展
吴朝栋 陶其敏
关健词: 丙型肝炎病毒(HCV) HCV疫苗
丙型肝炎病毒(HCV)是肠道外非甲非乙肝炎的主要致病因子，呈世界范围性，其致病常引起持续感染，并且HCV的慢性感染和慢性肝脏疾病、肝硬化及肝癌明显相关。因此，运用疫苗保护免受HCV感染很有必要[1]。本文作者就有关HCV疫苗的实验研究作一综述。
一、重组HCV蛋白疫苗策略
丙型肝炎的实验疫苗起步时，不外乎传统意义上的疫苗策略，即寻找特异的抗原成分，来免疫宿主以期获得中和性或保护性抗体。由于至今尚未分离到病毒颗粒，使得必须以可得到的病毒核酸成分进行重组、表达蛋白，进而进行疫苗研究。
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HCV基因组编码一个大的多聚蛋白前体，在蛋白酶的裂解作用下，生成成熟的病毒蛋白，包括C蛋白、E1、E2蛋白及非结构蛋白。通过重组技术，已表达出上述蛋白成分，并用于免疫接种的研究。
传统上体液免疫用于评价疫苗是否有效，那么，中和抗体的存在与否就是HCV疫苗研制的关键。Shimizu等[2]建立了体外检测抗HCV的方法，检测结果提示HCV可诱导抗病毒颗粒抗体，但这些抗体表现为分离株特异性并随时间而改变。Farci等[3]的研究中，以慢性感染患者血浆用于体外中和HCV检测，并通过接种8只血清阴性猩猩来评估其感染力。结果类似，表明在体内HCV感染能激发分离株特异性中和抗体应答，这些抗体有抗结构蛋白及非结构蛋白抗体。对E2糖蛋白N端HVR1的B细胞表位研究也表明，HVR1的B细胞表位在同源性病毒分离株呈均等特异性。以上研究提示，HCV的确能诱发中和抗体。随后的研究又进一步深入，力求探明中和表位存在于何种病毒蛋白成分，以及是否存在有能交叉反应的中和表位。HCV E2功能区存在的高变区，包含有线性抗体表位，其抗体的体液免疫通过免疫压力参与体内HCV的基因漂移及变异，因而HCV逃避免疫监视[4]，提示E2蛋白内的中和表位可能最具重要意义。以E2糖蛋白作为疫苗接种动物后再作HCV攻击实验，在实验组7只猩猩有5只获得保护性体液免疫，另2只低抗E2抗体滴度反应的猩猩虽有病毒血症，但明显轻于对照组，随后，Rosa等[5]亦运用哺乳动物细胞表达的E2作为疫苗接种猩猩，发现E2糖蛋白可诱导产生高滴度的中和抗体，这种中和抗体可保护猩猩免受HCV攻击。此研究还发现与源于HCV-1基因型E2的中和性结合均等地分布在HCV基因型1、2、3感染血清，表明中和性结合E2有部分和E2高变区无关，即E2内至少存在两个中和表位，其中一个是高变的，一个是保守的。抗E2抗体的保护作用遇到的首要问题是中和抗体具有的株特异性，而另一个问题就是，大多数抗HCV可出现于慢性丙肝患者，仅针对病毒的体液免疫不能足够地阻止疾病进展[6]，因而，HCV疫苗研究应该更加重视HCV蛋白成分与细胞免疫关系的研究。
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细胞免疫，尤其是CTL的作用，可能参与HCV的清除，且不同于体液免疫的是HCV多种蛋白成分均存在T细胞表位，从慢性丙肝患者分离的外周血单个核细胞，对HCV核心蛋白、NS3、NS4和NS5蛋白表位均呈现有Ⅰ类分子限制的CTL应答，Cerny等[7]认为，对于疫苗研制，表位来自HCV保守区域并在细胞内处理的内源性合成抗原，将是较好的可行的疫苗。这种策略的疫苗称为基于T细胞的HCV疫苗。作为HCV保守区域的蛋白成分，核心蛋白aa81-100中包含有与HLA-B44相关联的CTL表位，在多种断裂及重叠肽中，其最小和最适的表位是9聚肽(aa88-96)。这段肽可有效地刺激CTL识别内源性HCV核心蛋白[8]。Kurokohchi等[9]则确定了HCV NS3区域内的CTL表位，重组的NS3含有246个氨基酸(aa1221-1468)经蛋白酶消化后，刺激HCV感染者的外周血单个核细胞，以诱导针对消化后多种形式活性肽的CTL，其中最具活性的片断测序后鉴定为NS3-1J：TITTGAPVTYSIYGK。其特异性CTL细胞株，通过合成肽体外刺激而建立，呈HLA-A2限制性。上述研究一般是采用HCV各区域的蛋白成分单独进行相应的CTL表位研究，与之不同的是，Wong等[10]采用了非特异性刺激策略，结果发现，CTL表位在E2/NS1(aa621-628)内，呈HLA-A限制性；CTL表位也存在于NS3、NS4及NS5内。这提示未来的疫苗很可能是两种或多种蛋白组分的联合运用。此外，运用含内在性或外在性辅助表位的CTL表位肽在体内也诱导了抗HCV的CTL，其辅助作用可由内在于CTL肽的天然辅助表位提供，或由另外的蛋白连接辅助表位而提供。这似乎又为细胞免疫疫苗研制提供了又一新思路。
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二、重组HCV基因疫苗策略
基因疫苗是采用基因免疫的一项新的疫苗技术，于1992年首先报道而近来发展迅速，该技术将编码抗原的DNA直接注射到宿主肌肉或皮内，以期由基因产物激发免疫应答[11]。基因免疫在动物模型中能诱导特异性体液免疫以及更广谱的细胞免疫应答。HCV全基因组序列的测出使得HCV基因疫苗的研究已展开并逐步深入。
HCV核心区在基因型间是较保守的，在核心蛋白抗原内不但定位了B细胞决定簇，也定位了CTL决定簇。CTL的产生针对内在的病毒抗原，对有效的免疫应答十分重要而且可导致抗不同病毒株的交叉保护作用，提示核心区可作为有效的疫苗抗原，而传统疫苗方法尤其在产生CTL应答的局限性，又使得裸DNA免疫技术令这种HCV基因疫苗的研究更具前景。比较重组载体的DNA免疫发现[1]，单独表达HCV核心蛋白的载体未能有效地呈递外源性表位，而核心蛋白与HBsAg融合表达的载体则有效地呈递外源性表位。该研究首先报道了运用DNA免疫以诱导针对HCV蛋白的免疫应答，而且表明通过嵌合载体的DNA免疫可能能够激发一种免疫应答针对两种不同病毒的病毒表位。比较保守的核心蛋白能否作为有效的疫苗可能依赖于其在宿主内诱导产生的CTL应答，对后者，DNA免疫就特别有用。Lagging等[12]也作了类似研究，作为编码病毒颗粒相关核心蛋白的基因组区域，是HCV株间相对保守的，因此将基因组区域编码HCV-1株核心蛋白aa1-191的DNA克隆到真核表达载体，重组的质粒DNA肌内注射到BALB/C鼠(H-2d)内，产生了核心特异性抗体应答、淋巴增殖应答以及CTL活性。该结果提示HCV核心区域多聚核苷酸可作为抗HCV感染的可能疫苗进行深入研究。
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以重组DNA免疫动物，Saito等[13]的研究构建了多种PRC/CMV真核表达载体，分别编码HCV核心(pC)、E1(pE1)、E2(pE2)，C与E1和E2的嵌合体(pCE1E2)、E1和E2嵌合体(pE1E2)以及除去N端HVR的E2载体(pE2-HVR)，这些载体在大肠杆菌内扩增，纯化后转染293细胞，通过免疫荧光及免疫杂交证实这些重组质粒能够在293细胞内瞬时表达HCV抗原，然后将质粒DNA注射到BALB/C鼠骨骼肌内。纯化抗原从感染重组棒状病毒的细胞而来，用作ELISA，结果质粒(pCE1E2,pE1E2,pE1,pE2,pC)能够激发抗HCV核心、E1和E2蛋白的特异性抗体应答，pE2-HVR也可激发抗E2抗体应答；小鼠注射编码核心或其它结构区组分的质粒后还可检出特异性CTL应答。以上结果提示DNA免疫将有助于HCV疫苗的研制。进而，对E2不同区域研究又发现，嵌合有HBsAg的HCVE2糖蛋白(H株)表达载体在E2区分别为五种不同部位，免疫动物后证实HCV E2含有多个决定簇区域，并呈现不同程度的免疫原性，获得的抗体应答提示针对多种决定簇的抗体能够与至少是一种的其它基因型(1b)进行交叉反应，在E2内HVR是最强的免疫原决定簇[14]。这一研究比较深入地探讨了E2区基因的不同序列对抗原决定簇乃至免疫应答的影响，或许对从根本上认识抗HCV的保护性免疫有重要帮助。
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类似的其它研究，也有基本类似的结论。可以看出DNA免疫在预防性及治疗性HCV疫苗的研制中有着不可忽视的作用。
三、问题及展望
HCV疫苗面临的挑战，仍然是病毒蛋白的高变性，尤其是包膜蛋白的变异更为主要，而与HCV相关的LDL蛋白又使得大部分病毒颗粒具有不可中和性，更是进一步的挑战[15]。这些问题的解决很可能是HCV疫苗研制能否取得突破的关键，寻找HCV株间的交叉表位以及通过DNA疫苗策略激发CTL应答可能会有所帮助。
作者单位：100044 北京医科大学人民医院肝病研究所
参考文献
1 Major M, Vitvitski L, Mink MA, et al. DNA-based immunization with chimeric vectors for induction of immune responses against the hepatitis C virus nucleocapsid. J Virol, 1995,69:5798-5805.
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2 Shimizu YK, Hijikata M, Iwamoto A, et al. Neutralizing antibodies against hepatitis C virus and the emergence of neutralization escape mutant viruses. J Virol, 1994,68:1494-1500.
3 Farci P, Alter HJ, Wong DC, et al. Prevention of hepatitis C virus infection in chimpanzees after antibody-mediated in vitro neutralization. Proc Natl Acad Sci USA, 1994,91:7792-7796.
4 KAO JH, CHEN PJ, LAI MY, et al. Quasispecies of hepatitis C virus and genetic drift of the hypervariable region in chronic type C hepatitis. J Infect Dis, 1995, 172:261-264.
, http://www.100md.com
5 Rosa D, Campagnoli S, Moretto C, et al. A quantitative test to estimate neutralizing antibodies to the hepatitis C virus: cytofluorimetric assessment of envelope glycoprotein-E2 binding to target cells. Proc Natl Acad Sci USA, 1996,93:1759-1763.
6 Leroux-Roels G, Esquivel CA, Deleys R, et al. Lymphoproliferative responses to hepatitis C virus Core, E1, E2 and NS3 in patients with interferon alfa. Hepatology, 1996,23:8-16.
7 Cerny A, McHutchison JG, Pasquinelli C, et al. Cytotoxic T lymphocyte response to hepatitis C virus-derived peptides containing the HLA-A2.1 binding motif. J Clin Invest, 1995,95:521-530.
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8 Kita H, Hiroishi K, Moriyama T, et al. A minimal and optimalcytotoxic T cell epitope within hepatitis C virus nucleoprotein. J Gen Virol, 1995,76:3189-3193.
9 Kurokohchi K, Akatsuka T, Pendleton CD, et al. Use of recombinant protein to identify a motif-negative human cytotoxic T-cell epitope presented by HLA-A2 in the hepatitis C virus NS3 region. J Virol, 1996,70:232-240.
10 Wong D, Koziel M, Dudley D, et al. Hepatitis C virus-specific cytotoxic T lymphocytes from liver and peripheral blood. IX Triennial international symposium on viral hepatitis and liver disease. Rome. 1996, April: 38.
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11 Fomsgaard A. Genetic immunization-“the biological equivalent of cold fusion”? Ugeskr-Laeger, 1995,157:4932-4936.
12 Lagging LM, Meyer K, Hoft D, et al. Immune response to plasmid DNA encoding the hepatitis C virus core protein. J Virol, 1995,69:5859-5863.
13 Saito T, Sherman GJ, Akatsuka T, et al. Plasmid DNA-based immunization for hepatitis C virus structural proteins, antibody and CTL responsein mice. IX Triennial international symposium on viral hepatitis and liver disease, Rome. 1996,April: 50.
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14 Nakano I, Major ME, Maertens G, et al. Immunogenicity of the hepatitis C virus (HCV) glycoprotein E2 studied via the use of genetic immunization. IX Triennial international symposium on viral hepatitis and liver disease, Rome. 1996,April:159.
15 Prince AM. Challenge for development of hepatitis C virus vaccines. FEMS-Microbiol Rev, 1994,14:273-277., http://www.100md.com
吴朝栋 陶其敏
关健词: 丙型肝炎病毒(HCV) HCV疫苗
丙型肝炎病毒(HCV)是肠道外非甲非乙肝炎的主要致病因子，呈世界范围性，其致病常引起持续感染，并且HCV的慢性感染和慢性肝脏疾病、肝硬化及肝癌明显相关。因此，运用疫苗保护免受HCV感染很有必要[1]。本文作者就有关HCV疫苗的实验研究作一综述。
一、重组HCV蛋白疫苗策略
丙型肝炎的实验疫苗起步时，不外乎传统意义上的疫苗策略，即寻找特异的抗原成分，来免疫宿主以期获得中和性或保护性抗体。由于至今尚未分离到病毒颗粒，使得必须以可得到的病毒核酸成分进行重组、表达蛋白，进而进行疫苗研究。
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HCV基因组编码一个大的多聚蛋白前体，在蛋白酶的裂解作用下，生成成熟的病毒蛋白，包括C蛋白、E1、E2蛋白及非结构蛋白。通过重组技术，已表达出上述蛋白成分，并用于免疫接种的研究。
传统上体液免疫用于评价疫苗是否有效，那么，中和抗体的存在与否就是HCV疫苗研制的关键。Shimizu等[2]建立了体外检测抗HCV的方法，检测结果提示HCV可诱导抗病毒颗粒抗体，但这些抗体表现为分离株特异性并随时间而改变。Farci等[3]的研究中，以慢性感染患者血浆用于体外中和HCV检测，并通过接种8只血清阴性猩猩来评估其感染力。结果类似，表明在体内HCV感染能激发分离株特异性中和抗体应答，这些抗体有抗结构蛋白及非结构蛋白抗体。对E2糖蛋白N端HVR1的B细胞表位研究也表明，HVR1的B细胞表位在同源性病毒分离株呈均等特异性。以上研究提示，HCV的确能诱发中和抗体。随后的研究又进一步深入，力求探明中和表位存在于何种病毒蛋白成分，以及是否存在有能交叉反应的中和表位。HCV E2功能区存在的高变区，包含有线性抗体表位，其抗体的体液免疫通过免疫压力参与体内HCV的基因漂移及变异，因而HCV逃避免疫监视[4]，提示E2蛋白内的中和表位可能最具重要意义。以E2糖蛋白作为疫苗接种动物后再作HCV攻击实验，在实验组7只猩猩有5只获得保护性体液免疫，另2只低抗E2抗体滴度反应的猩猩虽有病毒血症，但明显轻于对照组，随后，Rosa等[5]亦运用哺乳动物细胞表达的E2作为疫苗接种猩猩，发现E2糖蛋白可诱导产生高滴度的中和抗体，这种中和抗体可保护猩猩免受HCV攻击。此研究还发现与源于HCV-1基因型E2的中和性结合均等地分布在HCV基因型1、2、3感染血清，表明中和性结合E2有部分和E2高变区无关，即E2内至少存在两个中和表位，其中一个是高变的，一个是保守的。抗E2抗体的保护作用遇到的首要问题是中和抗体具有的株特异性，而另一个问题就是，大多数抗HCV可出现于慢性丙肝患者，仅针对病毒的体液免疫不能足够地阻止疾病进展[6]，因而，HCV疫苗研究应该更加重视HCV蛋白成分与细胞免疫关系的研究。
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细胞免疫，尤其是CTL的作用，可能参与HCV的清除，且不同于体液免疫的是HCV多种蛋白成分均存在T细胞表位，从慢性丙肝患者分离的外周血单个核细胞，对HCV核心蛋白、NS3、NS4和NS5蛋白表位均呈现有Ⅰ类分子限制的CTL应答，Cerny等[7]认为，对于疫苗研制，表位来自HCV保守区域并在细胞内处理的内源性合成抗原，将是较好的可行的疫苗。这种策略的疫苗称为基于T细胞的HCV疫苗。作为HCV保守区域的蛋白成分，核心蛋白aa81-100中包含有与HLA-B44相关联的CTL表位，在多种断裂及重叠肽中，其最小和最适的表位是9聚肽(aa88-96)。这段肽可有效地刺激CTL识别内源性HCV核心蛋白[8]。Kurokohchi等[9]则确定了HCV NS3区域内的CTL表位，重组的NS3含有246个氨基酸(aa1221-1468)经蛋白酶消化后，刺激HCV感染者的外周血单个核细胞，以诱导针对消化后多种形式活性肽的CTL，其中最具活性的片断测序后鉴定为NS3-1J：TITTGAPVTYSIYGK。其特异性CTL细胞株，通过合成肽体外刺激而建立，呈HLA-A2限制性。上述研究一般是采用HCV各区域的蛋白成分单独进行相应的CTL表位研究，与之不同的是，Wong等[10]采用了非特异性刺激策略，结果发现，CTL表位在E2/NS1(aa621-628)内，呈HLA-A限制性；CTL表位也存在于NS3、NS4及NS5内。这提示未来的疫苗很可能是两种或多种蛋白组分的联合运用。此外，运用含内在性或外在性辅助表位的CTL表位肽在体内也诱导了抗HCV的CTL，其辅助作用可由内在于CTL肽的天然辅助表位提供，或由另外的蛋白连接辅助表位而提供。这似乎又为细胞免疫疫苗研制提供了又一新思路。
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二、重组HCV基因疫苗策略
基因疫苗是采用基因免疫的一项新的疫苗技术，于1992年首先报道而近来发展迅速，该技术将编码抗原的DNA直接注射到宿主肌肉或皮内，以期由基因产物激发免疫应答[11]。基因免疫在动物模型中能诱导特异性体液免疫以及更广谱的细胞免疫应答。HCV全基因组序列的测出使得HCV基因疫苗的研究已展开并逐步深入。
HCV核心区在基因型间是较保守的，在核心蛋白抗原内不但定位了B细胞决定簇，也定位了CTL决定簇。CTL的产生针对内在的病毒抗原，对有效的免疫应答十分重要而且可导致抗不同病毒株的交叉保护作用，提示核心区可作为有效的疫苗抗原，而传统疫苗方法尤其在产生CTL应答的局限性，又使得裸DNA免疫技术令这种HCV基因疫苗的研究更具前景。比较重组载体的DNA免疫发现[1]，单独表达HCV核心蛋白的载体未能有效地呈递外源性表位，而核心蛋白与HBsAg融合表达的载体则有效地呈递外源性表位。该研究首先报道了运用DNA免疫以诱导针对HCV蛋白的免疫应答，而且表明通过嵌合载体的DNA免疫可能能够激发一种免疫应答针对两种不同病毒的病毒表位。比较保守的核心蛋白能否作为有效的疫苗可能依赖于其在宿主内诱导产生的CTL应答，对后者，DNA免疫就特别有用。Lagging等[12]也作了类似研究，作为编码病毒颗粒相关核心蛋白的基因组区域，是HCV株间相对保守的，因此将基因组区域编码HCV-1株核心蛋白aa1-191的DNA克隆到真核表达载体，重组的质粒DNA肌内注射到BALB/C鼠(H-2d)内，产生了核心特异性抗体应答、淋巴增殖应答以及CTL活性。该结果提示HCV核心区域多聚核苷酸可作为抗HCV感染的可能疫苗进行深入研究。
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以重组DNA免疫动物，Saito等[13]的研究构建了多种PRC/CMV真核表达载体，分别编码HCV核心(pC)、E1(pE1)、E2(pE2)，C与E1和E2的嵌合体(pCE1E2)、E1和E2嵌合体(pE1E2)以及除去N端HVR的E2载体(pE2-HVR)，这些载体在大肠杆菌内扩增，纯化后转染293细胞，通过免疫荧光及免疫杂交证实这些重组质粒能够在293细胞内瞬时表达HCV抗原，然后将质粒DNA注射到BALB/C鼠骨骼肌内。纯化抗原从感染重组棒状病毒的细胞而来，用作ELISA，结果质粒(pCE1E2,pE1E2,pE1,pE2,pC)能够激发抗HCV核心、E1和E2蛋白的特异性抗体应答，pE2-HVR也可激发抗E2抗体应答；小鼠注射编码核心或其它结构区组分的质粒后还可检出特异性CTL应答。以上结果提示DNA免疫将有助于HCV疫苗的研制。进而，对E2不同区域研究又发现，嵌合有HBsAg的HCVE2糖蛋白(H株)表达载体在E2区分别为五种不同部位，免疫动物后证实HCV E2含有多个决定簇区域，并呈现不同程度的免疫原性，获得的抗体应答提示针对多种决定簇的抗体能够与至少是一种的其它基因型(1b)进行交叉反应，在E2内HVR是最强的免疫原决定簇[14]。这一研究比较深入地探讨了E2区基因的不同序列对抗原决定簇乃至免疫应答的影响，或许对从根本上认识抗HCV的保护性免疫有重要帮助。
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类似的其它研究，也有基本类似的结论。可以看出DNA免疫在预防性及治疗性HCV疫苗的研制中有着不可忽视的作用。
三、问题及展望
HCV疫苗面临的挑战，仍然是病毒蛋白的高变性，尤其是包膜蛋白的变异更为主要，而与HCV相关的LDL蛋白又使得大部分病毒颗粒具有不可中和性，更是进一步的挑战[15]。这些问题的解决很可能是HCV疫苗研制能否取得突破的关键，寻找HCV株间的交叉表位以及通过DNA疫苗策略激发CTL应答可能会有所帮助。
作者单位：100044 北京医科大学人民医院肝病研究所
参考文献
1 Major M, Vitvitski L, Mink MA, et al. DNA-based immunization with chimeric vectors for induction of immune responses against the hepatitis C virus nucleocapsid. J Virol, 1995,69:5798-5805.
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2 Shimizu YK, Hijikata M, Iwamoto A, et al. Neutralizing antibodies against hepatitis C virus and the emergence of neutralization escape mutant viruses. J Virol, 1994,68:1494-1500.
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5 Rosa D, Campagnoli S, Moretto C, et al. A quantitative test to estimate neutralizing antibodies to the hepatitis C virus: cytofluorimetric assessment of envelope glycoprotein-E2 binding to target cells. Proc Natl Acad Sci USA, 1996,93:1759-1763.
6 Leroux-Roels G, Esquivel CA, Deleys R, et al. Lymphoproliferative responses to hepatitis C virus Core, E1, E2 and NS3 in patients with interferon alfa. Hepatology, 1996,23:8-16.
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8 Kita H, Hiroishi K, Moriyama T, et al. A minimal and optimalcytotoxic T cell epitope within hepatitis C virus nucleoprotein. J Gen Virol, 1995,76:3189-3193.
9 Kurokohchi K, Akatsuka T, Pendleton CD, et al. Use of recombinant protein to identify a motif-negative human cytotoxic T-cell epitope presented by HLA-A2 in the hepatitis C virus NS3 region. J Virol, 1996,70:232-240.
10 Wong D, Koziel M, Dudley D, et al. Hepatitis C virus-specific cytotoxic T lymphocytes from liver and peripheral blood. IX Triennial international symposium on viral hepatitis and liver disease. Rome. 1996, April: 38.
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12 Lagging LM, Meyer K, Hoft D, et al. Immune response to plasmid DNA encoding the hepatitis C virus core protein. J Virol, 1995,69:5859-5863.
13 Saito T, Sherman GJ, Akatsuka T, et al. Plasmid DNA-based immunization for hepatitis C virus structural proteins, antibody and CTL responsein mice. IX Triennial international symposium on viral hepatitis and liver disease, Rome. 1996,April: 50.
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14 Nakano I, Major ME, Maertens G, et al. Immunogenicity of the hepatitis C virus (HCV) glycoprotein E2 studied via the use of genetic immunization. IX Triennial international symposium on viral hepatitis and liver disease, Rome. 1996,April:159.
15 Prince AM. Challenge for development of hepatitis C virus vaccines. FEMS-Microbiol Rev, 1994,14:273-277., http://www.100md.com