疟原虫的有性分化与发育
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国外医学寄生虫病分册 2000年1月第27卷第1期
第二军医大学寄生虫学教研室 杨波(编译) 管惟滨(审校)
摘 要 本文重点介绍了疟原虫的有性分化与发育方面的一些研究情况。
关键词：疟原虫 有性分化 发育
有性分化发育在疟原虫的生活周期中占有重要地位。疟原虫是脊椎动物宿主体内分化成雄雌配子体的(有性期)，虽然这期的疟原虫本身并不直接引起临床症状，但它们使疟原虫可以通过蚊宿主而在脊椎动物中持续传播。疟原虫的有性分化与发育的整个过程按不同的成熟阶段可分为诱导、分化、进一步成熟三个步骤，但其中的分子基础仍所知甚少。人们推断，也许在自然环境中存在某些原始信号，它们成为某些基因的开关，而这些基因决定了疟原虫是进入有性期，分化发育成配子体，还是继续停留在无性期发育成裂殖子。另外，这些基因的表达产物还可能决定雌性的配子体。有性分化必然依靠于一系列性别相关基因的串联表达，其中包括许多有性期特异性基因及其蛋白产物。然而， 这些基因中被克隆且其蛋白产物在疟原虫的分化中所起的作用被详细胞阐明的仅占少数。
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当成熟的配子体雌蚊摄入后，经历了一个短暂而迅速的配子形成过程(10-20分钟)，产生雄雌配子。一个雌性配子体形成一个雌配子，同时一个雄配子体通过三次有丝分裂形成8个雄配子。雌、雄配子受精产生合子(唯一的双倍体期)，然后迅速进行减数分裂，进入单倍体期，形成卵囊。卵囊中产生的子孢子移入蚊唾腺内等待蚊吸血液时进入宿主体内。在杂合的合的子减数分裂时，每对染色体随机分配进入单倍体子代中。此外，同源染色体之间的交叉互换还导致了基因重组。
因为自然感染时通常有多种基因型的疟原虫混合存在，故在蚊体内有性繁殖时的基因重组能够产生新的基因型并保持任一株疟原虫基因型的多样性。不同地区疟原虫的遗传研究和实验室中进行的交叉实验，均证实存在雌雄配子体的随机分配模式与基因内和基因间的重组现象。有许多因素都对疟原虫的传播活力有着重要的影响，例如，配子体密度、雌雄配子体比率、基因型多样性和有性期的生物竞争力(遗传适应性)等。
1 有性分化、发育模式与诱导物
, 百拇医药
Carter和Miller对疟原虫有性分化和发育提出了两种假说。其一，刚侵入红细胞时，红内期的无性疟原虫并没有进行有性分化与发育、它们有可能分化成配子体，也可能保持无性状态。其二，来自不同裂殖体的殖殖子，其父代裂殖体时期就已经进行了分化与发育的选择，或成为无性疟原虫或形成配子体。
由于在平常观察时，受染的红细胞普遍含有二个以上配子体或无性疟原虫，有人认为双重感染的红细胞最有可能是受到源自同一裂殖体的裂殖子的攻击，而这一裂殖体已经具备某种分化和发育的定向。另有研究证明，某些裂殖体形成配子体可能性明显高于另外一些。而然，还有研究显示，大多数裂殖配体并不只是单一的发育途径，因为许多含配子体的疟原虫蚀斑中还有无性疟原虫(生长在单层红细胞中)。
Bruce等用期特异性抗原的单抗分析蚀斑中的子代原虫，以再次探讨有性分化与发育问题。发现受侵红细胞在30-40小时后，同时具有配子体和无性疟原虫。在几乎所有的红细胞中，相同的发育定向导致细胞内所有疟原虫源自单一的裂殖体，少数混合感染的蚀斑可以用RBCs受到多次侵犯来解释。此外，还发现在快速的无性期生长过程中，及时用新鲜血液和培养基稀释培养物，可使裂殖体形成配子体的机会明显减少，而疟原虫血液密度增高，无性生长减慢时，这种机会则增大70倍。在添加新鲜红细胞的两天内，以前存在大量配子体蚀斑的培养物中，配子体减少。这提示，配子体形成的关键时期必定的在裂殖发成熟为裂殖的头二天内。
, 百拇医药
P.f.的配子体形成同时依赖于先天因素和环境因素。诱导的人工培养P.f.配子体形成的工作已取得不同程度的成功。用过的诱导物有cAMP磷到二酯酶抑制剂、咖啡因、8-bromo-cAMP、红细胞溶解物、抗P.f.抗体的杂交瘤培养上清液、berenil(一种核苷和多氨基合成的抑制剂)。其中，环核苷酸的实验结果在复重时发生冲突，用Berenil诱导三株不同克隆的P.f.配子体形成时遇到困难。
2 有性期特异性抗原的表达
由于许多有性期表达的蛋白是诱导抗体介导免疫阻断反应的目的抗原，故对它们进行了大量的研究。人们认为其中Pfg27(在配子体内合成，表达在配子表面)、Pfs25(在配子体形成过程中和合子发育中合成)、Pfa28(表达在合子和动合子表面)。另一种蛋白Pfs16在配子体内大量产生，而其它时期也有表达。人们对于配子体性别特异性的标志蛋白所知甚少。Pfs230和Pfs48/45同时存在于雌、雄配子体/配子。Pfg27的性别特异性尚不肯定，而Pfs25仅配子体诱导形成之后产生并表达在新近受精的合子表面。然而，有些蛋白的表达则明显具有性别特异性。Rawling报道，2-tubulinⅡ是Pf的一种雄性蛋白。另有研究表明，编码线粒体基因的长为2.6kb的染色体外胞浆DNA成分和Pf77则仅在Pf雌配子体/配子中转录。还发现，调控发育的蛋白酶在有性期各阶段的表达亦有不同。
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在配子体的各亚期中，有些蛋白的表达受到了不同水平的调控。例如，Pfg27的表达高峰在Ⅱ期，而Pfs230和Pfs48/45在Ⅲ期，Pfs16则在配子体各亚期中均有表达。
3 P.f.突变系在有性分发育研究中的运用
当P.f.在血液中持续培养时，它可能自发地失去产生配子体的能力。不同的P.f.株产生配子体缺失的时间为持续无性繁殖几个月以1年以上不等。这提示可能有遗传位点控制着配子体形成过程的启动。在持续的体外培养并缺少蚊传播的选择性时，这些位点可能发生突变。对于这些缺少配子体产生的突变系进行分子水平的研究，可能是确定某些基因的关键，这些基因控制了有性分化和功能性有活力配子体的产生。
现有两种基因的突变株，一种是能产生正常配子体，但数量低于正常水平。另一种则完全不能产生配子体。前者可能是由于受到物理性刺激而发生突变，这些刺激与有性分化与发育有关。人们推测，有关产生成熟配子体的全部遗传信息必定完整地保留在这类疟原虫克隆的部位个体中。完全失去有性期的疟原虫必定已完全失去对分化信号的应答能力或在另一些指导配子体形成的遗传位点上发生突变。还有的P.f.突变株器其配子体不能继续发育而停止在Ⅲ期，这些突变可指示与配子体发育成熟有关的遗传位点。Day等研究了一类9号染色体N末端0.3Mb亚端粒缺失的疟原虫。他们推断，这一位点编码涉及这两种表现型的结构基因或转录因子。这类疟原虫在配子体形成与胞间连接两方面存在突变。Alano观察了一类9号染色体存在长度异质性的疟原虫。他们的数据显示，全长的9号染色体分子优先保留在发育的配子体中，而且存在染色体缺失的疟原虫关于配子体形成的形态学或抗原方面的证据与之相符。Chaiyaroj等报道，在吉氏染色涂片的培养物中存在配子体，尽管它也有缺失的9号染色体，然而，并不清楚用这种培养方式来确定该类疟原虫中所有个体的缺失同质性到底有多准确。Alan等也报道，除了全长9号染色体和胞间连接两种基因型突变外，所有的克隆都有配子体形成缺陷的现象。这些突变最可能影响有性分化的早期，他们有不同于9号染色体缺失的突变株。因此，除了9号染色体上有争议的0.3Mb区段外，另有一些遗传决定簇也可能涉及疟原虫的有性发育。
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有人报道，Pfg27基因上游序列存在DNA重排并导致它的转录模式发生改变的一类的疟原虫。它不能发育成有性形式。这种DNA重排按Pfg27的累积效应分为2类。第一类没有可检测的Pfg27转染，而第二类，除了有天然的2.6kb片段外，还存在其它mRNA片段的优先表达。然而在这二类中均未能在裂殖体内检测出Pfg27蛋白，对于突变株和配子体内的Pfg27基因5'和3'端非编码区的分析也许能找到在有性期特异性基因表达调控中起关键作用的DNA序列，曾试图在分子水平找到某些体外培养的P.f.株的去形成配子体能力的原因，其方法是检测不同有性期阶段中有性期特异性蛋白表达和转录的情况。结果提示，在配子体成熟的过程中，这些突变系的许多期特异性蛋白有着不同水平的表达。它说明有性分化是多因素控制的并涉及多个时期。与疟原虫发育相关的形态学变化总伴随着明显的生化变化。例如，期特异性基因的开关和基因在转录和翻译水平的调控。以各种期特异蛋白在各期中的表达为依据，推断出这些突变系在配子体形成过程中的阻断点。在这些无性克隆中几乎没有检测到配子体。所以，可能是发生化方面的变化(有性期特异性的合成)优先于形态学方面的改变，并且不能产生配子体的疟原虫可能在分子、生化、形态学分化过程中被阻断在各个不同时期。
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此后，在Dd2的P.f.株中，12号染色体某一位点的缺失被认为影响着雄性配子体的形成。然而，随后的研究表明这一突变影响了P.f.雄性配子体竞争活性的发展。光电显微镜显示出雄性配子体发育过程的球形分装情况；含有多倍体的异常配子体大量存在，并在胞浆内出现异常的大空泡样变化。以雄配子几乎完全缺失为特征的性别特异性发育突变，导致蚊宿主的低感染率，而雌配子体以正常数量产生，作为母系的亲代可出现有效的遗传交叉。尽管人们并不清楚P.f.基因组是否有分开的遗传位点，它们分别决定雄性和雌性的分化过程，但这些研究仍提示在12号染色体上存在某一基因或基因簇专一控制雄性配子体的形成。
4 展 望
对于配子体缺失的疟原虫突变系的研究成果，已经给解释疟原虫有性分化调控机制带来一线光明。然而，要理解这一复杂过程的分子机制还要进行深入研究。
已经证实9号和12号染色体具决定有性发育的遗传决定簇，对这些染色体的定位克隆以及正常配子体产生株与突变株DNA序列的分析，将有助于阐明这些关键位点。以上研究工作将借助于疟原虫基因组计划，因为这一计划不断产生有价值的DNA序列信息。
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近来，成功而稳定的遗传转化技术为确定有性期特异性抗原的功能提供了必需的工具。利用同源重组技术，有可能阻断目的基因从而评估它在疟原虫有性发育过程中的作用。对于特异性基因活性相关启动子区域的研究也具有可行性。它将利于分析有性期特异性基因表达调控。为了解释影响有性分化的环境因素与生化变化的联系，对于信号传导途径的研究十分必要。对细胞周期调控成份的分析将有助于我们理解有性分化的分子机制。
宜寻找另一些基因，它们的编码产物应在P.f.有性分化扮演特殊角色。为了解释疟疾自然传播中出现的许多基因型，了解疟原虫如何控制生活周期的循环方式，研究这种复杂原虫的有性期生物学显得十分必要。
参考文献
1 Ranford-Cartwright LC,Parasitol Today,1995;11(4):154-157
2 Taylor LH et al.Parasitol Today,1997;13(4):135-140
3 Mann VH et al.Int J Parasitol,1996;26(1):117-121
4 Kinnaird JH et al.Parasitology,1997;13(1):7-8
录入：邰燕
校对：姬颖, http://www.100md.com
摘 要 本文重点介绍了疟原虫的有性分化与发育方面的一些研究情况。
关键词：疟原虫 有性分化 发育
有性分化发育在疟原虫的生活周期中占有重要地位。疟原虫是脊椎动物宿主体内分化成雄雌配子体的(有性期)，虽然这期的疟原虫本身并不直接引起临床症状，但它们使疟原虫可以通过蚊宿主而在脊椎动物中持续传播。疟原虫的有性分化与发育的整个过程按不同的成熟阶段可分为诱导、分化、进一步成熟三个步骤，但其中的分子基础仍所知甚少。人们推断，也许在自然环境中存在某些原始信号，它们成为某些基因的开关，而这些基因决定了疟原虫是进入有性期，分化发育成配子体，还是继续停留在无性期发育成裂殖子。另外，这些基因的表达产物还可能决定雌性的配子体。有性分化必然依靠于一系列性别相关基因的串联表达，其中包括许多有性期特异性基因及其蛋白产物。然而， 这些基因中被克隆且其蛋白产物在疟原虫的分化中所起的作用被详细胞阐明的仅占少数。
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当成熟的配子体雌蚊摄入后，经历了一个短暂而迅速的配子形成过程(10-20分钟)，产生雄雌配子。一个雌性配子体形成一个雌配子，同时一个雄配子体通过三次有丝分裂形成8个雄配子。雌、雄配子受精产生合子(唯一的双倍体期)，然后迅速进行减数分裂，进入单倍体期，形成卵囊。卵囊中产生的子孢子移入蚊唾腺内等待蚊吸血液时进入宿主体内。在杂合的合的子减数分裂时，每对染色体随机分配进入单倍体子代中。此外，同源染色体之间的交叉互换还导致了基因重组。
因为自然感染时通常有多种基因型的疟原虫混合存在，故在蚊体内有性繁殖时的基因重组能够产生新的基因型并保持任一株疟原虫基因型的多样性。不同地区疟原虫的遗传研究和实验室中进行的交叉实验，均证实存在雌雄配子体的随机分配模式与基因内和基因间的重组现象。有许多因素都对疟原虫的传播活力有着重要的影响，例如，配子体密度、雌雄配子体比率、基因型多样性和有性期的生物竞争力(遗传适应性)等。
1 有性分化、发育模式与诱导物
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Carter和Miller对疟原虫有性分化和发育提出了两种假说。其一，刚侵入红细胞时，红内期的无性疟原虫并没有进行有性分化与发育、它们有可能分化成配子体，也可能保持无性状态。其二，来自不同裂殖体的殖殖子，其父代裂殖体时期就已经进行了分化与发育的选择，或成为无性疟原虫或形成配子体。
由于在平常观察时，受染的红细胞普遍含有二个以上配子体或无性疟原虫，有人认为双重感染的红细胞最有可能是受到源自同一裂殖体的裂殖子的攻击，而这一裂殖体已经具备某种分化和发育的定向。另有研究证明，某些裂殖体形成配子体可能性明显高于另外一些。而然，还有研究显示，大多数裂殖配体并不只是单一的发育途径，因为许多含配子体的疟原虫蚀斑中还有无性疟原虫(生长在单层红细胞中)。
Bruce等用期特异性抗原的单抗分析蚀斑中的子代原虫，以再次探讨有性分化与发育问题。发现受侵红细胞在30-40小时后，同时具有配子体和无性疟原虫。在几乎所有的红细胞中，相同的发育定向导致细胞内所有疟原虫源自单一的裂殖体，少数混合感染的蚀斑可以用RBCs受到多次侵犯来解释。此外，还发现在快速的无性期生长过程中，及时用新鲜血液和培养基稀释培养物，可使裂殖体形成配子体的机会明显减少，而疟原虫血液密度增高，无性生长减慢时，这种机会则增大70倍。在添加新鲜红细胞的两天内，以前存在大量配子体蚀斑的培养物中，配子体减少。这提示，配子体形成的关键时期必定的在裂殖发成熟为裂殖的头二天内。
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P.f.的配子体形成同时依赖于先天因素和环境因素。诱导的人工培养P.f.配子体形成的工作已取得不同程度的成功。用过的诱导物有cAMP磷到二酯酶抑制剂、咖啡因、8-bromo-cAMP、红细胞溶解物、抗P.f.抗体的杂交瘤培养上清液、berenil(一种核苷和多氨基合成的抑制剂)。其中，环核苷酸的实验结果在复重时发生冲突，用Berenil诱导三株不同克隆的P.f.配子体形成时遇到困难。
2 有性期特异性抗原的表达
由于许多有性期表达的蛋白是诱导抗体介导免疫阻断反应的目的抗原，故对它们进行了大量的研究。人们认为其中Pfg27(在配子体内合成，表达在配子表面)、Pfs25(在配子体形成过程中和合子发育中合成)、Pfa28(表达在合子和动合子表面)。另一种蛋白Pfs16在配子体内大量产生，而其它时期也有表达。人们对于配子体性别特异性的标志蛋白所知甚少。Pfs230和Pfs48/45同时存在于雌、雄配子体/配子。Pfg27的性别特异性尚不肯定，而Pfs25仅配子体诱导形成之后产生并表达在新近受精的合子表面。然而，有些蛋白的表达则明显具有性别特异性。Rawling报道，2-tubulinⅡ是Pf的一种雄性蛋白。另有研究表明，编码线粒体基因的长为2.6kb的染色体外胞浆DNA成分和Pf77则仅在Pf雌配子体/配子中转录。还发现，调控发育的蛋白酶在有性期各阶段的表达亦有不同。
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在配子体的各亚期中，有些蛋白的表达受到了不同水平的调控。例如，Pfg27的表达高峰在Ⅱ期，而Pfs230和Pfs48/45在Ⅲ期，Pfs16则在配子体各亚期中均有表达。
3 P.f.突变系在有性分发育研究中的运用
当P.f.在血液中持续培养时，它可能自发地失去产生配子体的能力。不同的P.f.株产生配子体缺失的时间为持续无性繁殖几个月以1年以上不等。这提示可能有遗传位点控制着配子体形成过程的启动。在持续的体外培养并缺少蚊传播的选择性时，这些位点可能发生突变。对于这些缺少配子体产生的突变系进行分子水平的研究，可能是确定某些基因的关键，这些基因控制了有性分化和功能性有活力配子体的产生。
现有两种基因的突变株，一种是能产生正常配子体，但数量低于正常水平。另一种则完全不能产生配子体。前者可能是由于受到物理性刺激而发生突变，这些刺激与有性分化与发育有关。人们推测，有关产生成熟配子体的全部遗传信息必定完整地保留在这类疟原虫克隆的部位个体中。完全失去有性期的疟原虫必定已完全失去对分化信号的应答能力或在另一些指导配子体形成的遗传位点上发生突变。还有的P.f.突变株器其配子体不能继续发育而停止在Ⅲ期，这些突变可指示与配子体发育成熟有关的遗传位点。Day等研究了一类9号染色体N末端0.3Mb亚端粒缺失的疟原虫。他们推断，这一位点编码涉及这两种表现型的结构基因或转录因子。这类疟原虫在配子体形成与胞间连接两方面存在突变。Alano观察了一类9号染色体存在长度异质性的疟原虫。他们的数据显示，全长的9号染色体分子优先保留在发育的配子体中，而且存在染色体缺失的疟原虫关于配子体形成的形态学或抗原方面的证据与之相符。Chaiyaroj等报道，在吉氏染色涂片的培养物中存在配子体，尽管它也有缺失的9号染色体，然而，并不清楚用这种培养方式来确定该类疟原虫中所有个体的缺失同质性到底有多准确。Alan等也报道，除了全长9号染色体和胞间连接两种基因型突变外，所有的克隆都有配子体形成缺陷的现象。这些突变最可能影响有性分化的早期，他们有不同于9号染色体缺失的突变株。因此，除了9号染色体上有争议的0.3Mb区段外，另有一些遗传决定簇也可能涉及疟原虫的有性发育。
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有人报道，Pfg27基因上游序列存在DNA重排并导致它的转录模式发生改变的一类的疟原虫。它不能发育成有性形式。这种DNA重排按Pfg27的累积效应分为2类。第一类没有可检测的Pfg27转染，而第二类，除了有天然的2.6kb片段外，还存在其它mRNA片段的优先表达。然而在这二类中均未能在裂殖体内检测出Pfg27蛋白，对于突变株和配子体内的Pfg27基因5'和3'端非编码区的分析也许能找到在有性期特异性基因表达调控中起关键作用的DNA序列，曾试图在分子水平找到某些体外培养的P.f.株的去形成配子体能力的原因，其方法是检测不同有性期阶段中有性期特异性蛋白表达和转录的情况。结果提示，在配子体成熟的过程中，这些突变系的许多期特异性蛋白有着不同水平的表达。它说明有性分化是多因素控制的并涉及多个时期。与疟原虫发育相关的形态学变化总伴随着明显的生化变化。例如，期特异性基因的开关和基因在转录和翻译水平的调控。以各种期特异蛋白在各期中的表达为依据，推断出这些突变系在配子体形成过程中的阻断点。在这些无性克隆中几乎没有检测到配子体。所以，可能是发生化方面的变化(有性期特异性的合成)优先于形态学方面的改变，并且不能产生配子体的疟原虫可能在分子、生化、形态学分化过程中被阻断在各个不同时期。
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此后，在Dd2的P.f.株中，12号染色体某一位点的缺失被认为影响着雄性配子体的形成。然而，随后的研究表明这一突变影响了P.f.雄性配子体竞争活性的发展。光电显微镜显示出雄性配子体发育过程的球形分装情况；含有多倍体的异常配子体大量存在，并在胞浆内出现异常的大空泡样变化。以雄配子几乎完全缺失为特征的性别特异性发育突变，导致蚊宿主的低感染率，而雌配子体以正常数量产生，作为母系的亲代可出现有效的遗传交叉。尽管人们并不清楚P.f.基因组是否有分开的遗传位点，它们分别决定雄性和雌性的分化过程，但这些研究仍提示在12号染色体上存在某一基因或基因簇专一控制雄性配子体的形成。
4 展 望
对于配子体缺失的疟原虫突变系的研究成果，已经给解释疟原虫有性分化调控机制带来一线光明。然而，要理解这一复杂过程的分子机制还要进行深入研究。
已经证实9号和12号染色体具决定有性发育的遗传决定簇，对这些染色体的定位克隆以及正常配子体产生株与突变株DNA序列的分析，将有助于阐明这些关键位点。以上研究工作将借助于疟原虫基因组计划，因为这一计划不断产生有价值的DNA序列信息。
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近来，成功而稳定的遗传转化技术为确定有性期特异性抗原的功能提供了必需的工具。利用同源重组技术，有可能阻断目的基因从而评估它在疟原虫有性发育过程中的作用。对于特异性基因活性相关启动子区域的研究也具有可行性。它将利于分析有性期特异性基因表达调控。为了解释影响有性分化的环境因素与生化变化的联系，对于信号传导途径的研究十分必要。对细胞周期调控成份的分析将有助于我们理解有性分化的分子机制。
宜寻找另一些基因，它们的编码产物应在P.f.有性分化扮演特殊角色。为了解释疟疾自然传播中出现的许多基因型，了解疟原虫如何控制生活周期的循环方式，研究这种复杂原虫的有性期生物学显得十分必要。
参考文献
1 Ranford-Cartwright LC,Parasitol Today,1995;11(4):154-157
2 Taylor LH et al.Parasitol Today,1997;13(4):135-140
3 Mann VH et al.Int J Parasitol,1996;26(1):117-121
4 Kinnaird JH et al.Parasitology,1997;13(1):7-8
录入：邰燕
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