控制家畜蠕虫感染的照射疫苗
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国外医学寄生虫病分册 2000年1月第27卷第1期
同济医科大学寄生虫学教研室 耿辉(编译) 李雍龙(审校)
摘 要 应用照射减活的幼虫疫苗控制由网尾线虫(Dictyocaulus spp)引起的牛、羊寄生虫性支气管炎已有近40年的历史，其后虽对其它的宿主-寄生虫系统开展大量的研究，但并未有新的疫苗问世。事实上，抗网尾线虫疫苗需持续不断的自然感染来维护其免疫力。制备活的幼虫疫苗的困难阻碍了这项研究的进行，本文讨论了生产疫苗的困难，提出一了些解决的办法并对发展抗其它蠕虫的照射减活疫苗提出了建议。
关键词：疫苗 照射幼虫 蠕虫 网尾线虫 血矛线虫 牛羊
蠕虫的抗药性重新引起人们对非化学方法控制家畜感染的兴趣，包括宿主的遗传抵抗力、生物防治、放牧管理和疫苗接种等方法。将这些方法同药正确的联合使用，可能是防治蠕虫感染的最好措施。
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疫苗可保护易感家畜或减少家畜体内的幼虫数，从而降低易感动物的感染率。应用减活幼虫疫苗提高机体免疫力是一项值得重新研究的课题。40年前就曾开展过这方面的研究，但现在判断疗效的标准已改变。例如，将疫苗接种同其它方法联合应用，使得降低虫荷作用较低的疫苗可能被接受，强调的重点是降低产卵率，进而能降低牧场的家畜再感染。如果免疫成年家畜能减少牧场中寄生虫数，降低幼畜感染疾病的机会，那么对疫苗的研究可不必再集中于更年幼的幼畜。过去曾经认为制备减活疫苗非常困难且价格昂贵以至不能生产和运输，然而，应用现有的知识，绝大多数的技术难题都能被克服。
1 照射减活疫苗的进展
1.1 照射减适幼虫疫苗的商业应用
尽管在宿主-寄生虫系统开展了大量有关减活幼虫疫苗的研究，并且很多系统表现出很高的保护力，但仅有3种疫苗用于商业生产。这种3种疫苗是：寄生于牛羊肺的胎生网尾线虫(Dictyocaulus viviparus)疫苗，寄生于牛羊肺的丝状网尾线虫(Dictyocaulus filaria)疫苗和犬钩虫(Ancylostoma caninum)疫苗。胎生网尾线虫疫苗自1959年已商品化。丝状网尾线虫疫苗自1965年首次报道后，东欧、中区、北亚等许多国家都有生产。1973年美国曾生产犬钩虫疫苗，虽然技术上取得了成功，但因为商业的原因它并未成为有利可图的产品，1975年已停止生产。
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1.2 肺线虫疫苗的历史
自1959年开始研究胎生网尾线虫疫苗，之后英国格拉斯哥的研究人员对利用照射减活的幼虫疫苗刺激免疫力方面进行了一系列的研究，40krad剂量的X线照射的幼虫，每次接种1000条，4周后再接种一次，对再感染能产生高水平的保护力。
二十世纪五十年代末，由网尾线虫引起的寄生虫性支气管炎对英国乳品加工业来说是很严重的问题，当时缺乏治疗及预防此病的药物，对此病的流行病学知识也不多，由于少量的虫荷即可引起发病，因而该病较易在短期内爆发流行而且难以控制。在这种背景下，疫苗的出现备受青睐并取得了可观的商业效益。
随后的三十年，出现了现代的抗蠕虫药物，使疫苗的优越性受到了影响。晚近，坚持利用药物作为预防胃肠道线虫和肺线虫感染的一个组成部分也进一步削弱了肺线虫疫苗的优越性。有些农场在大部分年份里能利用药物有效地控制家畜秋季肺线虫感染。然而，如果初冬天气温暖延迟家畜入室时间，仍会暴发肺线虫病。由于有效的药物防治，动物可能不会经历足够的低水平感染以产生并维持免疫力，因而成年牛仍会患肺线虫病。
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由于防治措施的有效性和病畜较过去得到了更有效的治疗，导致了胎生网尾线虫疫苗销售量下降，但随之而来是患寄生虫性支气管炎的家畜尤其是成年牛增多，尽管近年来疫苗产品销售量下降，但肺线虫疫苗仍然是最成功和最有利可图的。
1.3 有前途的照射减活幼虫疫苗
自牛肺线虫疫苗取得成功后，人们对类似的疫苗能迅速用于控制其它家畜寄生虫寄予很大希望，并在许多宿主-寄生虫系统进行了研究，包括捻转血矛线虫(Haemonchus contortus)、蛇形毛圆线虫(Trichostrangylus colubriformis)、寻常圆线虫(Strongylus vulgaris)、日本血吸虫和牛血吸虫。在减少虫荷方面，寻常圆线虫照射减活幼虫疫苗能使马产生92%的保护力，照射减活的捻转血矛线虫幼虫疫苗和毛圆线虫幼虫疫苗能使羊分别产生95%和88%以上的保护力。
然而，搥转血矛线虫疫苗仅对7月龄以上的动物产生较高的保护力，而且要求在疫苗接种前动物未受到该虫的感染，这意味着最易感的家畜的血矛线虫病流行区难以通过接种疫苗产生抵抗力。目前很少开展疫苗对成虫产卵方面的研究，减活疫苗有可能通过降低成虫产卵率，减轻牧场污染，减少幼年易感动物的感染机会。
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2 幼虫疫苗的制备及传送
2.1 幼虫的制备
有关照射减活幼虫疫苗争论的焦点之一是所需幼虫的数目。迄今为止，体外培养幼虫尚未取得成功，仍需保存感染的动物(对吸虫还需保存螺类中间宿主)来制备幼虫。
对捻转血矛线虫，每次接种10000条幼虫(假设每只动物接种2次，则需2000条幼虫)。假定人工感染捻转血矛线虫的羊每天产粪750克，每克粪便含2500个虫卵，虫卵孵化率为60%，那么每圈10只羊，每月一圈，一年所提供的幼虫足够接种200000头羊，此项费用并不太昂贵，也不需很高的技术。
幼虫培养和制备方法会影响疫苗的保存期。采用普通方法生产犬钩虫幼虫时，幼虫仅能存活2-4周，如果采用无菌培养技术，幼虫可存活12个月。值得一提的是，从粪便中分离的丝状网尾线虫的1期幼虫在水中培养到3期幼虫，这种疫苗的保存期仅为2周，而胎生网尾线虫幼虫在粪便中培养到3期幼虫，这种疫苗的保存期可达到6周。目前尚不清楚这种现象是虫种的不同还是培养方法的差异造成的。
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2.2 照射减活
对准备好的幼虫，需寻找合适的减活方法，近年来照射减活成为关注的焦点，其它方法如化学减活和基因调控法也是可能和值得研究的。文献中曾报道过3种照射减活方法：X射线法，γ射线法及紫外线法。早期牛肺线虫疫苗采用X射线照射减活，然而近年来γ射线法因为更方便而被大多数学者采用。紫外线照射已作为一种激活方法用于许多寄生虫疫苗的研究。
不同的学者采用的照射剂量不同，但40-60kard剂量是公认的制备线虫疫苗的有效剂量。温度和幼虫密度的稍许改变对减活的效果也会产生很大的影响。
2.3 接种途径
通常采用自然感染途径接种照射过的幼虫，改用其它途径也可能有效。例如，给牛口服胎生网尾线虫疫苗，与对照组相比，减虫率为96.6%，同样剂量采用皮下包埋法减虫率为97.8%。
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2.4 疫苗的包装及传送
因为幼虫能很快从水溶液中沉淀下来，故疫苗的包装问题是以前生产兽用产品过程中从未遇到过难题。粘性的或胶状的基质虽然是一种有效的分散剂，但在温度控制不够冷的包装中幼虫可能会从基质中移出。
对某些寄生虫而言，储存温度也很重要，犬钩虫疫苗要求保存在10-15℃。在选择包装材料时也会遇到一些问题，肺线虫疫苗一般是采用玻璃容器包装，但为降低邮寄和包装的费用曾尝试采用塑料包装，这种尝试因在包装过程中塑料携带的静电能使幼虫吸附瓶壁而失败。
2.5 许可证
目前尚无产品许可证所要求的具体条件。至少大多数国家要求提供疫苗的效果、安全性及质量保证、确保对环境及动物无危害，提供与其它方法联合应用无配伍禁忌及使用疫苗的禁忌症等方面的证据。
在犬钩虫疫苗申请许可证时曾建议疫苗在发放时应有2-4倍的安全限度，有效期满时应有2-4倍的有效限度，这意味给动物接种4倍剂量的疫苗也不会引起副作用，而1/4剂量即可达到保护效果。这可视为疫苗安全性和有效性的一条可取的标准。准备注册的疫苗需进行效果及安全性的剂量滴定试验。用实验所得数据计算最低有效剂量及最大安全剂量，将这些数据同幼虫存活衰减曲线和上述的4倍限度结合，就可计算出每个剂量幼虫的数目以及产品的有效期。
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如何确定疫苗的效果及最低有效范围。如牛肺线虫疫苗的目的就是预防临床症状的发生，因此使虫荷降低90%或95%是合适的。但对捻转血矛线虫并转而言，如果接种的目的是防止接种过的动物的后代或整个羊群患病，这个标准太严。因此，在申请疫苗生产许可证时需要清楚地阐明疫苗的作用。
质量保证需要提供感染性、减活、安全及无菌等方面的证据。牛肺线虫疫苗的感染性及减活程度可通过接种豚鼠来确定，在皮肤接种疫苗2天后，在豚鼠体内应找到幼虫以证明疫苗有感染性，10天后豚鼠体内应找不到幼虫以证明疫苗已被减活。安全性最好通过观察接种2-4倍剂量疫苗的动物来判定。
对无菌的判断标准是不断变化的。最初，对犬钩虫疫苗要求不含一些特殊的病原体，以后是要求犬钩虫疫苗应该象其它疫苗一样不含任何微生物。通过处理虫卵及改用无菌培养技术，疫苗可达到无菌的要求。英国对牛肺线虫疫苗的要求是不含一些特殊的病原体。
网尾线虫幼虫在体外培养时不需喂食，因此，其体表甚至鞘膜内层都能很容易地保持无菌。但未脱鞘的3期幼虫因其体内的其它寄生虫可能含有细菌，因此很难做到无菌。在无菌条件下孵化和培养幼虫可以解决这一问题。
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利用供体动物提供幼虫将损伤动物，受感染动物的后果也应予考虑。肺部寄生虫较胃肠道寄生虫更易引起供体动物患病，虫荷及供体动物数目间的平衡也是值得考虑的问题。
照射减活疫苗较其他疫苗，特别是化学疫苗较少引起环境问题。在相邻国家为防止疫苗交易出现的问题，当局可能要求出示疫苗已安全减活的证明以防止变异的寄生虫在别国传播。
需在某些宿主-寄生虫系统仔细地研究同其它疫苗及治疗方法的相容性，例如，在接种照射减活的丝状网尾线虫疫苗和捻转血矛线虫疫苗时使用抗蠕虫药可能会干扰免疫力的产生。同样，接种时动物的疾病状况可能会影响以后的接种计划。这些问题对准备接种疫苗的成年家畜可能更重要。
3 结 语
同其它大多数兽用产品一样，照射减活的幼虫疫苗仍需克服科学发现与商业应用之间的许多困难。考虑到市场、产品的有效期、其它控制疾病方法的进展和农民对产品的认识等问题，照射减活疫苗可能因销售量太少而不会引起大公司的生产兴趣。但较小规模的公司开发这方面的市场仍存在好的机遇，因为生产这种疫苗技术简单，生产费用也不象分子疫苗那样昂贵。
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主要参考文献
1 Munn EA.Int J Parasitol,1997;45(5):359-366
2 Barnes ER EH.Parasitol Today,1995;11(2):56-63
3 Newton SE.Int J Parastiol,1995;25(10):1281-1289
4 Gray GD.Veter Parasitol,1997;72(3-4):345-366
录入：邰燕
校对：姬颖, 百拇医药
摘 要 应用照射减活的幼虫疫苗控制由网尾线虫(Dictyocaulus spp)引起的牛、羊寄生虫性支气管炎已有近40年的历史，其后虽对其它的宿主-寄生虫系统开展大量的研究，但并未有新的疫苗问世。事实上，抗网尾线虫疫苗需持续不断的自然感染来维护其免疫力。制备活的幼虫疫苗的困难阻碍了这项研究的进行，本文讨论了生产疫苗的困难，提出一了些解决的办法并对发展抗其它蠕虫的照射减活疫苗提出了建议。
关键词：疫苗 照射幼虫 蠕虫 网尾线虫 血矛线虫 牛羊
蠕虫的抗药性重新引起人们对非化学方法控制家畜感染的兴趣，包括宿主的遗传抵抗力、生物防治、放牧管理和疫苗接种等方法。将这些方法同药正确的联合使用，可能是防治蠕虫感染的最好措施。
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疫苗可保护易感家畜或减少家畜体内的幼虫数，从而降低易感动物的感染率。应用减活幼虫疫苗提高机体免疫力是一项值得重新研究的课题。40年前就曾开展过这方面的研究，但现在判断疗效的标准已改变。例如，将疫苗接种同其它方法联合应用，使得降低虫荷作用较低的疫苗可能被接受，强调的重点是降低产卵率，进而能降低牧场的家畜再感染。如果免疫成年家畜能减少牧场中寄生虫数，降低幼畜感染疾病的机会，那么对疫苗的研究可不必再集中于更年幼的幼畜。过去曾经认为制备减活疫苗非常困难且价格昂贵以至不能生产和运输，然而，应用现有的知识，绝大多数的技术难题都能被克服。
1 照射减活疫苗的进展
1.1 照射减适幼虫疫苗的商业应用
尽管在宿主-寄生虫系统开展了大量有关减活幼虫疫苗的研究，并且很多系统表现出很高的保护力，但仅有3种疫苗用于商业生产。这种3种疫苗是：寄生于牛羊肺的胎生网尾线虫(Dictyocaulus viviparus)疫苗，寄生于牛羊肺的丝状网尾线虫(Dictyocaulus filaria)疫苗和犬钩虫(Ancylostoma caninum)疫苗。胎生网尾线虫疫苗自1959年已商品化。丝状网尾线虫疫苗自1965年首次报道后，东欧、中区、北亚等许多国家都有生产。1973年美国曾生产犬钩虫疫苗，虽然技术上取得了成功，但因为商业的原因它并未成为有利可图的产品，1975年已停止生产。
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1.2 肺线虫疫苗的历史
自1959年开始研究胎生网尾线虫疫苗，之后英国格拉斯哥的研究人员对利用照射减活的幼虫疫苗刺激免疫力方面进行了一系列的研究，40krad剂量的X线照射的幼虫，每次接种1000条，4周后再接种一次，对再感染能产生高水平的保护力。
二十世纪五十年代末，由网尾线虫引起的寄生虫性支气管炎对英国乳品加工业来说是很严重的问题，当时缺乏治疗及预防此病的药物，对此病的流行病学知识也不多，由于少量的虫荷即可引起发病，因而该病较易在短期内爆发流行而且难以控制。在这种背景下，疫苗的出现备受青睐并取得了可观的商业效益。
随后的三十年，出现了现代的抗蠕虫药物，使疫苗的优越性受到了影响。晚近，坚持利用药物作为预防胃肠道线虫和肺线虫感染的一个组成部分也进一步削弱了肺线虫疫苗的优越性。有些农场在大部分年份里能利用药物有效地控制家畜秋季肺线虫感染。然而，如果初冬天气温暖延迟家畜入室时间，仍会暴发肺线虫病。由于有效的药物防治，动物可能不会经历足够的低水平感染以产生并维持免疫力，因而成年牛仍会患肺线虫病。
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由于防治措施的有效性和病畜较过去得到了更有效的治疗，导致了胎生网尾线虫疫苗销售量下降，但随之而来是患寄生虫性支气管炎的家畜尤其是成年牛增多，尽管近年来疫苗产品销售量下降，但肺线虫疫苗仍然是最成功和最有利可图的。
1.3 有前途的照射减活幼虫疫苗
自牛肺线虫疫苗取得成功后，人们对类似的疫苗能迅速用于控制其它家畜寄生虫寄予很大希望，并在许多宿主-寄生虫系统进行了研究，包括捻转血矛线虫(Haemonchus contortus)、蛇形毛圆线虫(Trichostrangylus colubriformis)、寻常圆线虫(Strongylus vulgaris)、日本血吸虫和牛血吸虫。在减少虫荷方面，寻常圆线虫照射减活幼虫疫苗能使马产生92%的保护力，照射减活的捻转血矛线虫幼虫疫苗和毛圆线虫幼虫疫苗能使羊分别产生95%和88%以上的保护力。
然而，搥转血矛线虫疫苗仅对7月龄以上的动物产生较高的保护力，而且要求在疫苗接种前动物未受到该虫的感染，这意味着最易感的家畜的血矛线虫病流行区难以通过接种疫苗产生抵抗力。目前很少开展疫苗对成虫产卵方面的研究，减活疫苗有可能通过降低成虫产卵率，减轻牧场污染，减少幼年易感动物的感染机会。
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2 幼虫疫苗的制备及传送
2.1 幼虫的制备
有关照射减活幼虫疫苗争论的焦点之一是所需幼虫的数目。迄今为止，体外培养幼虫尚未取得成功，仍需保存感染的动物(对吸虫还需保存螺类中间宿主)来制备幼虫。
对捻转血矛线虫，每次接种10000条幼虫(假设每只动物接种2次，则需2000条幼虫)。假定人工感染捻转血矛线虫的羊每天产粪750克，每克粪便含2500个虫卵，虫卵孵化率为60%，那么每圈10只羊，每月一圈，一年所提供的幼虫足够接种200000头羊，此项费用并不太昂贵，也不需很高的技术。
幼虫培养和制备方法会影响疫苗的保存期。采用普通方法生产犬钩虫幼虫时，幼虫仅能存活2-4周，如果采用无菌培养技术，幼虫可存活12个月。值得一提的是，从粪便中分离的丝状网尾线虫的1期幼虫在水中培养到3期幼虫，这种疫苗的保存期仅为2周，而胎生网尾线虫幼虫在粪便中培养到3期幼虫，这种疫苗的保存期可达到6周。目前尚不清楚这种现象是虫种的不同还是培养方法的差异造成的。
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2.2 照射减活
对准备好的幼虫，需寻找合适的减活方法，近年来照射减活成为关注的焦点，其它方法如化学减活和基因调控法也是可能和值得研究的。文献中曾报道过3种照射减活方法：X射线法，γ射线法及紫外线法。早期牛肺线虫疫苗采用X射线照射减活，然而近年来γ射线法因为更方便而被大多数学者采用。紫外线照射已作为一种激活方法用于许多寄生虫疫苗的研究。
不同的学者采用的照射剂量不同，但40-60kard剂量是公认的制备线虫疫苗的有效剂量。温度和幼虫密度的稍许改变对减活的效果也会产生很大的影响。
2.3 接种途径
通常采用自然感染途径接种照射过的幼虫，改用其它途径也可能有效。例如，给牛口服胎生网尾线虫疫苗，与对照组相比，减虫率为96.6%，同样剂量采用皮下包埋法减虫率为97.8%。
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2.4 疫苗的包装及传送
因为幼虫能很快从水溶液中沉淀下来，故疫苗的包装问题是以前生产兽用产品过程中从未遇到过难题。粘性的或胶状的基质虽然是一种有效的分散剂，但在温度控制不够冷的包装中幼虫可能会从基质中移出。
对某些寄生虫而言，储存温度也很重要，犬钩虫疫苗要求保存在10-15℃。在选择包装材料时也会遇到一些问题，肺线虫疫苗一般是采用玻璃容器包装，但为降低邮寄和包装的费用曾尝试采用塑料包装，这种尝试因在包装过程中塑料携带的静电能使幼虫吸附瓶壁而失败。
2.5 许可证
目前尚无产品许可证所要求的具体条件。至少大多数国家要求提供疫苗的效果、安全性及质量保证、确保对环境及动物无危害，提供与其它方法联合应用无配伍禁忌及使用疫苗的禁忌症等方面的证据。
在犬钩虫疫苗申请许可证时曾建议疫苗在发放时应有2-4倍的安全限度，有效期满时应有2-4倍的有效限度，这意味给动物接种4倍剂量的疫苗也不会引起副作用，而1/4剂量即可达到保护效果。这可视为疫苗安全性和有效性的一条可取的标准。准备注册的疫苗需进行效果及安全性的剂量滴定试验。用实验所得数据计算最低有效剂量及最大安全剂量，将这些数据同幼虫存活衰减曲线和上述的4倍限度结合，就可计算出每个剂量幼虫的数目以及产品的有效期。
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如何确定疫苗的效果及最低有效范围。如牛肺线虫疫苗的目的就是预防临床症状的发生，因此使虫荷降低90%或95%是合适的。但对捻转血矛线虫并转而言，如果接种的目的是防止接种过的动物的后代或整个羊群患病，这个标准太严。因此，在申请疫苗生产许可证时需要清楚地阐明疫苗的作用。
质量保证需要提供感染性、减活、安全及无菌等方面的证据。牛肺线虫疫苗的感染性及减活程度可通过接种豚鼠来确定，在皮肤接种疫苗2天后，在豚鼠体内应找到幼虫以证明疫苗有感染性，10天后豚鼠体内应找不到幼虫以证明疫苗已被减活。安全性最好通过观察接种2-4倍剂量疫苗的动物来判定。
对无菌的判断标准是不断变化的。最初，对犬钩虫疫苗要求不含一些特殊的病原体，以后是要求犬钩虫疫苗应该象其它疫苗一样不含任何微生物。通过处理虫卵及改用无菌培养技术，疫苗可达到无菌的要求。英国对牛肺线虫疫苗的要求是不含一些特殊的病原体。
网尾线虫幼虫在体外培养时不需喂食，因此，其体表甚至鞘膜内层都能很容易地保持无菌。但未脱鞘的3期幼虫因其体内的其它寄生虫可能含有细菌，因此很难做到无菌。在无菌条件下孵化和培养幼虫可以解决这一问题。
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利用供体动物提供幼虫将损伤动物，受感染动物的后果也应予考虑。肺部寄生虫较胃肠道寄生虫更易引起供体动物患病，虫荷及供体动物数目间的平衡也是值得考虑的问题。
照射减活疫苗较其他疫苗，特别是化学疫苗较少引起环境问题。在相邻国家为防止疫苗交易出现的问题，当局可能要求出示疫苗已安全减活的证明以防止变异的寄生虫在别国传播。
需在某些宿主-寄生虫系统仔细地研究同其它疫苗及治疗方法的相容性，例如，在接种照射减活的丝状网尾线虫疫苗和捻转血矛线虫疫苗时使用抗蠕虫药可能会干扰免疫力的产生。同样，接种时动物的疾病状况可能会影响以后的接种计划。这些问题对准备接种疫苗的成年家畜可能更重要。
3 结 语
同其它大多数兽用产品一样，照射减活的幼虫疫苗仍需克服科学发现与商业应用之间的许多困难。考虑到市场、产品的有效期、其它控制疾病方法的进展和农民对产品的认识等问题，照射减活疫苗可能因销售量太少而不会引起大公司的生产兴趣。但较小规模的公司开发这方面的市场仍存在好的机遇，因为生产这种疫苗技术简单，生产费用也不象分子疫苗那样昂贵。
, 百拇医药
主要参考文献
1 Munn EA.Int J Parasitol,1997;45(5):359-366
2 Barnes ER EH.Parasitol Today,1995;11(2):56-63
3 Newton SE.Int J Parastiol,1995;25(10):1281-1289
4 Gray GD.Veter Parasitol,1997;72(3-4):345-366
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