干扰素对膀胱肿瘤细胞膜TNFR表达的影响
作者：王军起 连保罗 谢叔良 温儒民
单位：徐州医学院附属医院泌尿外科，江苏徐州，221002
关键词：膀胱肿瘤；BIU-87细胞株；肿瘤坏死因子受体；干扰素
临床泌尿外科杂志000411 摘要 目的：探讨用干扰素治疗膀胱肿瘤时对膀胱肿瘤细胞膜肿瘤坏死因子受体(TNFR)表达的影响。方法：用放射配基结合分析法检测α和γ干扰素分别作用于膀胱癌BIU-87细胞前后细胞膜TNFR的变化。结果：膀胱肿瘤细胞膜存在TNFR，受体的特异性结合量与干扰素浓度和作用时间关系密切；γ干扰素对受体表达的影响大于α干扰素。结论：干扰素可以使膀胱肿瘤细胞膜TNFR的表达增加，从而使免疫治疗后高表达的TNF可以与肿瘤细胞膜受体更好地结合，以产生细胞毒作用，杀灭肿瘤细胞。
Expression of tumor necrosis factor receptors on bladder carcinoma cells induced by interferon
, http://www.100md.com
WANG Jun-qi LIAN Bao-luo XIE Shu-liang WEN Ru-ming
(Department of Urology, the Affiliated Hospital of Xuzhou Medical College, Xuzhou Jiangsu, 221002)
Abstract Purpose: To undersrand the expression of tumor necrosis factor receptors on bladder carcinoma cells induced by interferon. Methods: The tumor necrosis factor receptors (TNFR) were detected on cultured human bladder carcinoma cells by radiological binding assay (RBA). Results: The results showed there existed TNFR in membrane of bladder carcinoma cells. The number of TNFR was increasing with the concentration of interferon(alpha or beta) and cultured days raises. Conclusions: It suggested that interferon can induce the expression of TNFR in bladder tumor cells to make TNF develop its function to kill tumor cells.
, 百拇医药
Key words Bladder neoplasms BIU-87 cells Tumor necrosis factor receptors Interferon
肿瘤坏死因子(TNF)是由单核巨噬细胞产生的抗肿瘤因子，具有较强的抗肿瘤功效，免疫治疗后可增加其表达，但TNF必须与肿瘤细胞膜的肿瘤坏死因子受体(TNFR)结合才能发挥生物学功能。因此，肿瘤细胞膜上必须具有TNFR才能发挥TNF的抗肿瘤功能。本实验研究了膀胱肿瘤细胞膜TNFR及干扰素对它的影响，现将结果报告如下。
1 材料与方法
1.1 实验材料
选用人膀胱癌BIU-87细胞株(由北京医科大学泌尿外科研究所提供)及RPMI 1640培养基(GIBCO)。重组人肿瘤坏死因子(rhTNFα)、125I标记的肿瘤坏死因子(125I-TNFα，比活度为259×1010 Bq/g)均由北京原子能研究院提供，实验用干扰素(α和γ干抗素)由北京邦定生物医学公司提供。
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1.2 实验方法
膀胱癌BIU-87细胞膜TNFR的测定：调整肿瘤细胞至适当浓度。取1.5×106肿瘤细胞于反应管中，加入终末浓度依次递增的用缓冲液(含0.1%BSA的0.05 mol/L Tris-HCl溶液)稀释的125I-TNFα(范围为0.1～3.0 ng)。总反应体积为400 μl，每个浓度设3个复管，于4℃反应120 min，8 000 r/min离心10 min，去上清液，沉淀后用冷缓冲液洗2遍再用γ计数器测放射强度。非特异结合是在上述方法基础上加入非标记TNFα，使其终末浓度为标记TNFα的1 000倍。
干扰素作用后BIU-87细胞膜TNFR的测定：将生长旺盛的肿瘤细胞传代分瓶后，用含有α和γ干扰素[浓度分别为(10、100、1 000、2 000)×103 U/L]的RPMI 1640培养基分别予以培养，其中浓度为100×103 U/L的培养基分别培养5、10、15、20、25 h，浓度为(10、1 000、2 000)×103 U/L的培养基均培养15 h，按时收获细胞并计数，同上法测定细胞膜受体的放射强度。
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2 结果
2.1 膀胱肿瘤细胞膜表面TNFR的表达
膀胱肿瘤细胞膜表面存在着TNFR。用放射配基结合分析法〔1〕进行分析，其结合曲线呈饱和双曲线，Scatchard分析作图为一直线，说明膜表面存在一种亲和力的结合位点，其解离常数为0.25 nmol/L，受体数目每个细胞约为869个结合位点。
2.2 干扰素对膀胱肿瘤细胞膜TNFR表达的影响
α和γ干扰素均可明显增加膀胱肿瘤细胞膜TNFR的数目，TNFR的特异性结合量(B)随着干扰素浓度的增加而增加，并随着干扰素作用时间的延长而升高，以15 h为最大，且γ干扰素对TNFR表达的影响要大于α干扰素(图1，2)。
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图1 干扰素作用时间对受体表达的影响
图2 干扰素浓度变化对受体表达的影响
3 讨论
膀胱肿瘤患者免疫功能低下，且术后不能自主恢复，故术后仍需积极进行免疫治疗以预防肿瘤复发。干扰素作为一种免疫调节剂，已广泛用于临床，其中用于膀胱肿瘤的治疗已取得良好的疗效〔2〕。
干扰素主要通过抗增殖，抑制癌基因表达，促进细胞因子释放，调节T、B淋巴细胞和NK细胞活性来发挥抗癌作用。干扰素有多种类型，常用的主要为α和γ干扰素。刘子栋等〔3〕用α干扰素行膀胱灌注治疗膀胱癌，显著提高了患者NK细胞毒因子的水平，改善了机体的细胞免疫功能。用PCR技术检测发现膀胱肿瘤细胞内有TNF的mRNA，说明该细胞可以产生TNF〔4〕。Zhang等〔5〕用干扰素作用于体外培养的膀胱肿瘤细胞株，在所培养的上清液中检测到TNF的表达，而干扰素作用后，其表达显著增加，认为干扰素可以阻止肿瘤细胞从S期进入G2期，其细胞毒性及抗增殖活性可能与TNF有关。这说明TNF在干扰素治疗膀胱肿瘤时具有重要作用。
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TNF可以直接或间接破坏肿瘤细胞，其作用的发挥有赖于与肿瘤细胞膜上TNFR的结合。这种结合过程极为重要，因为把TNF直接注入细胞内则无细胞毒性作用，因而要求靶细胞膜上必须存在TNFR。本实验结果表明，膀胱肿瘤细胞膜表面存在TNFR，且干扰素可以诱导该受体表达的增加。其机制主要是由于干扰素促进了受体蛋白的合成。干扰素的这种作用可能是其用于治疗肿瘤的机制之一。其受体数的增加与干扰素的浓度关系密切，为临床用药剂量的确定提供了理论依据。
虽然各种干扰素都能影响细胞膜受体的表达，但对不同的肿瘤细胞，其作用并不相同。如在Hela细胞，α、β、γ干扰素均可诱导TNFR表达增加，而在结肠癌HT-29细胞，只有γ干扰素可以增加TNFR表达，α、β干扰素均无此作用〔6〕。本实验结果表明，α和γ干扰素均可诱导膀胱肿瘤细胞膜TNFR的表达增加，γ干扰素的作用大于α干扰素。这一结果为临床选择干扰素的类型提供了依据。
值得注意的是，有一些肿瘤细胞膜表面无TNFR，或虽存在受体，但对TNF的细胞毒性作用可完全耐受，且不能被干扰素等生物反应调节剂所诱导〔7〕。对于这类肿瘤，免疫治疗的效果可能会不理想。
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参考文献
[1]夏宗勤主编.试验核医学与核药学.上海：同济大学出版社，1989.220～222
[2]Kostakopoulos A,Deliveliotis C H,Mavromanolakis E,et al.Intravesical interferon alfa-2b administration in the treatment of superficial bladder tumors.Eur Urol,1990,18:201～206
[3]刘子栋，谢叔良.干扰素膀胱内灌注对自然杀伤细胞毒因子的影响.中华泌尿外科杂志，1991，12：273～274
[4]Kaashoek J G J,Mout R,Falkenburg J H F,et al.Cytokine production by the bladder carcinoma cell line 5637:rapid analysis of mRNA expression levels using a cDNA-PCR procedure.Lymphokine and Cytokine,1991,10:231～236
, 百拇医药
[5]Zhang Y,Khee H E,Esuvaranathan K.Effects of BCG and interferon alpha-2b on human bladder cancer in vitro.Int J Cancer,1997,71:851～856
[6]Tsujimoto M,Yip Y K,Vilcek J.Interferon-gama enhances expression of cellular receptors for tumor necrosis factor.J Immunol,1986,136:2441～2446
[7]Tsujimoto M,Yip Y K,Vilcek J.Tumor necrosis factor:specific binding and internalization in sensitive and resistant cells.Proc Natl Acad Sci USA,1985,82:7626～7628
收稿 1999-03-05, 百拇医药
单位：徐州医学院附属医院泌尿外科，江苏徐州，221002
关键词：膀胱肿瘤；BIU-87细胞株；肿瘤坏死因子受体；干扰素
临床泌尿外科杂志000411 摘要 目的：探讨用干扰素治疗膀胱肿瘤时对膀胱肿瘤细胞膜肿瘤坏死因子受体(TNFR)表达的影响。方法：用放射配基结合分析法检测α和γ干扰素分别作用于膀胱癌BIU-87细胞前后细胞膜TNFR的变化。结果：膀胱肿瘤细胞膜存在TNFR，受体的特异性结合量与干扰素浓度和作用时间关系密切；γ干扰素对受体表达的影响大于α干扰素。结论：干扰素可以使膀胱肿瘤细胞膜TNFR的表达增加，从而使免疫治疗后高表达的TNF可以与肿瘤细胞膜受体更好地结合，以产生细胞毒作用，杀灭肿瘤细胞。
Expression of tumor necrosis factor receptors on bladder carcinoma cells induced by interferon
, http://www.100md.com
WANG Jun-qi LIAN Bao-luo XIE Shu-liang WEN Ru-ming
(Department of Urology, the Affiliated Hospital of Xuzhou Medical College, Xuzhou Jiangsu, 221002)
Abstract Purpose: To undersrand the expression of tumor necrosis factor receptors on bladder carcinoma cells induced by interferon. Methods: The tumor necrosis factor receptors (TNFR) were detected on cultured human bladder carcinoma cells by radiological binding assay (RBA). Results: The results showed there existed TNFR in membrane of bladder carcinoma cells. The number of TNFR was increasing with the concentration of interferon(alpha or beta) and cultured days raises. Conclusions: It suggested that interferon can induce the expression of TNFR in bladder tumor cells to make TNF develop its function to kill tumor cells.
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Key words Bladder neoplasms BIU-87 cells Tumor necrosis factor receptors Interferon
肿瘤坏死因子(TNF)是由单核巨噬细胞产生的抗肿瘤因子，具有较强的抗肿瘤功效，免疫治疗后可增加其表达，但TNF必须与肿瘤细胞膜的肿瘤坏死因子受体(TNFR)结合才能发挥生物学功能。因此，肿瘤细胞膜上必须具有TNFR才能发挥TNF的抗肿瘤功能。本实验研究了膀胱肿瘤细胞膜TNFR及干扰素对它的影响，现将结果报告如下。
1 材料与方法
1.1 实验材料
选用人膀胱癌BIU-87细胞株(由北京医科大学泌尿外科研究所提供)及RPMI 1640培养基(GIBCO)。重组人肿瘤坏死因子(rhTNFα)、125I标记的肿瘤坏死因子(125I-TNFα，比活度为259×1010 Bq/g)均由北京原子能研究院提供，实验用干扰素(α和γ干抗素)由北京邦定生物医学公司提供。
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1.2 实验方法
膀胱癌BIU-87细胞膜TNFR的测定：调整肿瘤细胞至适当浓度。取1.5×106肿瘤细胞于反应管中，加入终末浓度依次递增的用缓冲液(含0.1%BSA的0.05 mol/L Tris-HCl溶液)稀释的125I-TNFα(范围为0.1～3.0 ng)。总反应体积为400 μl，每个浓度设3个复管，于4℃反应120 min，8 000 r/min离心10 min，去上清液，沉淀后用冷缓冲液洗2遍再用γ计数器测放射强度。非特异结合是在上述方法基础上加入非标记TNFα，使其终末浓度为标记TNFα的1 000倍。
干扰素作用后BIU-87细胞膜TNFR的测定：将生长旺盛的肿瘤细胞传代分瓶后，用含有α和γ干扰素[浓度分别为(10、100、1 000、2 000)×103 U/L]的RPMI 1640培养基分别予以培养，其中浓度为100×103 U/L的培养基分别培养5、10、15、20、25 h，浓度为(10、1 000、2 000)×103 U/L的培养基均培养15 h，按时收获细胞并计数，同上法测定细胞膜受体的放射强度。
, 百拇医药
2 结果
2.1 膀胱肿瘤细胞膜表面TNFR的表达
膀胱肿瘤细胞膜表面存在着TNFR。用放射配基结合分析法〔1〕进行分析，其结合曲线呈饱和双曲线，Scatchard分析作图为一直线，说明膜表面存在一种亲和力的结合位点，其解离常数为0.25 nmol/L，受体数目每个细胞约为869个结合位点。
2.2 干扰素对膀胱肿瘤细胞膜TNFR表达的影响
α和γ干扰素均可明显增加膀胱肿瘤细胞膜TNFR的数目，TNFR的特异性结合量(B)随着干扰素浓度的增加而增加，并随着干扰素作用时间的延长而升高，以15 h为最大，且γ干扰素对TNFR表达的影响要大于α干扰素(图1，2)。
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图1 干扰素作用时间对受体表达的影响
图2 干扰素浓度变化对受体表达的影响
3 讨论
膀胱肿瘤患者免疫功能低下，且术后不能自主恢复，故术后仍需积极进行免疫治疗以预防肿瘤复发。干扰素作为一种免疫调节剂，已广泛用于临床，其中用于膀胱肿瘤的治疗已取得良好的疗效〔2〕。
干扰素主要通过抗增殖，抑制癌基因表达，促进细胞因子释放，调节T、B淋巴细胞和NK细胞活性来发挥抗癌作用。干扰素有多种类型，常用的主要为α和γ干扰素。刘子栋等〔3〕用α干扰素行膀胱灌注治疗膀胱癌，显著提高了患者NK细胞毒因子的水平，改善了机体的细胞免疫功能。用PCR技术检测发现膀胱肿瘤细胞内有TNF的mRNA，说明该细胞可以产生TNF〔4〕。Zhang等〔5〕用干扰素作用于体外培养的膀胱肿瘤细胞株，在所培养的上清液中检测到TNF的表达，而干扰素作用后，其表达显著增加，认为干扰素可以阻止肿瘤细胞从S期进入G2期，其细胞毒性及抗增殖活性可能与TNF有关。这说明TNF在干扰素治疗膀胱肿瘤时具有重要作用。
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TNF可以直接或间接破坏肿瘤细胞，其作用的发挥有赖于与肿瘤细胞膜上TNFR的结合。这种结合过程极为重要，因为把TNF直接注入细胞内则无细胞毒性作用，因而要求靶细胞膜上必须存在TNFR。本实验结果表明，膀胱肿瘤细胞膜表面存在TNFR，且干扰素可以诱导该受体表达的增加。其机制主要是由于干扰素促进了受体蛋白的合成。干扰素的这种作用可能是其用于治疗肿瘤的机制之一。其受体数的增加与干扰素的浓度关系密切，为临床用药剂量的确定提供了理论依据。
虽然各种干扰素都能影响细胞膜受体的表达，但对不同的肿瘤细胞，其作用并不相同。如在Hela细胞，α、β、γ干扰素均可诱导TNFR表达增加，而在结肠癌HT-29细胞，只有γ干扰素可以增加TNFR表达，α、β干扰素均无此作用〔6〕。本实验结果表明，α和γ干扰素均可诱导膀胱肿瘤细胞膜TNFR的表达增加，γ干扰素的作用大于α干扰素。这一结果为临床选择干扰素的类型提供了依据。
值得注意的是，有一些肿瘤细胞膜表面无TNFR，或虽存在受体，但对TNF的细胞毒性作用可完全耐受，且不能被干扰素等生物反应调节剂所诱导〔7〕。对于这类肿瘤，免疫治疗的效果可能会不理想。
, 百拇医药
参考文献
[1]夏宗勤主编.试验核医学与核药学.上海：同济大学出版社，1989.220～222
[2]Kostakopoulos A,Deliveliotis C H,Mavromanolakis E,et al.Intravesical interferon alfa-2b administration in the treatment of superficial bladder tumors.Eur Urol,1990,18:201～206
[3]刘子栋，谢叔良.干扰素膀胱内灌注对自然杀伤细胞毒因子的影响.中华泌尿外科杂志，1991，12：273～274
[4]Kaashoek J G J,Mout R,Falkenburg J H F,et al.Cytokine production by the bladder carcinoma cell line 5637:rapid analysis of mRNA expression levels using a cDNA-PCR procedure.Lymphokine and Cytokine,1991,10:231～236
, 百拇医药
[5]Zhang Y,Khee H E,Esuvaranathan K.Effects of BCG and interferon alpha-2b on human bladder cancer in vitro.Int J Cancer,1997,71:851～856
[6]Tsujimoto M,Yip Y K,Vilcek J.Interferon-gama enhances expression of cellular receptors for tumor necrosis factor.J Immunol,1986,136:2441～2446
[7]Tsujimoto M,Yip Y K,Vilcek J.Tumor necrosis factor:specific binding and internalization in sensitive and resistant cells.Proc Natl Acad Sci USA,1985,82:7626～7628
收稿 1999-03-05, 百拇医药