蛋白激酶C在糖尿病血管并发症中的调控作用及其检测
作者：童嘉毅 刘乃丰
单位：童嘉毅(210009 南京铁道医学院附属医院心内科); 刘乃丰(210009 南京铁道医学院附属医院心内科)
关键词：
江苏医药000419 蛋白激酶C(PKC)是一种重要的丝氨酸苏氨酸(Ser/Thr)激酶，1977年被Nishizuka等首先发现，它是依赖Ca2+/磷脂(PL)的蛋白激酶，是PI信号转导系统中的一个中心环节。随着国内外研究的不断深入，人们已经对糖尿病慢性血管并发症的发生机理有了越来越多的认识。最近大量研究表明，信号分子甘油二酯(DAG)的含量增加和PKC的激活与糖尿病的视网膜、肾脏、心血管组织病变等有密切联系，在糖尿病血管并发症的发生发展中PKC具有重要的调控作用[1]。PKC作用与细胞增殖粘附及通透性、细胞外基质形成等有密切关系，而这些方面正是糖尿病血管病变涉及到的病理机制。本文将就此作一综述，这对了解糖尿病血管病变的分子机制有重要意义。
, 百拇医药
一、蛋白激酶C的结构与亚型
通过分子克隆方法证明，PKC不是单一分子的酶，而是一组密切相关的有多种亚型的蛋白质家族[2]。PKC为一条多肽链，其结构分为高度同源性的四个保守区(C1～C4)，低度同源性的五个可变区(V1～V5)。C3、C4区为激酶活性区，C3区含有ATP的特定结构，该区有酶的催化作用；C4区起识别底物的作用；C1区有Ca2+、DAG、佛波酯等的结合点，是酶的调节区；C2区可能是酶对Ca2+敏感性所需要的。PKC家族包括至少11种异构体(α、β1、β2、γ、δ、ε、ζ、η、θ、λ、μ)，一般分成三类：cPKC(α、β1、β2、γ)，nPKC(δ、ε、η、θ、μ)，aPKC(ζ、λ)。cPKC激活需要Ca2+/PS、DAG的参与，而nPKC无C2区，故激活需要DAG，但不依赖Ca2+；aPKC则对DAG也不敏感，主要被PS激活。PKC有组织和种属特异性，11种亚类在各自细胞中的分布和作用各不相同，有着广泛的生理功能。
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二、蛋白激酶C在糖尿病血管病变中调控的可能机制
PKC对调节血管的通透性、收缩性、胞外基质的生成、细胞粘附等有重要意义，而这些方面都是糖尿病血管并发症的病理生理变化，因而国内外学者对此做了许多研究，大致可总结为以下几方面：
1.PKC与血管通透性
研究发现，糖尿病的早期(4～6周)就可以发现血管内皮细胞对白蛋白的通透性增强，这可能是糖尿病出现慢性血管病变的病理机制之一[3]。Oliver等发现PKC激活后白蛋白及其他的小分子物质透过内皮细胞的能力明显增加[4]。PKC激活可能促进VEGF/VPF等因子的表达，从而调节血管的通透性，应用PKC的抑制剂则减少了内皮细胞的通透性以及内皮的增殖效应[5]。因此可以推测，通过对血管的通透性调节，PKC在糖尿病血管病变的发生中有重要的调控作用。
, 百拇医药
2.PKC与血流量及血管收缩性
在糖尿病人，血流量及血管收缩性出现异常，而PKC的活性增高可能是导致血管收缩、血流量减少的分子机制之一。最近，Ishii等在糖尿病动物实验中应用PKC抑制剂，结果发现已减少的肾脏血流量得到恢复[6]，这也反映了在糖尿病发展过程中细胞内PKC的激活与血管收缩、血流量减少的病理变化有关联。目前认为，PKC对血流量和血管收缩性的影响可能是由于促进内皮素的分泌增多和一氧化氮产生减少所致，而内皮素和一氧化氮分别有收缩及舒张血管的作用[7～8]。
3.PKC与细胞外基质(ECM)
在组织学上可以观察到糖尿病人肾小球膜上的Ⅳ、Ⅵ型胶原、纤粘蛋白等ECM含量均有所增加，高糖的状态下可以诱导出这种改变，当使用PKC抑制剂后则对ECM生成起到了阻断作用，这说明ECM的生成是PKC激活后的一种细胞效应[9]。糖尿病血管功能障碍如通透性、细胞粘附、细胞分化等都与ECM含量变化有关，所以糖尿病血管病变在发展的分子机制上受到了细胞PKC的调节，与增高的PKC活性可能有关。
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4.PKC与Na+-K+-ATP酶
Na+-K+-ATP酶是细胞的钠泵，涉及到细胞的完整性、细胞的生长分化等功能。研究已经发现，在糖尿病的高血糖状态下，Na+-K+-ATP酶活性明显减弱，PKC的抑制剂则能阻断这种效应[10]。这就提示在细胞信号转导中，PKC是调节Na+-K+-ATP酶活力的上游信号分子，PKC的活性增加是Na+-K+-ATP酶活力减低的一个原因。PKC通过对钠泵的调节，影响细胞的生长等，调控了糖尿病血管病变的发生发展。
三、PKC生物活性的检测
为了深入的对PKC进行研究，需要测定PKC的活性变化，包括定位、定亚型等。目前检测PKC的方法主要有以下几种：
, 百拇医药
1.催化活性测定[11]
PKC催化的蛋白磷酸化反应是将ATP分子位的磷酸转移到底物蛋白分子上。采用γ-32P-ATP为提供磷酸的物质，组蛋白等作为接受磷酸的底物，DAG等为反应激活剂，在PKC作用下，发生蛋白磷酸化反应，通过测定底物蛋白参入的放射强度来反映PKC活性。目前应用此方法较多，因为其操作相对简单且灵敏度高，市场上测定PKC活性的试剂盒也大多利用此法的机理，操作起来也较方便。该方法主要测定细胞内总的PKC活性，缺点是不能明确PKC亚型。
2.Western Blotting法[12]
首先利用梯度离心方法分离细胞质和细胞膜，分别收集待用，样品经蛋白分离系统离析得PKC后，再经电泳转膜后，与特异性PKC亚型抗体孵育，最后再用二抗结合并染色，用密度仪记数。此法是目前比较先进的检测PKC的手段，可以定位定量并区分亚型。缺点是所需设备和相应抗体价格较贵。
, 百拇医药
3.佛波酯结合测定法[13]
佛波酯是PKC的激活物，与PKC有高度的亲和性和饱和性。目前认为PKC是佛波酯的受体，采用3H标记的二丁酰佛波作为配基，测定其结合点，以结合点数高低反映PKC活性。此方法的测定值稳定，最大的优点是样品可以是完整的活细胞，便于使用药物干预操作。
4.免疫细胞化学法[14]
首先细胞化学方法固定，再利用免疫学原理，选择PKC抗体与带有荧光标记的二抗先后孵育，最后根据荧光特性，利用特殊的图像系统来分析。此法可以对细胞PKC定位、定型，但因价格昂贵，目前应用不广泛。
5.其他方法
目前应用较少的如非同位素酶解测定法[15]，即通过测定ATP的消耗量来确定PKC的活力。此法优点是价格相对便宜，但干扰因素可能较多；底物蛋白磷酸化测定法[16]，即利用某些细胞内含有PKC特异性底物蛋白，如血小板中的40KDa蛋白，将这些蛋白的磷酸化作为细胞内PKC激活的标记，测定这些蛋白磷酸化的程度就可以计算PKC的相对活性，该方法仅用于特殊蛋白质。
, 百拇医药
总之，PKC是糖尿病血管并发症发生分子机制中的重要环节。越来越多的实验证实PKC抑制剂对延缓糖尿病血管病变的发生起作用，进一步的找到有效、可长期应用、副作用小的PKC抑制剂已成为研究的方向[17]。探索PKC在糖尿病血管并发症中的作用机制对揭示糖尿病的病理发展过程有积极的意义。
参考文献：
1，George L K，Teruo S，Javier O，et al.Cellular and molecular abnormalities in the vascular endothelium of diabetes mellitus.Annu Rev med，1994，45：179-188.
2，Huang KP.Role of protein kinase C in cellular regulation.Biofactors，1990，2：171-178.
, 百拇医药
3，Williamson JR，Chang K，Tilton RG，et al.Increased vascular permeability in spontaneously diabetic BB/W rats and in rats with mild versus severe streprozocin-induced diabetes.Diabetes，1987，36：813-821.
4，Oliver JA.Adenylate cyclase and protein kinase C mediate opposite actions on endothelial junctions.J Cell Physiol，1990，145：536-542.
5，Xia P，Aiello LP，Ishii H，et al.Characterization of vascular endothelial growth factors effect on the activation of protein kinase C，its isoforms，and endothelial cell growth.J clin Invest，1996，98：2018-2026.
, 百拇医药
6，Ishii H，Jirousek MR，Koya D，et al.Amelioration of vascular dysfunctions in diabetic rats by an oral PKC β inhibitor.Science，1996，272：728-731.
7，Takagi C，Bursell SE，Lin YW，et al.Regulation of retinal hemodynamics in diabetic rats by increased expression and action of endothelin-1.Invest Ophthalmol Vis Sci，1996，37：2504-2518.
8，Muniyappa R，Srinivas PR，Ram JL，et al.Calcium and protein kinase C mediate high-glucose-induced inhibition of inducible nitric oxide synthase in vascular smooth muscle cells.Hypertension，1998，31：289-295.
, 百拇医药
9，Kikkawa R，Haneda M，Uzu T，et al.Translocation of protein kinase α and ζ in rat glomerular mesangial cells cultured under high glucose conditions.Diabetologia，1994，37：838-841.
10，Xia P，Kramer RM，King GL.Identification of the mechanism for the inhibition of Na+-K+ adenosine triphosphatase by hyperglycemia involving activation of protein kinase C and cytosolic phospholipase A2.J Clin Invest，1995，96：733-740.
, http://www.100md.com 11，Heasley LE，Johnson GL.Regulation of protein kinase C by nerve growth factor，epidermal growth factor，and phorbol esters in PC12 pheochromocytoma cells.J Biol Chem，1989，264：8646-8652.
12，Haller H，Lindschau C，Quass P，et al.Platelet-derived growth factor and angiotensin Ⅱ induce different spatial distribution of protein kinase C alpha and beta in vascular smooth muscle cells.Hypertension，1994，23：848-852.
13，Uchida T，Fiburn CR.Affinity chromatography of protein kinase C phorbol ester receptor on polyacrylamide-immobilized phosphatidylserine.J Biol Cem，1984，259：12311-12314.
, http://www.100md.com
14，Haller H，Baur E，Quass P，et al.High glucose concentrations and protein kinase C isoforms in vascular smooth muscle cells.Kidney International，1995，47：1057-1067.
15，张泽林，刘燕燕，卢波，等.蛋白激酶C活力的非同位素酶解测定法.生物化学与生物物理进展，1992，19：219-222.
16，Willigen GV，Akkerman JW.Protein kinase C and cyclic AMP regulate reversible exposure of binding sites for fibrinogen on the glycoprotein ⅡB-ⅢA complex of human platelets.Biochem J，1991，273：115.
17，Lewis EJ，Hunsicker LG，Bain RP，et al.The effect of angiotensin converting enzyme inhibitor on diabetic nephropathy.N Engl J Med，1993，329：1456-1462., 百拇医药
单位：童嘉毅(210009 南京铁道医学院附属医院心内科); 刘乃丰(210009 南京铁道医学院附属医院心内科)
关键词：
江苏医药000419 蛋白激酶C(PKC)是一种重要的丝氨酸苏氨酸(Ser/Thr)激酶，1977年被Nishizuka等首先发现，它是依赖Ca2+/磷脂(PL)的蛋白激酶，是PI信号转导系统中的一个中心环节。随着国内外研究的不断深入，人们已经对糖尿病慢性血管并发症的发生机理有了越来越多的认识。最近大量研究表明，信号分子甘油二酯(DAG)的含量增加和PKC的激活与糖尿病的视网膜、肾脏、心血管组织病变等有密切联系，在糖尿病血管并发症的发生发展中PKC具有重要的调控作用[1]。PKC作用与细胞增殖粘附及通透性、细胞外基质形成等有密切关系，而这些方面正是糖尿病血管病变涉及到的病理机制。本文将就此作一综述，这对了解糖尿病血管病变的分子机制有重要意义。
, 百拇医药
一、蛋白激酶C的结构与亚型
通过分子克隆方法证明，PKC不是单一分子的酶，而是一组密切相关的有多种亚型的蛋白质家族[2]。PKC为一条多肽链，其结构分为高度同源性的四个保守区(C1～C4)，低度同源性的五个可变区(V1～V5)。C3、C4区为激酶活性区，C3区含有ATP的特定结构，该区有酶的催化作用；C4区起识别底物的作用；C1区有Ca2+、DAG、佛波酯等的结合点，是酶的调节区；C2区可能是酶对Ca2+敏感性所需要的。PKC家族包括至少11种异构体(α、β1、β2、γ、δ、ε、ζ、η、θ、λ、μ)，一般分成三类：cPKC(α、β1、β2、γ)，nPKC(δ、ε、η、θ、μ)，aPKC(ζ、λ)。cPKC激活需要Ca2+/PS、DAG的参与，而nPKC无C2区，故激活需要DAG，但不依赖Ca2+；aPKC则对DAG也不敏感，主要被PS激活。PKC有组织和种属特异性，11种亚类在各自细胞中的分布和作用各不相同，有着广泛的生理功能。
, 百拇医药
二、蛋白激酶C在糖尿病血管病变中调控的可能机制
PKC对调节血管的通透性、收缩性、胞外基质的生成、细胞粘附等有重要意义，而这些方面都是糖尿病血管并发症的病理生理变化，因而国内外学者对此做了许多研究，大致可总结为以下几方面：
1.PKC与血管通透性
研究发现，糖尿病的早期(4～6周)就可以发现血管内皮细胞对白蛋白的通透性增强，这可能是糖尿病出现慢性血管病变的病理机制之一[3]。Oliver等发现PKC激活后白蛋白及其他的小分子物质透过内皮细胞的能力明显增加[4]。PKC激活可能促进VEGF/VPF等因子的表达，从而调节血管的通透性，应用PKC的抑制剂则减少了内皮细胞的通透性以及内皮的增殖效应[5]。因此可以推测，通过对血管的通透性调节，PKC在糖尿病血管病变的发生中有重要的调控作用。
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2.PKC与血流量及血管收缩性
在糖尿病人，血流量及血管收缩性出现异常，而PKC的活性增高可能是导致血管收缩、血流量减少的分子机制之一。最近，Ishii等在糖尿病动物实验中应用PKC抑制剂，结果发现已减少的肾脏血流量得到恢复[6]，这也反映了在糖尿病发展过程中细胞内PKC的激活与血管收缩、血流量减少的病理变化有关联。目前认为，PKC对血流量和血管收缩性的影响可能是由于促进内皮素的分泌增多和一氧化氮产生减少所致，而内皮素和一氧化氮分别有收缩及舒张血管的作用[7～8]。
3.PKC与细胞外基质(ECM)
在组织学上可以观察到糖尿病人肾小球膜上的Ⅳ、Ⅵ型胶原、纤粘蛋白等ECM含量均有所增加，高糖的状态下可以诱导出这种改变，当使用PKC抑制剂后则对ECM生成起到了阻断作用，这说明ECM的生成是PKC激活后的一种细胞效应[9]。糖尿病血管功能障碍如通透性、细胞粘附、细胞分化等都与ECM含量变化有关，所以糖尿病血管病变在发展的分子机制上受到了细胞PKC的调节，与增高的PKC活性可能有关。
, http://www.100md.com
4.PKC与Na+-K+-ATP酶
Na+-K+-ATP酶是细胞的钠泵，涉及到细胞的完整性、细胞的生长分化等功能。研究已经发现，在糖尿病的高血糖状态下，Na+-K+-ATP酶活性明显减弱，PKC的抑制剂则能阻断这种效应[10]。这就提示在细胞信号转导中，PKC是调节Na+-K+-ATP酶活力的上游信号分子，PKC的活性增加是Na+-K+-ATP酶活力减低的一个原因。PKC通过对钠泵的调节，影响细胞的生长等，调控了糖尿病血管病变的发生发展。
三、PKC生物活性的检测
为了深入的对PKC进行研究，需要测定PKC的活性变化，包括定位、定亚型等。目前检测PKC的方法主要有以下几种：
, 百拇医药
1.催化活性测定[11]
PKC催化的蛋白磷酸化反应是将ATP分子位的磷酸转移到底物蛋白分子上。采用γ-32P-ATP为提供磷酸的物质，组蛋白等作为接受磷酸的底物，DAG等为反应激活剂，在PKC作用下，发生蛋白磷酸化反应，通过测定底物蛋白参入的放射强度来反映PKC活性。目前应用此方法较多，因为其操作相对简单且灵敏度高，市场上测定PKC活性的试剂盒也大多利用此法的机理，操作起来也较方便。该方法主要测定细胞内总的PKC活性，缺点是不能明确PKC亚型。
2.Western Blotting法[12]
首先利用梯度离心方法分离细胞质和细胞膜，分别收集待用，样品经蛋白分离系统离析得PKC后，再经电泳转膜后，与特异性PKC亚型抗体孵育，最后再用二抗结合并染色，用密度仪记数。此法是目前比较先进的检测PKC的手段，可以定位定量并区分亚型。缺点是所需设备和相应抗体价格较贵。
, 百拇医药
3.佛波酯结合测定法[13]
佛波酯是PKC的激活物，与PKC有高度的亲和性和饱和性。目前认为PKC是佛波酯的受体，采用3H标记的二丁酰佛波作为配基，测定其结合点，以结合点数高低反映PKC活性。此方法的测定值稳定，最大的优点是样品可以是完整的活细胞，便于使用药物干预操作。
4.免疫细胞化学法[14]
首先细胞化学方法固定，再利用免疫学原理，选择PKC抗体与带有荧光标记的二抗先后孵育，最后根据荧光特性，利用特殊的图像系统来分析。此法可以对细胞PKC定位、定型，但因价格昂贵，目前应用不广泛。
5.其他方法
目前应用较少的如非同位素酶解测定法[15]，即通过测定ATP的消耗量来确定PKC的活力。此法优点是价格相对便宜，但干扰因素可能较多；底物蛋白磷酸化测定法[16]，即利用某些细胞内含有PKC特异性底物蛋白，如血小板中的40KDa蛋白，将这些蛋白的磷酸化作为细胞内PKC激活的标记，测定这些蛋白磷酸化的程度就可以计算PKC的相对活性，该方法仅用于特殊蛋白质。
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总之，PKC是糖尿病血管并发症发生分子机制中的重要环节。越来越多的实验证实PKC抑制剂对延缓糖尿病血管病变的发生起作用，进一步的找到有效、可长期应用、副作用小的PKC抑制剂已成为研究的方向[17]。探索PKC在糖尿病血管并发症中的作用机制对揭示糖尿病的病理发展过程有积极的意义。
参考文献：
1，George L K，Teruo S，Javier O，et al.Cellular and molecular abnormalities in the vascular endothelium of diabetes mellitus.Annu Rev med，1994，45：179-188.
2，Huang KP.Role of protein kinase C in cellular regulation.Biofactors，1990，2：171-178.
, 百拇医药
3，Williamson JR，Chang K，Tilton RG，et al.Increased vascular permeability in spontaneously diabetic BB/W rats and in rats with mild versus severe streprozocin-induced diabetes.Diabetes，1987，36：813-821.
4，Oliver JA.Adenylate cyclase and protein kinase C mediate opposite actions on endothelial junctions.J Cell Physiol，1990，145：536-542.
5，Xia P，Aiello LP，Ishii H，et al.Characterization of vascular endothelial growth factors effect on the activation of protein kinase C，its isoforms，and endothelial cell growth.J clin Invest，1996，98：2018-2026.
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6，Ishii H，Jirousek MR，Koya D，et al.Amelioration of vascular dysfunctions in diabetic rats by an oral PKC β inhibitor.Science，1996，272：728-731.
7，Takagi C，Bursell SE，Lin YW，et al.Regulation of retinal hemodynamics in diabetic rats by increased expression and action of endothelin-1.Invest Ophthalmol Vis Sci，1996，37：2504-2518.
8，Muniyappa R，Srinivas PR，Ram JL，et al.Calcium and protein kinase C mediate high-glucose-induced inhibition of inducible nitric oxide synthase in vascular smooth muscle cells.Hypertension，1998，31：289-295.
, 百拇医药
9，Kikkawa R，Haneda M，Uzu T，et al.Translocation of protein kinase α and ζ in rat glomerular mesangial cells cultured under high glucose conditions.Diabetologia，1994，37：838-841.
10，Xia P，Kramer RM，King GL.Identification of the mechanism for the inhibition of Na+-K+ adenosine triphosphatase by hyperglycemia involving activation of protein kinase C and cytosolic phospholipase A2.J Clin Invest，1995，96：733-740.
, http://www.100md.com 11，Heasley LE，Johnson GL.Regulation of protein kinase C by nerve growth factor，epidermal growth factor，and phorbol esters in PC12 pheochromocytoma cells.J Biol Chem，1989，264：8646-8652.
12，Haller H，Lindschau C，Quass P，et al.Platelet-derived growth factor and angiotensin Ⅱ induce different spatial distribution of protein kinase C alpha and beta in vascular smooth muscle cells.Hypertension，1994，23：848-852.
13，Uchida T，Fiburn CR.Affinity chromatography of protein kinase C phorbol ester receptor on polyacrylamide-immobilized phosphatidylserine.J Biol Cem，1984，259：12311-12314.
, http://www.100md.com
14，Haller H，Baur E，Quass P，et al.High glucose concentrations and protein kinase C isoforms in vascular smooth muscle cells.Kidney International，1995，47：1057-1067.
15，张泽林，刘燕燕，卢波，等.蛋白激酶C活力的非同位素酶解测定法.生物化学与生物物理进展，1992，19：219-222.
16，Willigen GV，Akkerman JW.Protein kinase C and cyclic AMP regulate reversible exposure of binding sites for fibrinogen on the glycoprotein ⅡB-ⅢA complex of human platelets.Biochem J，1991，273：115.
17，Lewis EJ，Hunsicker LG，Bain RP，et al.The effect of angiotensin converting enzyme inhibitor on diabetic nephropathy.N Engl J Med，1993，329：1456-1462., 百拇医药