低氧性肺动脉高压大鼠血清IGF-1的变化
作者：林勇 陈文彬 程德云
单位：林勇(210009 南京铁道医学院附属医院呼吸内科); 陈文彬(华西医科大学附属第一医院呼吸内科); 程德云(华西医科大学附属第一医院呼吸内科)
关键词：低氧性肺动脉高压；胰岛素样生长因子-1多肽；血浆胰岛素样生长因子-1水平 内分泌机制
江苏医药000410 摘 要：目的 探讨慢性低氧大鼠血清中胰岛素样生长因子-1(IGF-1)浓度、肺小动脉壁IGF-1多肽表达的变化及其与低氧性肺动脉高压(HPH)之间的关系。方法 用放射免疫分析法检测大鼠血清中IGF-1浓度；用免疫组织化学染色法观察肺小动脉壁IGF-1多肽的表达；用图像分析技术观察肺小动脉的形态改变和IGF-1多肽的表达强度。结果 低氧性肺动脉高压大鼠管壁增厚，管腔狭窄，反映管壁增厚的两个指标MT%和MA%均显著高于正常对照组(P<0.05)；灰度扫描示低氧大鼠肺小动脉壁的阳性程度显著大于正常对照组(P<0.01)。低氧大鼠血清IGF-1水平明显高于正常对照组(P<0.05)；大鼠血清IGF-1水平与平均肺动脉压(mPAP)呈显著正相关(r＝0.745，P＝0.002)。结论 在低氧性肺血管重建的发生机制中，IGF-1不仅以自分泌和旁分泌的方式刺激血管平滑肌细胞增生肥厚，而且还存在内分泌机制。
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The change of IGF-1 level in serum of rats with hypoxic pulmonary hypertension.
Lin Yong，Chen Wenbin，Cheng Deyun，et al.
Division of Respiratory Diseases，The Affiliated Hospital of Nanjing Railway Medical College，Nanjing，Jiangsu Province，P.R.China 210009
Abstract：Objective To study the change of IGF-1 concentration in serum，of IGF-1 polypeptide in the walls of pulmonary arterioles，and the relationship with hypoxic pulmonary hypertension.Methods The concentration of IGF-1 in the rat serum was measured by radioimmunoassay.The change of expression of IGF-1 polypeptide was observed by immunohistochemical staining on the walls of pulmonary arterioles.Morphological change and the level of IGF-1 polypeptide in pulmonary arterioles were determined by image pattern analysis technique.Results with the normal control group，the walls of pulmonary arterioles in the rats with hypoxic pulmonary hypertension were observed to be thickened with both MT% and MA% higher significantly than those of normal (P<0.05).The positive degree of gray scale scanning in the pulmonary arterioles in the hypoxic rats was higher than that in the normal rats.The level of IGF-1 in serum in the hypoxic rats was higher than that in the normal rats (P<0.05).The level of IGF-1 in the rat serum was positively correlated with mPAP (r＝0.745，P＝0.002).Conclusion In the pathogenesis of hypoxic pulmonary vascular remodelling，IGF-1 stimulate vascular smooth muscular cell proliferation not only in autocrine and paracrine manner，but also in the endocrine manner.
, 百拇医药
Key words：Hypoxic pulmonary hypertension IGF-1 polypeptide IGF-1 level in serum Endocrine manner
低氧性肺血管重建是近年来在研究HPH发病机制中提出的新概念，主要表现为肺小动脉壁中膜平滑肌细胞增生肥厚、外膜弹力纤维和胶原沉积增多[1]。IGF-1由多种组织细胞合成和分泌，具有调节多种细胞的生长增殖和分化的作用。本文应用放射免疫技术研究HPH大鼠模型血清中IGF-1的浓度变化，旨在探讨循环IGF-1水平与HPH的关系。
材料与方法
一、动物模型的建立：将雄性Wistar大鼠20只(体重200～300g，华西医科大学实验动物中心提供)分为两组。低氧组置于10%±0.5%氧浓度的常压低氧舱内3周建立肺动脉高压模型。采用间断性低氧，每天8小时，每周6天，第7天不低氧。缺氧时将大鼠置于有机玻璃舱内，舱内氧浓度由氧电极监测，自动控制仪调控，通过充入氮气稀释，使其维持在10%±0.5%。舱内CO2由钠石灰吸收，水蒸气由硅胶吸收，使舱内CO2浓度保持在3%以下。对照组10只大鼠置于同一实验室内，呼吸室内空气。所有试验用的大鼠饲养条件均相同，自由饮水和摄食。
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二、肺血流动力学检测：大鼠用1%戊巴比妥钠(50 mg/kg)腹腔内注射麻醉后，暴露右侧颈外静脉，插入硅胶管经右心房、右心室至肺动脉。导管另一端接压力传感器(TP200)，经多道生理仪RM-6000(Nihnkonden)测定mPAP。
三、组织标本制备：肺组织标本用10%中性甲醛缓冲液固定12 h，取右肺以石蜡包埋，沿肺门横断取材，连续切片，切片厚度5 μm。分别作HE、免疫组织化学染色。
四、血清IGF-1含量检测：所有大鼠均在进行血流动力学检测后抽取肺动脉血2 ml，室温下静置30～40 min后，4℃、3 000 g离心10 min，取上层血清置-30℃冰箱中保存备用。放射免疫检测试剂盒为MEDGENX IGF-1-D-RIA-CT kit(购自BioSource Europe S.A.Belgium)。检测仪器为中国科学院上海原子核研究所日环仪器厂出品的SN-682型全自动放射免疫γ计数器，微机自动处理数据，专人测定，严格按其说明书操作。
, 百拇医药
五、免疫组织化学染色：采用ABC法。ABC试剂盒为美国Vector公司产品，IGF-1单克隆抗体购自Santa Cruz Biotechnology，Int。工作浓度为1∶50。经常规脱蜡入水、3%H2O2处理、高压锅加热处理、山羊血清覆盖孵育、加一抗和二抗、DAB显色及苏木素复染等步骤后，观察结果。用PBS替换一抗作阴性对照，用大鼠肝脏组织作阳性对照。
六、图像分析：用MIAS 2000型医用图像分析仪(四川大学研制)随机测定与呼吸性细支气管及肺泡管伴行的肺小动脉外径(ED)、管壁厚度(MT)、管壁面积(MA)和血管总面积(TAA)，计算管壁厚度占血管外径的百分比(MT%)和管壁面积占血管总面积的百分比(MA%)。每只大鼠肺切片共测量8～10条血管的上述指标，计算出均数作为该只大鼠的血管指标进行统计分析。将免疫组织化学染色切片进行灰度扫描，对染色强度进行测量，每张切片均测量其背景灰度，用以消除切片间的误差。每只动物选用一张切片放大200倍进行分析，且每张切片测量10条血管，计算出均数作为该只大鼠的免疫组化染色强度指标进行统计分析。
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七、统计学处理：正态分布的变量用
±s表示，采用两样本均数的t检验。非正态分布的变量用中位数(M)与四分位数间距表示，并采用秩和检验；血清IGF-1含量与mPAP的相关性检验采用等极相关分析。实验数据用SPSS7.0统计软件包处理。
结 果
一、低氧组大鼠mPAP(21.17±3.98 mmHg)显著高于对照组(14.09±2.71 mmHg，P<0.05)，说明慢性低氧处理后出现了肺动脉高压。
二、肺组织HE染色切片图像分析示低氧组MT%、MA%显著高于对照组，说明经3周低氧后，肺小动脉结构发生变化，管壁肥厚和管腔狭窄，已发生低氧性肺血管重建，见表1。
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表1 肺小动脉图像分析结果(±s)
组别
例数
MT%
MA%
IGF-1染色强度
对照组
10
15.35±2.28
28.30±3.89
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7.30±1.34
低氧组
10
32.87±3.45*
54.84±4.78*
15.81±2.03**
与对照组比*P<0.05，**P<0.01
三、图像分析示低氧组肺小动脉壁的阳性染色显著增强(P<0.01)，说明低氧性肺血管重建大鼠肺小动脉壁IGF-1多肽的表达显著增加，IGF-1在HPH发生过程中发挥了一定的作用，见表1。
四、经3周低氧后低氧组血清IGF-1水平明显高于对照组(P<0.05)。将大鼠血清IGF-1与mPAP进行等级相关分析，两者呈正相关(r＝0.745，P＝0.002)，表明IGF-1参与了HPH的形成，见表2。
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表2 大鼠肺动脉血血清IGF-1浓度的对比
组别
例数
P25(ng/ml)
M(ng/ml)
P75(ng/ml)
对照组
10
331.80
413.70
485.73
低氧组
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10
546.00
884.52
938.28
注：因两组数据均为非正态分布，故用中位数与四分位数间距表示。M为中位数，P25为下四分位数，P75为上四分位数。两组之间比较采用秩和检验，P<0.05。 讨 论
低氧性肺血管重建是HPH的主要病理基础。本研究结果提示：大鼠经3周常压低氧处理后，肺动脉压增高，肺小动脉壁增厚，管腔狭窄，确已产生低氧性肺血管重建和HPH。现已明确IGF-1以自分泌/旁分泌的作用方式刺激血管平滑肌细胞和血管内皮细胞生长[2]，但与HPH的关系尚不明确。
本研究发现：大鼠经3周低氧后，在产生HPH的同时，肺小动脉壁IGF-1多肽的表达明显增强，说明肺小动脉壁合成和分泌的IGF-1参与了低氧性肺血管重建过程。正常情况下，肺血管平滑肌细胞、巨噬细胞和肺成纤维细胞均能合成和分泌IGF-1。肺动脉平滑肌细胞在低氧条件下产生IGF-1明显增多，通过自分泌作用促使自身增殖肥厚[3]。血管张力增高亦可刺激血管平滑肌细胞表达IGF-1mRNA和合成IGF-1多肽[4]，提示IGF-1在HPH形成的两个阶段即血管收缩和重建中均发挥了重要作用。
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本研究结果显示：HPH大鼠的血清IGF-1水平显著增高，并且与mPAP呈正相关，表明循环IGF-1水平与低氧性肺血管重建形成的关系密切。机体大多数组织都可合成和分泌IGF-1，但循环IGF-1的主要来源是肝脏。低氧对IGF-1的作用具有组织特异性，即促进肺脏和心脏的IGF-1mPAP的表达，而对肝脏的IGF-1mRNA无明显影响[5]。我们的研究结果证实：在低氧性肺血管重建的过程中，肺小动脉壁IGF-1多肽表达增加的同时亦伴有大鼠肺动脉血IGF-1水平上升。结合上述作者的观点，我们认为低氧情况下肺小动脉壁分泌产生的IGF-1多肽至少部分以内分泌方式释放入血。
在血管内皮通透性增加时，血浆中IGF-1可渗入血管中膜，刺激平滑肌细胞增生和基质蛋白产生，此现象在低氧情况下可能尤为明显。故我们认为：在低氧性肺血管重建的发生机制中，IGF-1不仅以自分泌和旁分泌的方式刺激血管平滑肌细胞增生肥厚，而且还存在内分泌机制。
参考文献：
, 百拇医药
1，Robert LV.Chronic hypoxic pulmonary hypertension：Cell to pathophysiology.Chest，1994，106：236-243.
2，Tamaroglio TA，Lo CS.Regulation of fibronectin by insulin-like growth factor-Ⅰ in cultured rat thoracic aortic smooth muscle cells and glomerular mesangial cells.Exp Cell Res，1994，215：338-346.
3，Edward CD，David BB，Emily LD，et al.Enhanced growth capacity of neonatal Pulmonary artery smooth muscle cells in vitro：dependence on cell size，time from birth，Insulin-like growth factor I，and autoactiviation of protein kinase C.J Cell Physiology，1994，160：469-481.
, 百拇医药
4，Chen Y，Bornfeldt KE，Arner A，et al.Increase in insulin-like growth factor I in hypertrophying smooth muscle.Am J Physiol，1994，266(2Pt l)：E224-E229.
5，Moromisato DY，Moromisato MY，Stefania Z，et al.Effects of hypoxia on lung，heart，and liver insulin-like growth factor-Ⅰ gene and receptor expresion in the newborn rat.Crit Care Med，1996，24：919-924.
收稿日期：1999-12-24
修稿日期：2000-01-17, 百拇医药
单位：林勇(210009 南京铁道医学院附属医院呼吸内科); 陈文彬(华西医科大学附属第一医院呼吸内科); 程德云(华西医科大学附属第一医院呼吸内科)
关键词：低氧性肺动脉高压；胰岛素样生长因子-1多肽；血浆胰岛素样生长因子-1水平 内分泌机制
江苏医药000410 摘 要：目的 探讨慢性低氧大鼠血清中胰岛素样生长因子-1(IGF-1)浓度、肺小动脉壁IGF-1多肽表达的变化及其与低氧性肺动脉高压(HPH)之间的关系。方法 用放射免疫分析法检测大鼠血清中IGF-1浓度；用免疫组织化学染色法观察肺小动脉壁IGF-1多肽的表达；用图像分析技术观察肺小动脉的形态改变和IGF-1多肽的表达强度。结果 低氧性肺动脉高压大鼠管壁增厚，管腔狭窄，反映管壁增厚的两个指标MT%和MA%均显著高于正常对照组(P<0.05)；灰度扫描示低氧大鼠肺小动脉壁的阳性程度显著大于正常对照组(P<0.01)。低氧大鼠血清IGF-1水平明显高于正常对照组(P<0.05)；大鼠血清IGF-1水平与平均肺动脉压(mPAP)呈显著正相关(r＝0.745，P＝0.002)。结论 在低氧性肺血管重建的发生机制中，IGF-1不仅以自分泌和旁分泌的方式刺激血管平滑肌细胞增生肥厚，而且还存在内分泌机制。
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The change of IGF-1 level in serum of rats with hypoxic pulmonary hypertension.
Lin Yong，Chen Wenbin，Cheng Deyun，et al.
Division of Respiratory Diseases，The Affiliated Hospital of Nanjing Railway Medical College，Nanjing，Jiangsu Province，P.R.China 210009
Abstract：Objective To study the change of IGF-1 concentration in serum，of IGF-1 polypeptide in the walls of pulmonary arterioles，and the relationship with hypoxic pulmonary hypertension.Methods The concentration of IGF-1 in the rat serum was measured by radioimmunoassay.The change of expression of IGF-1 polypeptide was observed by immunohistochemical staining on the walls of pulmonary arterioles.Morphological change and the level of IGF-1 polypeptide in pulmonary arterioles were determined by image pattern analysis technique.Results with the normal control group，the walls of pulmonary arterioles in the rats with hypoxic pulmonary hypertension were observed to be thickened with both MT% and MA% higher significantly than those of normal (P<0.05).The positive degree of gray scale scanning in the pulmonary arterioles in the hypoxic rats was higher than that in the normal rats.The level of IGF-1 in serum in the hypoxic rats was higher than that in the normal rats (P<0.05).The level of IGF-1 in the rat serum was positively correlated with mPAP (r＝0.745，P＝0.002).Conclusion In the pathogenesis of hypoxic pulmonary vascular remodelling，IGF-1 stimulate vascular smooth muscular cell proliferation not only in autocrine and paracrine manner，but also in the endocrine manner.
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Key words：Hypoxic pulmonary hypertension IGF-1 polypeptide IGF-1 level in serum Endocrine manner
低氧性肺血管重建是近年来在研究HPH发病机制中提出的新概念，主要表现为肺小动脉壁中膜平滑肌细胞增生肥厚、外膜弹力纤维和胶原沉积增多[1]。IGF-1由多种组织细胞合成和分泌，具有调节多种细胞的生长增殖和分化的作用。本文应用放射免疫技术研究HPH大鼠模型血清中IGF-1的浓度变化，旨在探讨循环IGF-1水平与HPH的关系。
材料与方法
一、动物模型的建立：将雄性Wistar大鼠20只(体重200～300g，华西医科大学实验动物中心提供)分为两组。低氧组置于10%±0.5%氧浓度的常压低氧舱内3周建立肺动脉高压模型。采用间断性低氧，每天8小时，每周6天，第7天不低氧。缺氧时将大鼠置于有机玻璃舱内，舱内氧浓度由氧电极监测，自动控制仪调控，通过充入氮气稀释，使其维持在10%±0.5%。舱内CO2由钠石灰吸收，水蒸气由硅胶吸收，使舱内CO2浓度保持在3%以下。对照组10只大鼠置于同一实验室内，呼吸室内空气。所有试验用的大鼠饲养条件均相同，自由饮水和摄食。
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二、肺血流动力学检测：大鼠用1%戊巴比妥钠(50 mg/kg)腹腔内注射麻醉后，暴露右侧颈外静脉，插入硅胶管经右心房、右心室至肺动脉。导管另一端接压力传感器(TP200)，经多道生理仪RM-6000(Nihnkonden)测定mPAP。
三、组织标本制备：肺组织标本用10%中性甲醛缓冲液固定12 h，取右肺以石蜡包埋，沿肺门横断取材，连续切片，切片厚度5 μm。分别作HE、免疫组织化学染色。
四、血清IGF-1含量检测：所有大鼠均在进行血流动力学检测后抽取肺动脉血2 ml，室温下静置30～40 min后，4℃、3 000 g离心10 min，取上层血清置-30℃冰箱中保存备用。放射免疫检测试剂盒为MEDGENX IGF-1-D-RIA-CT kit(购自BioSource Europe S.A.Belgium)。检测仪器为中国科学院上海原子核研究所日环仪器厂出品的SN-682型全自动放射免疫γ计数器，微机自动处理数据，专人测定，严格按其说明书操作。
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五、免疫组织化学染色：采用ABC法。ABC试剂盒为美国Vector公司产品，IGF-1单克隆抗体购自Santa Cruz Biotechnology，Int。工作浓度为1∶50。经常规脱蜡入水、3%H2O2处理、高压锅加热处理、山羊血清覆盖孵育、加一抗和二抗、DAB显色及苏木素复染等步骤后，观察结果。用PBS替换一抗作阴性对照，用大鼠肝脏组织作阳性对照。
六、图像分析：用MIAS 2000型医用图像分析仪(四川大学研制)随机测定与呼吸性细支气管及肺泡管伴行的肺小动脉外径(ED)、管壁厚度(MT)、管壁面积(MA)和血管总面积(TAA)，计算管壁厚度占血管外径的百分比(MT%)和管壁面积占血管总面积的百分比(MA%)。每只大鼠肺切片共测量8～10条血管的上述指标，计算出均数作为该只大鼠的血管指标进行统计分析。将免疫组织化学染色切片进行灰度扫描，对染色强度进行测量，每张切片均测量其背景灰度，用以消除切片间的误差。每只动物选用一张切片放大200倍进行分析，且每张切片测量10条血管，计算出均数作为该只大鼠的免疫组化染色强度指标进行统计分析。
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七、统计学处理：正态分布的变量用
±s表示，采用两样本均数的t检验。非正态分布的变量用中位数(M)与四分位数间距表示，并采用秩和检验；血清IGF-1含量与mPAP的相关性检验采用等极相关分析。实验数据用SPSS7.0统计软件包处理。结 果
一、低氧组大鼠mPAP(21.17±3.98 mmHg)显著高于对照组(14.09±2.71 mmHg，P<0.05)，说明慢性低氧处理后出现了肺动脉高压。
二、肺组织HE染色切片图像分析示低氧组MT%、MA%显著高于对照组，说明经3周低氧后，肺小动脉结构发生变化，管壁肥厚和管腔狭窄，已发生低氧性肺血管重建，见表1。
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表1 肺小动脉图像分析结果(
±s)组别
例数
MT%
MA%
IGF-1染色强度
对照组
10
15.35±2.28
28.30±3.89
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7.30±1.34
低氧组
10
32.87±3.45*
54.84±4.78*
15.81±2.03**
与对照组比*P<0.05，**P<0.01
三、图像分析示低氧组肺小动脉壁的阳性染色显著增强(P<0.01)，说明低氧性肺血管重建大鼠肺小动脉壁IGF-1多肽的表达显著增加，IGF-1在HPH发生过程中发挥了一定的作用，见表1。
四、经3周低氧后低氧组血清IGF-1水平明显高于对照组(P<0.05)。将大鼠血清IGF-1与mPAP进行等级相关分析，两者呈正相关(r＝0.745，P＝0.002)，表明IGF-1参与了HPH的形成，见表2。
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表2 大鼠肺动脉血血清IGF-1浓度的对比
组别
例数
P25(ng/ml)
M(ng/ml)
P75(ng/ml)
对照组
10
331.80
413.70
485.73
低氧组
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10
546.00
884.52
938.28
注：因两组数据均为非正态分布，故用中位数与四分位数间距表示。M为中位数，P25为下四分位数，P75为上四分位数。两组之间比较采用秩和检验，P<0.05。 讨 论
低氧性肺血管重建是HPH的主要病理基础。本研究结果提示：大鼠经3周常压低氧处理后，肺动脉压增高，肺小动脉壁增厚，管腔狭窄，确已产生低氧性肺血管重建和HPH。现已明确IGF-1以自分泌/旁分泌的作用方式刺激血管平滑肌细胞和血管内皮细胞生长[2]，但与HPH的关系尚不明确。
本研究发现：大鼠经3周低氧后，在产生HPH的同时，肺小动脉壁IGF-1多肽的表达明显增强，说明肺小动脉壁合成和分泌的IGF-1参与了低氧性肺血管重建过程。正常情况下，肺血管平滑肌细胞、巨噬细胞和肺成纤维细胞均能合成和分泌IGF-1。肺动脉平滑肌细胞在低氧条件下产生IGF-1明显增多，通过自分泌作用促使自身增殖肥厚[3]。血管张力增高亦可刺激血管平滑肌细胞表达IGF-1mRNA和合成IGF-1多肽[4]，提示IGF-1在HPH形成的两个阶段即血管收缩和重建中均发挥了重要作用。
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本研究结果显示：HPH大鼠的血清IGF-1水平显著增高，并且与mPAP呈正相关，表明循环IGF-1水平与低氧性肺血管重建形成的关系密切。机体大多数组织都可合成和分泌IGF-1，但循环IGF-1的主要来源是肝脏。低氧对IGF-1的作用具有组织特异性，即促进肺脏和心脏的IGF-1mPAP的表达，而对肝脏的IGF-1mRNA无明显影响[5]。我们的研究结果证实：在低氧性肺血管重建的过程中，肺小动脉壁IGF-1多肽表达增加的同时亦伴有大鼠肺动脉血IGF-1水平上升。结合上述作者的观点，我们认为低氧情况下肺小动脉壁分泌产生的IGF-1多肽至少部分以内分泌方式释放入血。
在血管内皮通透性增加时，血浆中IGF-1可渗入血管中膜，刺激平滑肌细胞增生和基质蛋白产生，此现象在低氧情况下可能尤为明显。故我们认为：在低氧性肺血管重建的发生机制中，IGF-1不仅以自分泌和旁分泌的方式刺激血管平滑肌细胞增生肥厚，而且还存在内分泌机制。
参考文献：
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1，Robert LV.Chronic hypoxic pulmonary hypertension：Cell to pathophysiology.Chest，1994，106：236-243.
2，Tamaroglio TA，Lo CS.Regulation of fibronectin by insulin-like growth factor-Ⅰ in cultured rat thoracic aortic smooth muscle cells and glomerular mesangial cells.Exp Cell Res，1994，215：338-346.
3，Edward CD，David BB，Emily LD，et al.Enhanced growth capacity of neonatal Pulmonary artery smooth muscle cells in vitro：dependence on cell size，time from birth，Insulin-like growth factor I，and autoactiviation of protein kinase C.J Cell Physiology，1994，160：469-481.
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4，Chen Y，Bornfeldt KE，Arner A，et al.Increase in insulin-like growth factor I in hypertrophying smooth muscle.Am J Physiol，1994，266(2Pt l)：E224-E229.
5，Moromisato DY，Moromisato MY，Stefania Z，et al.Effects of hypoxia on lung，heart，and liver insulin-like growth factor-Ⅰ gene and receptor expresion in the newborn rat.Crit Care Med，1996，24：919-924.
收稿日期：1999-12-24
修稿日期：2000-01-17, 百拇医药