逆转录病毒介导耐药基因的高效表达
作者：傅建新 王玮 王玲 朱子玲 陈子兴
单位：傅建新(215006 苏州医学院附属第一医院，江苏省血液研究所)； 王玮(215006 苏州医学院附属第一医院，江苏省血液研究所)； 王玲(215006 苏州医学院附属第一医院，江苏省血液研究所)； 朱子玲(215006 苏州医学院附属第一医院，江苏省血液研究所)； 陈子兴(215006 苏州医学院附属第一医院，江苏省血液研究所)
关键词：逆转录病毒；基因转移；基因治疗；基因，MDR；基因表达
江苏医药000406 摘 要：目的 建立多药耐药基因MDR1的逆转录病毒转移系统。方法 脂质体转染法将携带MDR1基因的逆转录病毒载体HaMDR导入单向型包装细胞GP+E86；用获得的单向型病毒重复转导双嗜型包装细胞GP+envAm12，经秋水仙碱加压选择获得高滴度的病毒生产细胞Am12/HaMDR；MDR1基因的转移和表达用聚合酶链反应(PCR)、MTT比色法和流式细胞术(FCM)分析。结果 单向型与双嗜型病毒生产细胞的滴度分别为6.2×105和9.0×105CFU/ml；PCR分析证实生产细胞有MDR1基因整合并稳定表达，但同时存在异常剪接的转录本；MTT比色法和FCM分析显示MDR1基因转移细胞的耐药程度提高12～267倍，P-糖蛋白表达率达97%～99%。结论 逆转录病毒可有效介导MDR1基因转移和表达，为导入造血干/祖细胞后进行根治性化疗奠定基础。
, 百拇医药
Efficient Expression of Drug Resistance Gene Mediated by Retrovirus
FU Jianxin WANG Wei WANG Ling et al.
Jiangsu Institute of Hematology，First Affiliated Hospital of Suzhou Medical College，Suzhou 215006
Abstract：Objective To establish a retrovirus-mediated gene transferring system for multi-drug resistance gene MDR1. Methods Using liposome，GP+E86 ecotropic packaging cells were transfected with the retroviral vector HaMDR carrying human MDR1 gene.Then，the high-titer amphotropic retroviral producer cells，named Am12/HaMDR，were generated via infecting the GP+envAm12 packaging cells by ecotropic virus repeatedly and selecting with colchicine up to 400μg/L.The transfer and expression of the exogenous MDR1 gene was probed by polymerase chain reaction(PCR)，MTT colorimetric assay and flow cytometry(FCM).Results Viruses in supernatants were titrated to 6.2×105CFU/ml for GP+E86/HaMDR cells and 9.0×105CFU/ml for Am12/HaMDR cells.Confirmed by PCR assay，transfection of HaMDR vector resulted in both integration and overexpression of MDR1 gene in both producer cells，in which aberrant spliced transcripts were also noted.Moreover，the MDR1 transgene was effectively translated into P-glycoprotein in 97%～99% of resistant cells，and resulted in a 12- to 267-fold drug resistance in comparison with parental cells，analyzed by FCM and MTT assay.Conclusion The transfer and expression of MDR1 could be efficiently mediated by retrovirus，suggesting the potential utility of the HaMDR vector in protecting hematopoietic stem/progenitor cells from ablative chemotherapy.
, 百拇医药
Key words：Retrovirus Gene transfer Gene therapy Genes，MDR Gene expression
多药耐药基因MDR1编码的P-糖蛋白(P-gp)是一种能量依赖性药物排出泵。以造血干/祖细胞为靶细胞的MDR1基因转移已开始临床试验[1]；同时，MDR1作为显性选择基因可在体内、外对基因修饰细胞进行选择或扩增[2，3]。本文分别用脂质体转染法与病毒转导法获得两种具有不同宿主范围的病毒生产细胞，并使MDR1基因在培养细胞中获得高效表达。
材料与方法
一、细胞系和病毒载体 单向型(GP+E86)与双嗜型(GP+envAm12)逆转录病毒包装细胞均由美国哥伦比亚大学Bank教授馈赠，以含12%新生牛血清的高糖DMEM培养；携带MDR1基因的复制缺陷型逆转录病毒载体HaMDR由暨南大学医学院曹丽萍博士提供。
, http://www.100md.com
二、脂质体介导DNA转染 用DOSPER介导的方法进行基因转染[4]。转染后的GP+E86细胞用60μg/L秋水仙碱(COL)筛选，获得单向型病毒生产细胞GP+E86/HaMDR。
三、双嗜型病毒生产细胞 以富含单向型MDR病毒的培养上清转导GP+envAm12细胞，共6次；200～400 μg/L COL筛选3周，得到双嗜型产病毒细胞Am12/HaMDR。以NIH 3T3为受体细胞常规测定病毒滴度；PCR分析双嗜型病毒env基因验证其安全性。
四、体外药物敏感试验 2×103细胞铺于96孔平底培养板，并加入细胞毒药物(长春新碱VCR，COL，柔红霉素DNR，紫杉醇Taxol)，于37℃连续培养72小时后用MTT比色法测定活细胞数，并计算相应的IC50值。
五、MDR1基因的整合与转录 按本实验室方法进行。其中Hmdr1和Hmdr2为全长MDR1基因特异性引物，扩增产物为283bp[4]；Hmdr4(5′-GTTCA AACTT CTGCT CCTGA-3′)和Hmdr5(5′-CATGA ATCTG GAGGA AGACA-3′)被设计为特异扩增异常剪接的MDR1基因，产物为460bp[5]。产物经2.0%琼脂糖凝胶电泳分析并照相。
, 百拇医药
六、FCM检测P-gp表达 按本室建立的直接免疫荧光法进行[4]。藻红蛋白直标的P-gp单抗UIC2购自Immunotech公司，流式细胞仪为EpicsXL型(Coulter公司)。
结 果
一、逆转录病毒生产细胞的鉴定 经脂质体DOSPER介导，载体HaMDR被导入GP+E86细胞，药物选择得到耐药细胞GP+E86/HaMDR，其产生的单向型病毒滴度约为6.2×105CFU/ml。为得到高滴度、可对人类细胞进行基因转移研究的双嗜型逆转录病毒，作者用GP+E86/HaMDR细胞所分泌的病毒在聚凝胺存在的条件下重复转导包装细胞GP+envAm12，并经高浓度COL选择产生Am12/HaMDR细胞，滴度约为9.0×105CFU/ml，可基本满足临床应用的要求。巢式PCR在双嗜型病毒转导的靶细胞NIH3T3中未能检测到env基因存在，证实无辅助病毒产生。目前，两种产病毒细胞已稳定分泌病毒颗粒达20周以上，经过多次冻存与复苏，其特性未见明显改变。
, 百拇医药
二、MDR1基因转移细胞的耐药表型 两种生产细胞均能在含50μg/L COL的培养基中生长良好；与未转导的母本细胞相比，GP+E86/HaMDR细胞和Am12/HaMDR细胞对四种细胞毒药物相应的IC50值提高12～267倍(见表1)。表明该逆病毒载体可介导MDR1基因在培养细胞中进行高效的功能性表达，同时也说明MDR1基因过度表达与MDR表型的直接相关性。
三、MDR1基因的整合与转录 利用全长MDR1基因特异性引物，即Hmdr1和Hmdr2，可分别从两种病毒生产细胞基因组DNA中扩增出MDR1基因特异性产物，而对照细胞皆为阴性，表明MDR原病毒稳定整合；逆转录-PCR从转录水平证实两者除有全长MDR1基因的过度表达外，尚可用截短MDR1基因特异性引物，即引物Hmdr4和Hmdr5，检测到异常剪接的MDR1基因转录本，且该异常转录本也见于耐药白血病细胞HL60(VCR)，此表明人MDR1基因内确有隐匿的剪接位点存在，而与MDR1基因转染无关。
, 百拇医药
表1 MDR1基因转移细胞的耐药特性(μg/L)
细胞
IC50(耐药倍数)
VCR
COL
DNR
Taxol
GP+E86
4.6
4.2
54
6.0
, 百拇医药
GP+E86/HaMDR
354.0(77)
49.8(12)
1628(30)
1191(198)
GP+envAm12
4.0
5.0
49.9
5.7
Am12/HaMDR
424.7(106)
, 百拇医药
276.8(55)
2957(59)
1520(267)
四、产病毒细胞表面P-gp的表达 用作用于P-gp膜外结构域的单抗UIC2结合FCM分析证实两种耐药的生产细胞均高表达P-gp，其中GP+E86/HaMDR细胞的P-gp特异性荧光指数(SFI)与表达率分别为10.6与97%，Am12/HaMDR细胞的SFI与表达率相应为28.0与99%(图略)。表明外源性MDR1基因被高效表达。 讨 论
逆转录病毒介导MDR1基因转移在基因治疗研究中有两方面的应用前景：与造血干细胞(HSC)移植相结合，作为耐药基因在对癌症患者进行根治性化疗时保护造血细胞免受杀伤[1，5，6]；作为显性选择基因在体内和/或体外对靶细胞进行选择与扩增，以提高外源性基因的表达水平与持续时间，现已用于Gaucher病、Fabry病和X-连锁慢性肉芽肿病等造血系统遗传病的基因治疗[2]。本研究通过基因转染方法与“乒乓转导”方法分别获得两种较高滴度的逆转录病毒生产细胞，进一步可对包括脐血CD34+细胞在内的造血细胞进行MDR1基因转移，以研究MDR1基因在造血干/祖细胞的表达及其生物学特性的变化。此外，转基因方法获得的耐药小鼠细胞(如：NIH3T3/MDR)可被用作P-gp单抗制备的良好免疫源，与其它耐药细胞相比，能明显提高阳性克隆的比例，可与DNA免疫的优点媲美，本实验室亦正用此策略制备P-gp单抗。MDR1基因转导细胞尚是研究P-gp在细胞分化或凋亡中作用的有效模型[7]，以验证本室业已建立的高度耐药的HL-60(VCR)细胞对诱导分化和辐射耐受是否与MDR1基因过表达直接相关。
, 百拇医药
逆转录病毒载体是介导基因转移与表达的最成熟载体，但与在小鼠中取得的研究结果相反，在人类HSC中的转移与表达效率均不够理想，可能与双嗜型病毒受体GLVR2的低表达和DNA甲基化使基因沉默有关[1，2，6]。为提高MDR1基因的表达水平，进而在根治性化疗过程中改善对造血祖细胞的保护效果，我们拟应用定点诱变技术消除选择性剪接位点并使表达的P-gp能抵抗环孢菌素的逆转，同时采用适宜在人早期造血细胞中高效表达的新型载体[8]；通过内部核糖体进入位点IRES共表达多种耐药基因以拓宽耐药谱也是今后发展的方向。有关对CD34+造血细胞进行基因转移的条件优化，本实验室正用标志基因NeoR和绿色荧光蛋白进行。
鉴于体外扩增HaMDR载体转导小鼠HSC的潜在危险性[9]和作为化疗保护性基因的临床效果不够理想[1，6]，有必要对腺病毒介导的MDR1基因在人造血干/祖细胞的一过性高表达的可行性进行研究；而MDR1基因在基因治疗中被用作选择性基因可能更为适宜。由于MDR1基因与靶细胞表达膜蛋白P-gp及耐药表型直接相关，除可用单抗或荧光染料作为探针在体外分选基因修饰细胞外，在体内尚能达到富集甚至选择性扩增靶细胞的效果，对人体亦无免疫抗原性，乃其它选择或标志基因所不及。相信通过联合应用MDR1等体内选择性基因、高效基因转移与表达载体及新的转导方法，将促进以HSC为靶细胞的基因治疗的发展，真正使基因治疗被临床科学家接受并广泛应用。
, http://www.100md.com
基金项目：本课题受江苏省卫生厅科研基金(H9549)资助
参考文献：
1，Hanania EG，Giles RE，Kavanagh J，et al.Results of MDR-1 vector modification trial indicate that granulocyte/macrophage colony-forming unit cells do not contribute to posttransplant hematopoietic recovery following intensive systemic therapy.Proc Natl Acad Sci USA，1996，93∶15346-15351.
2，Licht T，Herrmann F，Gottesman MM，et al.In vivo drug-selectable genes：a new concept in gene therapy.Stem Cells，1997，15∶104-111.
, 百拇医药
3，Moscow JA，Huang H，Carter C，et al.Engraftment of MDR1 and NeoR gene-transduced hematopoietic cells after breast cancer chemotherapy.Blood，1999，94∶52-61.
4，傅建新，陈子兴，王玮，等.内在核糖体进入位点控制多药耐经基因MDR1表达的研究.中华血液学杂志，1998，19∶619-622.
5，Sorrentino BP，McDonagh KT，Woods D，et al.Expression of retroviral vectors containing the human multidrug resistance 1 cDNA in hematopoietic cells of transplanted mice.Blood，1995，86∶491-501.
, 百拇医药
6，Hesdorffer C，Ayello J，Ward M，et al.Phase I trial of retroviral-mediated transfer of the human MDR1 gene as marrow chemoprotection in patients undergoing high-dose chemotherapy and autologous stem cell transplantation.J Clin Oncol，1998，16∶165-172.
7，Bozombes C，Maestre N，Laurent G，et al.Restoration of TNF-induced ceramide generation and apoptosis in resistant human leukemia KG1a cells by the P-glycoprotein blocker PSC833.FASEB J，1998，12∶101-109.
, 百拇医药
8，Dang CV，Gerson SL，Litwak M，et al.Gene therapy and translational cancer research.Clin Cancer Res，1999，5∶471-474.
9，Bunting KD，Galipeau J，Topham D，et al.Transduction of bone marrow cells with an MDR1 vector enables ex vivo stem cell expansion，but these expanded grafts cause a myeloproliferative syndrome in transplanted mice.Blood，1998，92∶2269-2279.
收稿日期：1999-10-26
修稿日期：1999-12-07, 百拇医药
单位：傅建新(215006 苏州医学院附属第一医院，江苏省血液研究所)； 王玮(215006 苏州医学院附属第一医院，江苏省血液研究所)； 王玲(215006 苏州医学院附属第一医院，江苏省血液研究所)； 朱子玲(215006 苏州医学院附属第一医院，江苏省血液研究所)； 陈子兴(215006 苏州医学院附属第一医院，江苏省血液研究所)
关键词：逆转录病毒；基因转移；基因治疗；基因，MDR；基因表达
江苏医药000406 摘 要：目的 建立多药耐药基因MDR1的逆转录病毒转移系统。方法 脂质体转染法将携带MDR1基因的逆转录病毒载体HaMDR导入单向型包装细胞GP+E86；用获得的单向型病毒重复转导双嗜型包装细胞GP+envAm12，经秋水仙碱加压选择获得高滴度的病毒生产细胞Am12/HaMDR；MDR1基因的转移和表达用聚合酶链反应(PCR)、MTT比色法和流式细胞术(FCM)分析。结果 单向型与双嗜型病毒生产细胞的滴度分别为6.2×105和9.0×105CFU/ml；PCR分析证实生产细胞有MDR1基因整合并稳定表达，但同时存在异常剪接的转录本；MTT比色法和FCM分析显示MDR1基因转移细胞的耐药程度提高12～267倍，P-糖蛋白表达率达97%～99%。结论 逆转录病毒可有效介导MDR1基因转移和表达，为导入造血干/祖细胞后进行根治性化疗奠定基础。
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Efficient Expression of Drug Resistance Gene Mediated by Retrovirus
FU Jianxin WANG Wei WANG Ling et al.
Jiangsu Institute of Hematology，First Affiliated Hospital of Suzhou Medical College，Suzhou 215006
Abstract：Objective To establish a retrovirus-mediated gene transferring system for multi-drug resistance gene MDR1. Methods Using liposome，GP+E86 ecotropic packaging cells were transfected with the retroviral vector HaMDR carrying human MDR1 gene.Then，the high-titer amphotropic retroviral producer cells，named Am12/HaMDR，were generated via infecting the GP+envAm12 packaging cells by ecotropic virus repeatedly and selecting with colchicine up to 400μg/L.The transfer and expression of the exogenous MDR1 gene was probed by polymerase chain reaction(PCR)，MTT colorimetric assay and flow cytometry(FCM).Results Viruses in supernatants were titrated to 6.2×105CFU/ml for GP+E86/HaMDR cells and 9.0×105CFU/ml for Am12/HaMDR cells.Confirmed by PCR assay，transfection of HaMDR vector resulted in both integration and overexpression of MDR1 gene in both producer cells，in which aberrant spliced transcripts were also noted.Moreover，the MDR1 transgene was effectively translated into P-glycoprotein in 97%～99% of resistant cells，and resulted in a 12- to 267-fold drug resistance in comparison with parental cells，analyzed by FCM and MTT assay.Conclusion The transfer and expression of MDR1 could be efficiently mediated by retrovirus，suggesting the potential utility of the HaMDR vector in protecting hematopoietic stem/progenitor cells from ablative chemotherapy.
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Key words：Retrovirus Gene transfer Gene therapy Genes，MDR Gene expression
多药耐药基因MDR1编码的P-糖蛋白(P-gp)是一种能量依赖性药物排出泵。以造血干/祖细胞为靶细胞的MDR1基因转移已开始临床试验[1]；同时，MDR1作为显性选择基因可在体内、外对基因修饰细胞进行选择或扩增[2，3]。本文分别用脂质体转染法与病毒转导法获得两种具有不同宿主范围的病毒生产细胞，并使MDR1基因在培养细胞中获得高效表达。
材料与方法
一、细胞系和病毒载体 单向型(GP+E86)与双嗜型(GP+envAm12)逆转录病毒包装细胞均由美国哥伦比亚大学Bank教授馈赠，以含12%新生牛血清的高糖DMEM培养；携带MDR1基因的复制缺陷型逆转录病毒载体HaMDR由暨南大学医学院曹丽萍博士提供。
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二、脂质体介导DNA转染 用DOSPER介导的方法进行基因转染[4]。转染后的GP+E86细胞用60μg/L秋水仙碱(COL)筛选，获得单向型病毒生产细胞GP+E86/HaMDR。
三、双嗜型病毒生产细胞 以富含单向型MDR病毒的培养上清转导GP+envAm12细胞，共6次；200～400 μg/L COL筛选3周，得到双嗜型产病毒细胞Am12/HaMDR。以NIH 3T3为受体细胞常规测定病毒滴度；PCR分析双嗜型病毒env基因验证其安全性。
四、体外药物敏感试验 2×103细胞铺于96孔平底培养板，并加入细胞毒药物(长春新碱VCR，COL，柔红霉素DNR，紫杉醇Taxol)，于37℃连续培养72小时后用MTT比色法测定活细胞数，并计算相应的IC50值。
五、MDR1基因的整合与转录 按本实验室方法进行。其中Hmdr1和Hmdr2为全长MDR1基因特异性引物，扩增产物为283bp[4]；Hmdr4(5′-GTTCA AACTT CTGCT CCTGA-3′)和Hmdr5(5′-CATGA ATCTG GAGGA AGACA-3′)被设计为特异扩增异常剪接的MDR1基因，产物为460bp[5]。产物经2.0%琼脂糖凝胶电泳分析并照相。
, 百拇医药
六、FCM检测P-gp表达 按本室建立的直接免疫荧光法进行[4]。藻红蛋白直标的P-gp单抗UIC2购自Immunotech公司，流式细胞仪为EpicsXL型(Coulter公司)。
结 果
一、逆转录病毒生产细胞的鉴定 经脂质体DOSPER介导，载体HaMDR被导入GP+E86细胞，药物选择得到耐药细胞GP+E86/HaMDR，其产生的单向型病毒滴度约为6.2×105CFU/ml。为得到高滴度、可对人类细胞进行基因转移研究的双嗜型逆转录病毒，作者用GP+E86/HaMDR细胞所分泌的病毒在聚凝胺存在的条件下重复转导包装细胞GP+envAm12，并经高浓度COL选择产生Am12/HaMDR细胞，滴度约为9.0×105CFU/ml，可基本满足临床应用的要求。巢式PCR在双嗜型病毒转导的靶细胞NIH3T3中未能检测到env基因存在，证实无辅助病毒产生。目前，两种产病毒细胞已稳定分泌病毒颗粒达20周以上，经过多次冻存与复苏，其特性未见明显改变。
, 百拇医药
二、MDR1基因转移细胞的耐药表型 两种生产细胞均能在含50μg/L COL的培养基中生长良好；与未转导的母本细胞相比，GP+E86/HaMDR细胞和Am12/HaMDR细胞对四种细胞毒药物相应的IC50值提高12～267倍(见表1)。表明该逆病毒载体可介导MDR1基因在培养细胞中进行高效的功能性表达，同时也说明MDR1基因过度表达与MDR表型的直接相关性。
三、MDR1基因的整合与转录 利用全长MDR1基因特异性引物，即Hmdr1和Hmdr2，可分别从两种病毒生产细胞基因组DNA中扩增出MDR1基因特异性产物，而对照细胞皆为阴性，表明MDR原病毒稳定整合；逆转录-PCR从转录水平证实两者除有全长MDR1基因的过度表达外，尚可用截短MDR1基因特异性引物，即引物Hmdr4和Hmdr5，检测到异常剪接的MDR1基因转录本，且该异常转录本也见于耐药白血病细胞HL60(VCR)，此表明人MDR1基因内确有隐匿的剪接位点存在，而与MDR1基因转染无关。
, 百拇医药
表1 MDR1基因转移细胞的耐药特性(μg/L)
细胞
IC50(耐药倍数)
VCR
COL
DNR
Taxol
GP+E86
4.6
4.2
54
6.0
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GP+E86/HaMDR
354.0(77)
49.8(12)
1628(30)
1191(198)
GP+envAm12
4.0
5.0
49.9
5.7
Am12/HaMDR
424.7(106)
, 百拇医药
276.8(55)
2957(59)
1520(267)
四、产病毒细胞表面P-gp的表达 用作用于P-gp膜外结构域的单抗UIC2结合FCM分析证实两种耐药的生产细胞均高表达P-gp，其中GP+E86/HaMDR细胞的P-gp特异性荧光指数(SFI)与表达率分别为10.6与97%，Am12/HaMDR细胞的SFI与表达率相应为28.0与99%(图略)。表明外源性MDR1基因被高效表达。 讨 论
逆转录病毒介导MDR1基因转移在基因治疗研究中有两方面的应用前景：与造血干细胞(HSC)移植相结合，作为耐药基因在对癌症患者进行根治性化疗时保护造血细胞免受杀伤[1，5，6]；作为显性选择基因在体内和/或体外对靶细胞进行选择与扩增，以提高外源性基因的表达水平与持续时间，现已用于Gaucher病、Fabry病和X-连锁慢性肉芽肿病等造血系统遗传病的基因治疗[2]。本研究通过基因转染方法与“乒乓转导”方法分别获得两种较高滴度的逆转录病毒生产细胞，进一步可对包括脐血CD34+细胞在内的造血细胞进行MDR1基因转移，以研究MDR1基因在造血干/祖细胞的表达及其生物学特性的变化。此外，转基因方法获得的耐药小鼠细胞(如：NIH3T3/MDR)可被用作P-gp单抗制备的良好免疫源，与其它耐药细胞相比，能明显提高阳性克隆的比例，可与DNA免疫的优点媲美，本实验室亦正用此策略制备P-gp单抗。MDR1基因转导细胞尚是研究P-gp在细胞分化或凋亡中作用的有效模型[7]，以验证本室业已建立的高度耐药的HL-60(VCR)细胞对诱导分化和辐射耐受是否与MDR1基因过表达直接相关。
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逆转录病毒载体是介导基因转移与表达的最成熟载体，但与在小鼠中取得的研究结果相反，在人类HSC中的转移与表达效率均不够理想，可能与双嗜型病毒受体GLVR2的低表达和DNA甲基化使基因沉默有关[1，2，6]。为提高MDR1基因的表达水平，进而在根治性化疗过程中改善对造血祖细胞的保护效果，我们拟应用定点诱变技术消除选择性剪接位点并使表达的P-gp能抵抗环孢菌素的逆转，同时采用适宜在人早期造血细胞中高效表达的新型载体[8]；通过内部核糖体进入位点IRES共表达多种耐药基因以拓宽耐药谱也是今后发展的方向。有关对CD34+造血细胞进行基因转移的条件优化，本实验室正用标志基因NeoR和绿色荧光蛋白进行。
鉴于体外扩增HaMDR载体转导小鼠HSC的潜在危险性[9]和作为化疗保护性基因的临床效果不够理想[1，6]，有必要对腺病毒介导的MDR1基因在人造血干/祖细胞的一过性高表达的可行性进行研究；而MDR1基因在基因治疗中被用作选择性基因可能更为适宜。由于MDR1基因与靶细胞表达膜蛋白P-gp及耐药表型直接相关，除可用单抗或荧光染料作为探针在体外分选基因修饰细胞外，在体内尚能达到富集甚至选择性扩增靶细胞的效果，对人体亦无免疫抗原性，乃其它选择或标志基因所不及。相信通过联合应用MDR1等体内选择性基因、高效基因转移与表达载体及新的转导方法，将促进以HSC为靶细胞的基因治疗的发展，真正使基因治疗被临床科学家接受并广泛应用。
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基金项目：本课题受江苏省卫生厅科研基金(H9549)资助
参考文献：
1，Hanania EG，Giles RE，Kavanagh J，et al.Results of MDR-1 vector modification trial indicate that granulocyte/macrophage colony-forming unit cells do not contribute to posttransplant hematopoietic recovery following intensive systemic therapy.Proc Natl Acad Sci USA，1996，93∶15346-15351.
2，Licht T，Herrmann F，Gottesman MM，et al.In vivo drug-selectable genes：a new concept in gene therapy.Stem Cells，1997，15∶104-111.
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3，Moscow JA，Huang H，Carter C，et al.Engraftment of MDR1 and NeoR gene-transduced hematopoietic cells after breast cancer chemotherapy.Blood，1999，94∶52-61.
4，傅建新，陈子兴，王玮，等.内在核糖体进入位点控制多药耐经基因MDR1表达的研究.中华血液学杂志，1998，19∶619-622.
5，Sorrentino BP，McDonagh KT，Woods D，et al.Expression of retroviral vectors containing the human multidrug resistance 1 cDNA in hematopoietic cells of transplanted mice.Blood，1995，86∶491-501.
, 百拇医药
6，Hesdorffer C，Ayello J，Ward M，et al.Phase I trial of retroviral-mediated transfer of the human MDR1 gene as marrow chemoprotection in patients undergoing high-dose chemotherapy and autologous stem cell transplantation.J Clin Oncol，1998，16∶165-172.
7，Bozombes C，Maestre N，Laurent G，et al.Restoration of TNF-induced ceramide generation and apoptosis in resistant human leukemia KG1a cells by the P-glycoprotein blocker PSC833.FASEB J，1998，12∶101-109.
, 百拇医药
8，Dang CV，Gerson SL，Litwak M，et al.Gene therapy and translational cancer research.Clin Cancer Res，1999，5∶471-474.
9，Bunting KD，Galipeau J，Topham D，et al.Transduction of bone marrow cells with an MDR1 vector enables ex vivo stem cell expansion，but these expanded grafts cause a myeloproliferative syndrome in transplanted mice.Blood，1998，92∶2269-2279.
收稿日期：1999-10-26
修稿日期：1999-12-07, 百拇医药