PCR-ELISA法测定正常骨髓的端粒酶活性
作者：傅 王玮 岑建农 陈子兴
单位：傅(215006 苏州医学院附属第一医院，江苏省血液研究所)； 王玮(215006 苏州医学院附属第一医院，江苏省血液研究所)； 岑建农(215006 苏州医学院附属第一医院，江苏省血液研究所)； 陈子兴(215006 苏州医学院附属第一医院，江苏省血液研究所)
关键词：
江苏医药000423 端粒酶是一种核糖核蛋白酶，它以自身RNA为模板，将随机重复序列加到染色体末端，从而维持端粒的长度。在大部分组织中端粒酶受到抑制，故随着细胞的衰老可见端粒缩短现象。肿瘤细胞因端粒酶的激活而维持端粒长度，获得无限增殖的能力，因此端粒酶被视为一种肿瘤标记。端粒酶表达也见于正常人类生殖、造血、表皮及胃肠道粘膜基底干细胞等，以维持具有自我更新能力细胞的再生功能。1997～1998年我们用半定量法检测正常骨髓细胞的端粒酶活性，从而对正常骨髓的端粒酶表达范围和表达规律进行初步探讨。
, 百拇医药
材料和方法
一、细胞株
5种髓系白血病细胞株包括KG1、K562、HL60、NB4及耐VCR的HL60细胞株。离心收集2×106个细胞，用PBS溶液洗涤两遍。
二、标本来源
20例骨髓标本来自苏州医学院附属第一医院门诊体检健康人员15名和特发性血小板减少性紫癜(ITP)患者5名，年龄2～57岁，女9名，男11名，骨髓以Ficoll-Hypaque密度离心法分离单个核细胞，计数。另取7～10个月大流产胎儿的骨髓5例，用去离子水洗涤多次，去除红细胞，计数。
三、实验方法(端粒酶PCR-ELISA法)
1.蛋白提取：端粒酶PCR-ELISA盒购自德国宝灵曼公司。取2×106个细胞，用PBS溶液洗涤两遍，加入200 μl蛋白提取液，置冰上30分钟，离心取175 μl上清至另管。
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2.PCR扩增：冰上，在PCR扩增管中加入25 μlPCR混合反应液(包含生物素标记的正向底物寡核苷酸引物pl-TS，反向引物p2，Taq多聚酶等)、2 μl蛋白提取液，加DEPC水使总体积为50 μl。PCR条件：(1)引物延长：25℃ 30分钟。(2)端粒酶灭活：94℃ 5分钟。(3)扩增条件：共30个循环，变性94℃ 30秒，褪火50℃ 30秒，多聚酶反应72℃ 90秒。
3.杂交和ELISA检测：取变性液20 μl和扩增产物5 μl于室温下培养。再加入杂交液225 μl(含地高辛标记的端粒序列特异性检测探针)，混合后加入微滴定板(MTP)每孔中，37℃中避光振荡2小时。倒掉杂交液，加入Anti-DIG-POD工作液在室温下避光振荡30分钟，然后倒掉，加入TMB底物溶液，在室温下避光振荡20分钟，加入反应终止液。用国产的酶联检测仪DG3022型进行测定，读取波长450及630的OD值。
4.结果判断：阳性对照：试剂盒备有人胚肾293细胞系的蛋白提取物作为阳性对照，其OD450减OD630的差值应大于1.5 U。阴性对照：将蛋白提取物于65℃培养10分钟或用RNA酶处理，其OD450与OD630的差值应小于0.2 U。标本的OD 450与OD 630的差值跟阴性对照相比较，其差值大于0.2 U则认为是阳性，反之则认为是阴性。每个标本重复两次以上实验，取其均值作为最后结果。
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结 果
一、白血病细胞株的端粒酶活性测定
细胞株KG-1、HL60、K562、NB4端粒酶表达范围0.92～1.00 U，且在传代过程中非常稳定。耐VCR的HL60细胞株与HL60细胞株端粒酶表达无明显差异(OD值平均0.92 U和0.96 U)。5种细胞株端粒酶的平均水平为0.96±0.02 U。
二、正常骨髓细胞端粒酶的表达
20例正常骨髓单个核细胞的端粒酶表达范围0～0.30 U，平均0.11±0.08 U，处于阴性范围。但2例ITP患者、1例正常人为阳性，证明正常骨髓细胞确实有端粒酶表达，只是表达的水平较低。
三、胎儿与成人骨髓细胞端粒酶活性的比较
由于胎儿骨髓含有较多的红细胞，且骨髓细胞数少，故未分离单个核细胞。胎儿骨髓端粒酶表达范围0.44～0.63 U，平均0.58 U，明显高于成人骨髓。
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讨 论
国内外的实验结果，正常骨髓、生殖、皮肤基底细胞及胃肠道粘膜干细胞都具有端粒酶活性
，但表达规律仍然不明。我们应用的端粒酶PCR-ELISA法，对15例正常人、5例ITP患者进行半定量检测骨髓的端粒酶活性，平均0.11±0.08 U，处于阴性范围。5种白血病细胞株端粒酶活性平均0.9
6±0.02 U，与正常人差别较大，显示在正常骨髓细胞中端粒酶活性调控机理可能和恶性细胞中不同。
20例正常骨髓中只有3例为阳性(分别为0.30 U、0.26 U、0.25 U)。国外的研究提示正常骨髓中端粒酶的阳性表达可能主要来源于CD34+CD38+早期祖细胞和B、T淋巴细胞。原始的CD34+CD38-/low干细胞端粒酶活性极低，因其大部分处于G0期静止状态，当它进入增殖周期时伴随着端粒酶表达上调，而进入分化成熟阶段时伴随着端粒酶表达逐渐下调。成熟的粒细胞处于终末化阶段，不能增殖，端粒酶表达阴性。可见，端粒酶的活性调控伴随着整个造血过程。淋巴细胞受刺激原作用，增殖时端粒酶活性提高，而处于静止状态时端粒酶表达阴性。因此端粒酶表达又与淋巴细胞进行免疫应答、执行免疫功能有关。
国外研究还提示正常骨髓细胞的端粒酶水平随年龄增高而下降。我们观察的例数尚少，未能作出结论，但胎儿骨髓的端粒酶水平明显高于成人的结果符合国外研究，说明胎儿骨髓进入增殖和循环期的造血干细胞数量更多，具有比成人更高的再生及增殖潜能。端粒酶在正常骨髓细胞中的表达和调控机理仍未明确，如果要对正常骨髓细胞的端粒酶调控进行研究，必须还要改进实验方法，提高灵敏度。深入研究将使我们对正常造血和造血组织肿瘤生成的分子生物学机制在认识上取得突破。
基金项目：本课题受苏州医学院科研基金(E9705)和98江苏省333工程科研项目基金资助, 百拇医药
单位：傅(215006 苏州医学院附属第一医院，江苏省血液研究所)； 王玮(215006 苏州医学院附属第一医院，江苏省血液研究所)； 岑建农(215006 苏州医学院附属第一医院，江苏省血液研究所)； 陈子兴(215006 苏州医学院附属第一医院，江苏省血液研究所)
关键词：
江苏医药000423 端粒酶是一种核糖核蛋白酶，它以自身RNA为模板，将随机重复序列加到染色体末端，从而维持端粒的长度。在大部分组织中端粒酶受到抑制，故随着细胞的衰老可见端粒缩短现象。肿瘤细胞因端粒酶的激活而维持端粒长度，获得无限增殖的能力，因此端粒酶被视为一种肿瘤标记。端粒酶表达也见于正常人类生殖、造血、表皮及胃肠道粘膜基底干细胞等，以维持具有自我更新能力细胞的再生功能。1997～1998年我们用半定量法检测正常骨髓细胞的端粒酶活性，从而对正常骨髓的端粒酶表达范围和表达规律进行初步探讨。
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材料和方法
一、细胞株
5种髓系白血病细胞株包括KG1、K562、HL60、NB4及耐VCR的HL60细胞株。离心收集2×106个细胞，用PBS溶液洗涤两遍。
二、标本来源
20例骨髓标本来自苏州医学院附属第一医院门诊体检健康人员15名和特发性血小板减少性紫癜(ITP)患者5名，年龄2～57岁，女9名，男11名，骨髓以Ficoll-Hypaque密度离心法分离单个核细胞，计数。另取7～10个月大流产胎儿的骨髓5例，用去离子水洗涤多次，去除红细胞，计数。
三、实验方法(端粒酶PCR-ELISA法)
1.蛋白提取：端粒酶PCR-ELISA盒购自德国宝灵曼公司。取2×106个细胞，用PBS溶液洗涤两遍，加入200 μl蛋白提取液，置冰上30分钟，离心取175 μl上清至另管。
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2.PCR扩增：冰上，在PCR扩增管中加入25 μlPCR混合反应液(包含生物素标记的正向底物寡核苷酸引物pl-TS，反向引物p2，Taq多聚酶等)、2 μl蛋白提取液，加DEPC水使总体积为50 μl。PCR条件：(1)引物延长：25℃ 30分钟。(2)端粒酶灭活：94℃ 5分钟。(3)扩增条件：共30个循环，变性94℃ 30秒，褪火50℃ 30秒，多聚酶反应72℃ 90秒。
3.杂交和ELISA检测：取变性液20 μl和扩增产物5 μl于室温下培养。再加入杂交液225 μl(含地高辛标记的端粒序列特异性检测探针)，混合后加入微滴定板(MTP)每孔中，37℃中避光振荡2小时。倒掉杂交液，加入Anti-DIG-POD工作液在室温下避光振荡30分钟，然后倒掉，加入TMB底物溶液，在室温下避光振荡20分钟，加入反应终止液。用国产的酶联检测仪DG3022型进行测定，读取波长450及630的OD值。
4.结果判断：阳性对照：试剂盒备有人胚肾293细胞系的蛋白提取物作为阳性对照，其OD450减OD630的差值应大于1.5 U。阴性对照：将蛋白提取物于65℃培养10分钟或用RNA酶处理，其OD450与OD630的差值应小于0.2 U。标本的OD 450与OD 630的差值跟阴性对照相比较，其差值大于0.2 U则认为是阳性，反之则认为是阴性。每个标本重复两次以上实验，取其均值作为最后结果。
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结 果
一、白血病细胞株的端粒酶活性测定
细胞株KG-1、HL60、K562、NB4端粒酶表达范围0.92～1.00 U，且在传代过程中非常稳定。耐VCR的HL60细胞株与HL60细胞株端粒酶表达无明显差异(OD值平均0.92 U和0.96 U)。5种细胞株端粒酶的平均水平为0.96±0.02 U。
二、正常骨髓细胞端粒酶的表达
20例正常骨髓单个核细胞的端粒酶表达范围0～0.30 U，平均0.11±0.08 U，处于阴性范围。但2例ITP患者、1例正常人为阳性，证明正常骨髓细胞确实有端粒酶表达，只是表达的水平较低。
三、胎儿与成人骨髓细胞端粒酶活性的比较
由于胎儿骨髓含有较多的红细胞，且骨髓细胞数少，故未分离单个核细胞。胎儿骨髓端粒酶表达范围0.44～0.63 U，平均0.58 U，明显高于成人骨髓。
, 百拇医药
讨 论
国内外的实验结果，正常骨髓、生殖、皮肤基底细胞及胃肠道粘膜干细胞都具有端粒酶活性
，但表达规律仍然不明。我们应用的端粒酶PCR-ELISA法，对15例正常人、5例ITP患者进行半定量检测骨髓的端粒酶活性，平均0.11±0.08 U，处于阴性范围。5种白血病细胞株端粒酶活性平均0.9
6±0.02 U，与正常人差别较大，显示在正常骨髓细胞中端粒酶活性调控机理可能和恶性细胞中不同。
20例正常骨髓中只有3例为阳性(分别为0.30 U、0.26 U、0.25 U)。国外的研究提示正常骨髓中端粒酶的阳性表达可能主要来源于CD34+CD38+早期祖细胞和B、T淋巴细胞。原始的CD34+CD38-/low干细胞端粒酶活性极低，因其大部分处于G0期静止状态，当它进入增殖周期时伴随着端粒酶表达上调，而进入分化成熟阶段时伴随着端粒酶表达逐渐下调。成熟的粒细胞处于终末化阶段，不能增殖，端粒酶表达阴性。可见，端粒酶的活性调控伴随着整个造血过程。淋巴细胞受刺激原作用，增殖时端粒酶活性提高，而处于静止状态时端粒酶表达阴性。因此端粒酶表达又与淋巴细胞进行免疫应答、执行免疫功能有关。
国外研究还提示正常骨髓细胞的端粒酶水平随年龄增高而下降。我们观察的例数尚少，未能作出结论，但胎儿骨髓的端粒酶水平明显高于成人的结果符合国外研究，说明胎儿骨髓进入增殖和循环期的造血干细胞数量更多，具有比成人更高的再生及增殖潜能。端粒酶在正常骨髓细胞中的表达和调控机理仍未明确，如果要对正常骨髓细胞的端粒酶调控进行研究，必须还要改进实验方法，提高灵敏度。深入研究将使我们对正常造血和造血组织肿瘤生成的分子生物学机制在认识上取得突破。
基金项目：本课题受苏州医学院科研基金(E9705)和98江苏省333工程科研项目基金资助, 百拇医药