甲状腺癌p53基因外显子5～8序列分析
作者：杨志毅 顾其华 李玲芝 叶爱慧 舒畅
单位：杨志毅 顾其华 李玲芝 叶爱慧(湖南省怀化市第一人民医院 418000)；舒畅(湖南医科大学附属湘雅医院外科教研室)
关键词：癌；甲状腺，p53基因，直接测序
中国现代医学杂志000425目的：了解甲状腺癌与p53基因突变的关系。方法：用聚合酶链式反应-双链DNA直接测序方法对甲状腺癌标本进行p53基因外显子5，6，7，8序列分析，共检测甲状腺癌活检组织标本25例，石蜡包埋组织标本16例，正常人外周血标本31例。结果：正常人外周血标本未发现p53基因突变，43例甲状腺癌标本发现p53基因外显子8点突变11例，外显子7点突变2例，缺失3个bp1例。总阳性率达34.15%。其中位于外显子8上的第273位密码子突变7例，占突变的50%，最多见。结论：p53基因外显子7和8突变在甲状腺癌组织细胞中较常见，特异性好，提示p53基因外显子7，8测序对甲状腺癌的诊断有一定的参考价值。
, http://www.100md.com
分类号 R736.1
甲状腺癌是临床较常见的恶性肿瘤，有文献报道甲状腺癌细胞中K-ras基因突变较常见[1]，但国内对甲状腺癌与p53基因突变的关系研究尚少，作者对25例甲状腺癌活检组织，16例包埋组织进行p53基因5，6，7，8四个外显子测序分析，报道如下：
1，材料和方法
1.1，标本
25例活检标本，16例包埋组织标本均经病检确诊，对照组为31例正常人外周血标本。
1.2，材料
310型DNA测序仪、2400型PCR仪由美国PE公司产，末端标记测序试剂盒、序列胶等由美国PE公产，TaqDNA聚合酶由加拿大Sangon公司产，引物由上海生工公司合成，其他试剂采用国产分析纯试剂配制而成。
, 百拇医药
1.3，方法
引物序列为：5′GCAGTTCCTCTTCCTGCAGTACTC3′，5′AACCAGACCTCAGGCGGCTCATAG3′，5′TGTTGTCTCCTAGGTTGGCTCTGACTA3′，5′GTCCTGCTTGCTTACCTCGCTTAGTGC3′。
外周血标本用双蒸水溶血，离心取白细胞核沉淀；活检标本剪碎，玻璃棒匀浆；包埋切片用二甲苯脱蜡，无水乙醇去除二甲苯。经上述处理后再用含蛋白酶K、乙二胺四乙酸二钠的消化缓冲液于55 ，℃水浴中消化2 ，h，用苯酚-氯仿抽提法提取基因组DNA。取基因组DNA 1 ，μg，10×扩增缓冲液5 μL，15 mmol/L氯化镁5 μL，2 mmol/L单核苷酸5 μL，引物各25 pmol、ddHO适量、TaqDNA聚合酶5 U，配制50 μL反应体系。进行扩增，条件为：94 ℃预变性5 min，94 ℃变性30 s，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min，循环32次，最后72 ℃7 min充分延伸。扩增产物质量用普通琼脂糖凝胶电泳鉴定。紫外光下切下产物带，加热熔化法回收产物。再用四色荧光单道法对双链产物直接测序。
, 百拇医药
2 结果
对照组31例外周血标本均未发现突变；43例甲状腺癌发现外显子7上点突变2例，3个bp缺失1例，外显子8上点突变11例，共计突变、缺失14例，总阳性率达34.15%。其中位于外显子8上的第273位密码子点突变7例，占总突变的50%，其他分散位点占50%。见附表。
附表 43例甲状腺癌p53基因突变情况 密码子序号
野生型(wt)
突变型(Mut)
氨基酸(AA)
例数
237
ATG
, 百拇医药
ATT
Met→Ile
1
258
GAA
GTA
Glu→Val
1
257～258
CTG，GAA
CAA
缺TGG
1
, 百拇医药
273
CGT
CAT
Arg→His
7
285
GAG
GGG
Glu→Gly
3
294
GAG
AAG
, 百拇医药
Glu→Lys
1
3 讨论
p53基因位于人17号染色体短臂1区3带上[2]，有11个外显子和10个内含子[3]，是一个抑癌基因，通常情况下有抑制肿瘤发生的作用[4]，突变后的p53基因则失去了肿瘤抑制基因功能，但具有癌基因作用。据报道，p53基因突变与人类的多种肿瘤的发生及预后密切相关，突变多位于5，6，7，8四个外显子上[5]。国外关于p53基因突变与肿瘤的关系有较多的报道，国内的报道以研究肺癌最多见[6，7]，胃癌[8]、大肠癌等次之[9]，研究甲状腺癌与p53基因突变的关系者少见。
作者对43例甲状腺癌标本进行p53基因5～8外显子测序分析，发现外显子7点突变2例，3个bp缺失1例，外显子8点突变11例，外显子5，6则未发现突变，突变、缺失总阳性率达34.15%。其中外显子8上第273位密码子突变达7例，占总突变的50%，最多见，这与国外的一般文献报道的类似[2，5]。由于p53基因外显子7和外显子8突变在甲状腺癌标本中阳性率达34.15%，对照组未发现突变，提示用检测突变的方法诊断甲状腺癌特异性好，有一定的诊断价值。除固定位点第273位密码子突变外，其他位点突变亦占50%左右，提示测序法是最精确可靠的方法。
, 百拇医药
参 考 文 献
1，Sjoerd R.Ras and human tumor.Cancer Biol,1992;3:241
2，Donehower LA,Bradlly A.The tumor suppression p53.Biochem Biophys Acta,1993;1155(2):192
3，Buchman VL,Chumakov PM,Ninkina NN, et al.A variation in the structure of the protein-coding region of the human p53 gene.Gene,1988;70:245
4，Lane DP.p53 guardian of genome.Nature,1992;358(6381):15
, http://www.100md.com
5，Hartman A,Blaszyk H,Macgovern RM, et al.p53 gene mutations inside and outside of exon 5-8:the patterns differ in breast and other cancer.Oncogene,1995;10(6):681
6，杜，昀.肺癌p53突变的研究进展.国外医学呼吸系统分册，1995；15(4)：173
7，张，波，崔，文，高英堂，等.高转移性人肺癌细胞系p53基因突变的研究.中华肿瘤杂志，1995；17(4)：278
8，徐文怀，杨定成，万远廉,等.大肠癌的p53基因点突变.中华肿瘤杂志，1995；17(5)：328
9，张青云，吕有勇，李，诤，等.人胃癌细胞系中p53抑癌基因变异的检测及其序列分析.生物化学杂志，1995；11(3)：311, 百拇医药
单位：杨志毅 顾其华 李玲芝 叶爱慧(湖南省怀化市第一人民医院 418000)；舒畅(湖南医科大学附属湘雅医院外科教研室)
关键词：癌；甲状腺，p53基因，直接测序
中国现代医学杂志000425目的：了解甲状腺癌与p53基因突变的关系。方法：用聚合酶链式反应-双链DNA直接测序方法对甲状腺癌标本进行p53基因外显子5，6，7，8序列分析，共检测甲状腺癌活检组织标本25例，石蜡包埋组织标本16例，正常人外周血标本31例。结果：正常人外周血标本未发现p53基因突变，43例甲状腺癌标本发现p53基因外显子8点突变11例，外显子7点突变2例，缺失3个bp1例。总阳性率达34.15%。其中位于外显子8上的第273位密码子突变7例，占突变的50%，最多见。结论：p53基因外显子7和8突变在甲状腺癌组织细胞中较常见，特异性好，提示p53基因外显子7，8测序对甲状腺癌的诊断有一定的参考价值。
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分类号 R736.1
甲状腺癌是临床较常见的恶性肿瘤，有文献报道甲状腺癌细胞中K-ras基因突变较常见[1]，但国内对甲状腺癌与p53基因突变的关系研究尚少，作者对25例甲状腺癌活检组织，16例包埋组织进行p53基因5，6，7，8四个外显子测序分析，报道如下：
1，材料和方法
1.1，标本
25例活检标本，16例包埋组织标本均经病检确诊，对照组为31例正常人外周血标本。
1.2，材料
310型DNA测序仪、2400型PCR仪由美国PE公司产，末端标记测序试剂盒、序列胶等由美国PE公产，TaqDNA聚合酶由加拿大Sangon公司产，引物由上海生工公司合成，其他试剂采用国产分析纯试剂配制而成。
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1.3，方法
引物序列为：5′GCAGTTCCTCTTCCTGCAGTACTC3′，5′AACCAGACCTCAGGCGGCTCATAG3′，5′TGTTGTCTCCTAGGTTGGCTCTGACTA3′，5′GTCCTGCTTGCTTACCTCGCTTAGTGC3′。
外周血标本用双蒸水溶血，离心取白细胞核沉淀；活检标本剪碎，玻璃棒匀浆；包埋切片用二甲苯脱蜡，无水乙醇去除二甲苯。经上述处理后再用含蛋白酶K、乙二胺四乙酸二钠的消化缓冲液于55 ，℃水浴中消化2 ，h，用苯酚-氯仿抽提法提取基因组DNA。取基因组DNA 1 ，μg，10×扩增缓冲液5 μL，15 mmol/L氯化镁5 μL，2 mmol/L单核苷酸5 μL，引物各25 pmol、ddHO适量、TaqDNA聚合酶5 U，配制50 μL反应体系。进行扩增，条件为：94 ℃预变性5 min，94 ℃变性30 s，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min，循环32次，最后72 ℃7 min充分延伸。扩增产物质量用普通琼脂糖凝胶电泳鉴定。紫外光下切下产物带，加热熔化法回收产物。再用四色荧光单道法对双链产物直接测序。
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2 结果
对照组31例外周血标本均未发现突变；43例甲状腺癌发现外显子7上点突变2例，3个bp缺失1例，外显子8上点突变11例，共计突变、缺失14例，总阳性率达34.15%。其中位于外显子8上的第273位密码子点突变7例，占总突变的50%，其他分散位点占50%。见附表。
附表 43例甲状腺癌p53基因突变情况 密码子序号
野生型(wt)
突变型(Mut)
氨基酸(AA)
例数
237
ATG
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ATT
Met→Ile
1
258
GAA
GTA
Glu→Val
1
257～258
CTG，GAA
CAA
缺TGG
1
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273
CGT
CAT
Arg→His
7
285
GAG
GGG
Glu→Gly
3
294
GAG
AAG
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Glu→Lys
1
3 讨论
p53基因位于人17号染色体短臂1区3带上[2]，有11个外显子和10个内含子[3]，是一个抑癌基因，通常情况下有抑制肿瘤发生的作用[4]，突变后的p53基因则失去了肿瘤抑制基因功能，但具有癌基因作用。据报道，p53基因突变与人类的多种肿瘤的发生及预后密切相关，突变多位于5，6，7，8四个外显子上[5]。国外关于p53基因突变与肿瘤的关系有较多的报道，国内的报道以研究肺癌最多见[6，7]，胃癌[8]、大肠癌等次之[9]，研究甲状腺癌与p53基因突变的关系者少见。
作者对43例甲状腺癌标本进行p53基因5～8外显子测序分析，发现外显子7点突变2例，3个bp缺失1例，外显子8点突变11例，外显子5，6则未发现突变，突变、缺失总阳性率达34.15%。其中外显子8上第273位密码子突变达7例，占总突变的50%，最多见，这与国外的一般文献报道的类似[2，5]。由于p53基因外显子7和外显子8突变在甲状腺癌标本中阳性率达34.15%，对照组未发现突变，提示用检测突变的方法诊断甲状腺癌特异性好，有一定的诊断价值。除固定位点第273位密码子突变外，其他位点突变亦占50%左右，提示测序法是最精确可靠的方法。
, 百拇医药
参 考 文 献
1，Sjoerd R.Ras and human tumor.Cancer Biol,1992;3:241
2，Donehower LA,Bradlly A.The tumor suppression p53.Biochem Biophys Acta,1993;1155(2):192
3，Buchman VL,Chumakov PM,Ninkina NN, et al.A variation in the structure of the protein-coding region of the human p53 gene.Gene,1988;70:245
4，Lane DP.p53 guardian of genome.Nature,1992;358(6381):15
, http://www.100md.com
5，Hartman A,Blaszyk H,Macgovern RM, et al.p53 gene mutations inside and outside of exon 5-8:the patterns differ in breast and other cancer.Oncogene,1995;10(6):681
6，杜，昀.肺癌p53突变的研究进展.国外医学呼吸系统分册，1995；15(4)：173
7，张，波，崔，文，高英堂，等.高转移性人肺癌细胞系p53基因突变的研究.中华肿瘤杂志，1995；17(4)：278
8，徐文怀，杨定成，万远廉,等.大肠癌的p53基因点突变.中华肿瘤杂志，1995；17(5)：328
9，张青云，吕有勇，李，诤，等.人胃癌细胞系中p53抑癌基因变异的检测及其序列分析.生物化学杂志，1995；11(3)：311, 百拇医药