同种异体肌腱移植的免疫学实验研究
作者：王锡阳 李康华
单位：湖南医科大学附属湘雅医院骨科 410008
关键词：同种异体移植；冷冻干燥；肌腱
中国现代医学杂志000422目的：比较几种肌腱移植材料的免疫学特点。方法：采用淋巴细胞毒试验、淋巴细胞转化试验及吞噬细胞功能试验测定多项细胞免疫学指标。结果：深低温冷冻、深低温冷冻干燥同种异体体肌腱的淋巴细胞死亡率、转化率和吞噬细胞率均低于未经处理的同种异体肌腱(P<0.05)，而与自体肌腱无显著性差异(P>0.05)。结论：深低温冷冻干燥或不干燥同种异体肌腱的免疫学特点与自体肌腱基本相同，可广泛用于临床。
分类号 R622
在手部损伤中，肌腱损伤约占30%，肌腱缺损需行肌腱移植者占25%。同种异体肌腱移植自50年代已开始研究，但是，由于免疫排斥反应未能解决，使得本项研究工作没有突破性进展。深低温冷冻与深低温冷冻干燥处理均能降低异体肌腱移植的抗原性，减轻免疫排斥反应，可取得与自体肌腱相近的结果，然而，在免疫学检测等方面缺乏系统研究。为此，本研究采用多项免疫检测指标对同种异体肌腱移植进行实验研究，试图深入了解深低温冷冻与深低温冷冻干燥同种异体肌腱移植的效果，为临床应用提供更有力的依据。
, 百拇医药
1 材料与方法
1.1 实验方法
1.1.1 实验动物与分组
选用成熟豚鼠60只体重350～700 g，平均436 g。随机分为6组(A1、A2、、B、C、D、E)，每组10只。A1、A2组合为A组。共20只，为提供肌腱组， 其中A1组为深低温冷冻肌腱提供组，A2组为深低温冷冻干燥肌腱提供组；B组为深低温冷冻移植组；C组为深低温冷冻干燥移植组；D组为未经处理的肌腱移植组；E组为自体肌腱移植组。
1.1.2 移植分组
将A1组深低温冷冻处理的跟腱20条分别经16～20 ℃林格氏液浸泡10～15 min后，移植于B组动物的左右后肢；将A2组深低温冷冻干燥处理的跟腱20条分别经林氏液浸泡1 h后，移植于C组动物的左右后肢；将D组动物随机两两配对，然后将甲动物左右新鲜跟腱移植于乙动物左右后肢，乙动物左右新鲜跟腱移植于甲动物左右后肢；将E组动物左右后肢新鲜跟腱自体交换移植。
, 百拇医药
1.1.3 同种异体肌腱的处理
深低温冷冻处理：切取A1组动物全长跟腱，用生理盐水冲洗，放入1640细胞营养液中浸泡30 min后取出置入容器内密封，然后置入-73 ℃冷冻冰箱内冷冻7 d备用。
深低温冷冻干燥处理:A2组跟腱按上述方法处理后，再用冷冻干燥机在真空状态下-45 ℃，10个大气压条件下，干燥20 min后备用。
1.1.4 手术方法
3%戊巴比妥钠腹腔麻醉，俯卧位皮肤脱毛消毒，作后肢直切口。取腱长度均为2 cm，移植腱用0/5无创尼龙线“8”字缝合，并于两侧加固缝合2针。术后肢体不制动，按组编号分笼同条件喂养。
1.2 肌腱移植3周后免疫水平测定
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采用淋巴细胞毒试验、吞噬细胞功能试验、淋巴细胞转化试验分别测定各组的淋巴细胞死亡率，吞噬细胞吞噬率和淋巴细胞转化率。
1.3 统计方法
所得数据行方差分析(F检验)，有差异存在即行两两比较，P<0.05认为有统计学意义。
2 结果
本实验共用豚鼠60只，麻醉死亡2只，术后不明原因死亡10只，其是A组4只，B组3只，C组1，D组1只，E组2只。移植64条肌腱 ，128个吻合口，均未见吻合口断裂，见附表。
附表 免疫学测试结果(
±s)
淋巴细胞毒作用
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(%)
淋巴细胞转化
(%)
吞噬细胞功能
(%)
B组(n=14)
34.0±5.50
43.7±13.50
23.2±9.70
C组(n=18)
27.1±4.90
67.0±18.70
, 百拇医药
21.8±7.44
D组(n=16)
75.8±11.10
124.3±15.90
37.3±20.90
E组(n=16)
23.8±10.90
393.3±17.70
13.2±5.50
三种实验方法均示D组(未处理组)与B、C、E组的差异有显著性(P<0.05)，余两两比较结果差异无统计学意义(P>0.05)。
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3 讨论
对肌腱缺损的修复，传统的方法是自体肌腱移植，需切取手部或足部的肌腱。存在取材有限，影响取材部位的功能等缺点。50年代以来开展了同种异体肌腱移植的研究，为降低肌腱的抗原性，先后采用三氯甲烷浸泡、乙烯氧培养、脱氧鸟苷培养、γ射线照射等方法，但都存在处理复杂，不易贮存、对肌腱有损害等缺点，难于推广应用。后来发现深低温冷冻或冷冻干燥保存可明显降低贮存肌腱的抗原性，减轻排斥反应，在此基础上Peer于1955年首先创设了同种异体肌腱库。90年代早期，我国学者对同种异体肌腱采用冷冻或冷冻干燥处理进行移植的实验研究，取得与自体肌腱移植基本相似的结果。在免疫学方面，以往的研究只作了淋巴细胞毒实验，该实验仅反映免疫排斥反应的一个方面，实际上只反映了体液免疫方面，而移植后细胞免疫是排斥反应的另一个重要方面。淋巴细胞转化、吞噬细胞功能是反映细胞免疫反应的两个重要指标。故本研究设计多指标免学联合检测，并与自体肌腱移植、未处理的同种异体肌腱 移植进行比较，以期进一步证实上述异体肌腱移植方法的可行性。
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异体肌腱移植成功的关键是移植物植入后免疫排斥反应的强弱。异体移植中引起免疫排斥反应的成份很多，其中主要是组织相容性抗原(细胞表面的人类白细胞抗原)，这些抗原在母体中表现很弱的抗原性，而经移植后则表现出明显的抗原性，从而诱发极强的免疫排斥反应。这些抗原需要抗原呈递细胞(Antigen Pressenting Cell APC)—通常是抗原阳性的巨噬细胞、树突状细胞、过路白细胞的辅佐，才能启动宿主对移植物产生排斥应，而移植物所载的APC是触发排斥反应的首要因素，Minami 等采用补体依赖性细胞毒性试验，证实了肌腱组织抗原性不在胶原纤维，而在其细胞成份，而且经采用冷冻，冷冻干燥及化学处理等方法破坏肌腱中细胞成份，从而降低其抗原性。本实验结果在淋巴细胞毒试验、淋巴细胞转化实验及吞噬细胞功能实验三方面均与自体肌腱移植无差异，并显著优于未经处理的异体肌腱，更深一步地为临床应用的安全性提供了依据。
通过多指标的免疫学检测，我们发现经深低温冷冻处理后无论干燥或不干燥处理，均能较好降低其组织的抗原性，减轻排斥反应，且各方面的性质与自体肌腱移植无明显差异，这与以往的实验研究结果相一致。经深低温冷冻后再行干燥处理有使用方便，易保存等优点，但干燥处理过程复杂耗价大。当然两者的临床效果是否存在差异，特别是远期疗效的差异目前尚无法判定。
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参 考 文 献
1，张友东.冷冻干燥异体肌腱移植的实验研究与临床应用.中华骨科杂志，1997；17(1)：5962
2，Liland Rmet al.A history of tendon operations.The Surgeon's Library,1989；168:183～189
3，Zimmerman MC,et al.Tje biomechanics and histopathology of chemically processed patellar tendon allografts of anterior cruciate ligament replacement.Am J Sports Med,1994；23(3):378～386
4，Kerboull JL,et al.The in Vitro effects of various preservation methods on mechanical properties of allografts of the role of various preservation methods on mechanical properties of allografts of the patellar tendon.Chirurgie,1991;117(9):751～762
, 百拇医药
5，Inkowski JL,et al.Immune response to nonspecific and altered tissue antigens in self Tissue allografts. Clin Orthop, 1996:(326):80～85
6，MinAMI A,et al.The in Vitro effects of various immunoreactivetreatments on allogeneic tendon grafts.J Hand Surg,1983；8A:888～893
7，Rodrigo JJ,et al.The immume response to freeze-dried bone-tendonbone ACL allografts in humans. Am Knee Surg, 1993；6:1～7
收稿1999-08-07, http://www.100md.com
单位：湖南医科大学附属湘雅医院骨科 410008
关键词：同种异体移植；冷冻干燥；肌腱
中国现代医学杂志000422目的：比较几种肌腱移植材料的免疫学特点。方法：采用淋巴细胞毒试验、淋巴细胞转化试验及吞噬细胞功能试验测定多项细胞免疫学指标。结果：深低温冷冻、深低温冷冻干燥同种异体体肌腱的淋巴细胞死亡率、转化率和吞噬细胞率均低于未经处理的同种异体肌腱(P<0.05)，而与自体肌腱无显著性差异(P>0.05)。结论：深低温冷冻干燥或不干燥同种异体肌腱的免疫学特点与自体肌腱基本相同，可广泛用于临床。
分类号 R622
在手部损伤中，肌腱损伤约占30%，肌腱缺损需行肌腱移植者占25%。同种异体肌腱移植自50年代已开始研究，但是，由于免疫排斥反应未能解决，使得本项研究工作没有突破性进展。深低温冷冻与深低温冷冻干燥处理均能降低异体肌腱移植的抗原性，减轻免疫排斥反应，可取得与自体肌腱相近的结果，然而，在免疫学检测等方面缺乏系统研究。为此，本研究采用多项免疫检测指标对同种异体肌腱移植进行实验研究，试图深入了解深低温冷冻与深低温冷冻干燥同种异体肌腱移植的效果，为临床应用提供更有力的依据。
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1 材料与方法
1.1 实验方法
1.1.1 实验动物与分组
选用成熟豚鼠60只体重350～700 g，平均436 g。随机分为6组(A1、A2、、B、C、D、E)，每组10只。A1、A2组合为A组。共20只，为提供肌腱组， 其中A1组为深低温冷冻肌腱提供组，A2组为深低温冷冻干燥肌腱提供组；B组为深低温冷冻移植组；C组为深低温冷冻干燥移植组；D组为未经处理的肌腱移植组；E组为自体肌腱移植组。
1.1.2 移植分组
将A1组深低温冷冻处理的跟腱20条分别经16～20 ℃林格氏液浸泡10～15 min后，移植于B组动物的左右后肢；将A2组深低温冷冻干燥处理的跟腱20条分别经林氏液浸泡1 h后，移植于C组动物的左右后肢；将D组动物随机两两配对，然后将甲动物左右新鲜跟腱移植于乙动物左右后肢，乙动物左右新鲜跟腱移植于甲动物左右后肢；将E组动物左右后肢新鲜跟腱自体交换移植。
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1.1.3 同种异体肌腱的处理
深低温冷冻处理：切取A1组动物全长跟腱，用生理盐水冲洗，放入1640细胞营养液中浸泡30 min后取出置入容器内密封，然后置入-73 ℃冷冻冰箱内冷冻7 d备用。
深低温冷冻干燥处理:A2组跟腱按上述方法处理后，再用冷冻干燥机在真空状态下-45 ℃，10个大气压条件下，干燥20 min后备用。
1.1.4 手术方法
3%戊巴比妥钠腹腔麻醉，俯卧位皮肤脱毛消毒，作后肢直切口。取腱长度均为2 cm，移植腱用0/5无创尼龙线“8”字缝合，并于两侧加固缝合2针。术后肢体不制动，按组编号分笼同条件喂养。
1.2 肌腱移植3周后免疫水平测定
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采用淋巴细胞毒试验、吞噬细胞功能试验、淋巴细胞转化试验分别测定各组的淋巴细胞死亡率，吞噬细胞吞噬率和淋巴细胞转化率。
1.3 统计方法
所得数据行方差分析(F检验)，有差异存在即行两两比较，P<0.05认为有统计学意义。
2 结果
本实验共用豚鼠60只，麻醉死亡2只，术后不明原因死亡10只，其是A组4只，B组3只，C组1，D组1只，E组2只。移植64条肌腱 ，128个吻合口，均未见吻合口断裂，见附表。
附表 免疫学测试结果(
±s)淋巴细胞毒作用
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(%)
淋巴细胞转化
(%)
吞噬细胞功能
(%)
B组(n=14)
34.0±5.50
43.7±13.50
23.2±9.70
C组(n=18)
27.1±4.90
67.0±18.70
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21.8±7.44
D组(n=16)
75.8±11.10
124.3±15.90
37.3±20.90
E组(n=16)
23.8±10.90
393.3±17.70
13.2±5.50
三种实验方法均示D组(未处理组)与B、C、E组的差异有显著性(P<0.05)，余两两比较结果差异无统计学意义(P>0.05)。
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3 讨论
对肌腱缺损的修复，传统的方法是自体肌腱移植，需切取手部或足部的肌腱。存在取材有限，影响取材部位的功能等缺点。50年代以来开展了同种异体肌腱移植的研究，为降低肌腱的抗原性，先后采用三氯甲烷浸泡、乙烯氧培养、脱氧鸟苷培养、γ射线照射等方法，但都存在处理复杂，不易贮存、对肌腱有损害等缺点，难于推广应用。后来发现深低温冷冻或冷冻干燥保存可明显降低贮存肌腱的抗原性，减轻排斥反应，在此基础上Peer于1955年首先创设了同种异体肌腱库。90年代早期，我国学者对同种异体肌腱采用冷冻或冷冻干燥处理进行移植的实验研究，取得与自体肌腱移植基本相似的结果。在免疫学方面，以往的研究只作了淋巴细胞毒实验，该实验仅反映免疫排斥反应的一个方面，实际上只反映了体液免疫方面，而移植后细胞免疫是排斥反应的另一个重要方面。淋巴细胞转化、吞噬细胞功能是反映细胞免疫反应的两个重要指标。故本研究设计多指标免学联合检测，并与自体肌腱移植、未处理的同种异体肌腱 移植进行比较，以期进一步证实上述异体肌腱移植方法的可行性。
, http://www.100md.com
异体肌腱移植成功的关键是移植物植入后免疫排斥反应的强弱。异体移植中引起免疫排斥反应的成份很多，其中主要是组织相容性抗原(细胞表面的人类白细胞抗原)，这些抗原在母体中表现很弱的抗原性，而经移植后则表现出明显的抗原性，从而诱发极强的免疫排斥反应。这些抗原需要抗原呈递细胞(Antigen Pressenting Cell APC)—通常是抗原阳性的巨噬细胞、树突状细胞、过路白细胞的辅佐，才能启动宿主对移植物产生排斥应，而移植物所载的APC是触发排斥反应的首要因素，Minami 等采用补体依赖性细胞毒性试验，证实了肌腱组织抗原性不在胶原纤维，而在其细胞成份，而且经采用冷冻，冷冻干燥及化学处理等方法破坏肌腱中细胞成份，从而降低其抗原性。本实验结果在淋巴细胞毒试验、淋巴细胞转化实验及吞噬细胞功能实验三方面均与自体肌腱移植无差异，并显著优于未经处理的异体肌腱，更深一步地为临床应用的安全性提供了依据。
通过多指标的免疫学检测，我们发现经深低温冷冻处理后无论干燥或不干燥处理，均能较好降低其组织的抗原性，减轻排斥反应，且各方面的性质与自体肌腱移植无明显差异，这与以往的实验研究结果相一致。经深低温冷冻后再行干燥处理有使用方便，易保存等优点，但干燥处理过程复杂耗价大。当然两者的临床效果是否存在差异，特别是远期疗效的差异目前尚无法判定。
, http://www.100md.com
参 考 文 献
1，张友东.冷冻干燥异体肌腱移植的实验研究与临床应用.中华骨科杂志，1997；17(1)：5962
2，Liland Rmet al.A history of tendon operations.The Surgeon's Library,1989；168:183～189
3，Zimmerman MC,et al.Tje biomechanics and histopathology of chemically processed patellar tendon allografts of anterior cruciate ligament replacement.Am J Sports Med,1994；23(3):378～386
4，Kerboull JL,et al.The in Vitro effects of various preservation methods on mechanical properties of allografts of the role of various preservation methods on mechanical properties of allografts of the patellar tendon.Chirurgie,1991;117(9):751～762
, 百拇医药
5，Inkowski JL,et al.Immune response to nonspecific and altered tissue antigens in self Tissue allografts. Clin Orthop, 1996:(326):80～85
6，MinAMI A,et al.The in Vitro effects of various immunoreactivetreatments on allogeneic tendon grafts.J Hand Surg,1983；8A:888～893
7，Rodrigo JJ,et al.The immume response to freeze-dried bone-tendonbone ACL allografts in humans. Am Knee Surg, 1993；6:1～7
收稿1999-08-07, http://www.100md.com